航天搭載對(duì)辣椒SP1代的誘變效應(yīng)

郭長(zhǎng)虹，于 瑛，王德慧，馬 軍，郭亞華，耿月偉

(1.哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江省分子細(xì)胞遺傳與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150025，kaku2008@hotmail.com;2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝分院，哈爾濱150069)

航天誘變育種是利用返回式衛(wèi)星等到達(dá)的航天環(huán)境對(duì)植物(種子)誘變產(chǎn)生有益的變異，經(jīng)地面選育新種質(zhì)、新材料，培育新品種的高新技術(shù)育種途徑和方法［1］.航天誘變技術(shù)在有效創(chuàng)造特異突變基因資源和培育作物新品種方面已經(jīng)顯示出重要的作用，成為空間生命科學(xué)研究的重要組成部分［2］.在作物航天誘變育種工作中，對(duì)不同作物的不同品種進(jìn)行誘變后的細(xì)胞學(xué)效應(yīng)研究，將有利于材料的選擇、誘變效果的提高［3］.中國(guó)在航天誘變育種方面取得了舉世公認(rèn)的顯著成就.據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，截至2007年，我國(guó)已在45種植物上誘變育成741個(gè)突變品種［4］.經(jīng)多年地面種植篩選，先后育成60多個(gè)農(nóng)作物優(yōu)異新種質(zhì)、新品系并進(jìn)入省級(jí)以上品種區(qū)域試驗(yàn)，其中已通過(guò)國(guó)家或省級(jí)審定的新品種或新組合30個(gè)［5］.

本研究對(duì)經(jīng)航天搭載的辣椒SP1代種子根尖細(xì)胞進(jìn)行了觀察，研究辣椒根尖細(xì)胞有絲分裂指數(shù)、染色體畸變率指標(biāo)的變化規(guī)律，探討航天誘變辣椒根尖細(xì)胞的遺傳學(xué)效應(yīng)，為植物航天誘變育種機(jī)制和辣椒航天誘變育種提供理論參考.

1 材料和方法

1.1 材料

航天搭載的種子由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝分院提供，包括III-17 SP1，III-18 SP1種子，以及地面對(duì)照種子.供試材料由首顆航天育種衛(wèi)星“實(shí)踐八號(hào)”搭載［6］，衛(wèi)星在近地點(diǎn)為187 km、遠(yuǎn)地點(diǎn)為463 km的軌道上運(yùn)行了355 h(約15 d)，航程約9×106km.

1.2 方法

1.2.1 材料制備

將經(jīng)航天搭載和地面對(duì)照的種子，先用52℃溫水浸泡，冷卻至室溫浸泡24 h，將種子用紗布輕輕搓洗，再用52℃溫水浸泡，冷卻至室溫浸泡24 h后輕輕搓洗，放入鋪有雙層潮濕濾紙的培養(yǎng)皿中.置28℃恒溫條件下萌發(fā).每天用溫水洗滌一次，以利發(fā)芽.待根長(zhǎng)到1～2 cm左右時(shí)取材，將根尖轉(zhuǎn)移到卡諾氏固定液(乙醇與乙酸體積比為3∶1)中固定24 h，蒸餾水沖洗后轉(zhuǎn)入70%(體積分?jǐn)?shù))酒精中，在4℃冰箱中保存.采用壓片法制片，取出已固定根尖，蒸餾水沖洗3次，用1 mol/L HCl于60℃解離7～8 min，取出后用蒸餾水沖洗幾遍，希夫試劑染色，壓片鏡檢.

1.2.2 細(xì)胞學(xué)觀察

每個(gè)材料(包括對(duì)照)觀察10個(gè)根尖，分別統(tǒng)計(jì)細(xì)胞有絲分裂指數(shù)、染色體畸變率、微核率.有絲分裂指數(shù)是指一定分裂組織或細(xì)胞群中處于有絲分裂分裂期的細(xì)胞數(shù)占其總細(xì)胞數(shù)的百分?jǐn)?shù)，它是表示細(xì)胞繁殖活動(dòng)程度的指數(shù)，統(tǒng)計(jì)約6 000個(gè)細(xì)胞.染色體畸變率統(tǒng)計(jì)選用分散良好、清晰可見的分裂期細(xì)胞約6 000個(gè)，統(tǒng)計(jì)具有染色體畸變(如染色體片斷、染色體橋等現(xiàn)象)的分裂相細(xì)胞數(shù).微核的著色與主核相當(dāng)或稍淺一些，其形態(tài)為圓形或橢圓形，大小在主核 1/3以下［7］，觀察約8 000個(gè)間期細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)含微核的細(xì)胞數(shù).細(xì)胞有絲分裂指數(shù)、染色體畸變率、微核率的計(jì)算公式如下［8］:

1.3 數(shù)據(jù)分析

在OLYMPUS顯微鏡下采用Leica DFC280數(shù)碼顯微攝像系統(tǒng)對(duì)微核細(xì)胞和分裂期具有畸變的細(xì)胞進(jìn)行拍照，采用Excel 2007軟件繪制直方圖.運(yùn)用軟件 SPSS 16.0 for Windows(One-Way ANOVA)進(jìn)行差異顯著性分析［9］.

2 結(jié)果與分析

2.1 航天誘變對(duì)辣椒根尖細(xì)胞有絲分裂指數(shù)的影響

辣椒根尖細(xì)胞的有絲分裂指數(shù)測(cè)定結(jié)果如圖1所示.經(jīng)過(guò)航天搭載后，III-17 SP1、III-18、III-31等3個(gè)辣椒品種的有絲分裂指數(shù)分別從3.01%、3.35%、5.49%升高至 7.23%、6.00%、8.29%，達(dá)到極顯著水平.這表明航天誘變?cè)黾恿诉@3個(gè)辣椒品種的細(xì)胞活性，明顯促進(jìn)了種子根尖的細(xì)胞有絲分裂.

圖1 航天誘變對(duì)辣椒根尖細(xì)胞有絲分裂指數(shù)的影響

2.2 航天誘變對(duì)辣椒根尖細(xì)胞染色體畸變率的影響

航天誘變對(duì)辣椒根尖細(xì)胞染色體畸變率的影響見圖2.經(jīng)過(guò)航天誘變后的辣椒品種空間搭載第1代根尖細(xì)胞染色體中出現(xiàn)了染色體斷片、染色體橋、落后染色體以及多極分裂等畸變，其中染色體斷片和染色體橋是主要的畸變類型.還看到了染色體雙橋和多橋等現(xiàn)象.測(cè)定結(jié)果顯示出3個(gè)航天搭載材料的染色體畸變率與對(duì)照組相比均大幅度提高，達(dá)到顯著差異水平(P＜0.05).

圖2 航天誘變對(duì)辣椒根尖細(xì)胞染色體畸變的影響

2.3 航天誘變對(duì)辣椒根尖細(xì)胞微核率的影響

對(duì)辣椒根尖細(xì)胞的微核千分率進(jìn)行了測(cè)定(圖3).結(jié)果表明，地面對(duì)照辣椒品系的根尖細(xì)胞中幾乎看不到微核，而經(jīng)航天搭載后，3個(gè)辣椒品系的的根尖細(xì)胞中均有微核出現(xiàn).其中品系III-17的微核率最高，III-31次之，III-18最低.

圖3 航天誘變對(duì)辣椒根尖細(xì)胞微核的影響

3 討論

植物種子經(jīng)空間飛行后，其幼苗根尖細(xì)胞分裂會(huì)受到不同程度的抑制［10］或促進(jìn)［5，11］.在本試驗(yàn)中，3個(gè)航天搭載后的辣椒SP1種子根尖細(xì)胞的有絲分裂指數(shù)明顯增加，細(xì)胞分裂活躍程度明顯提高.表明空間環(huán)境促進(jìn)了辣椒根尖的有絲分裂.在對(duì)照材料的有絲分裂間期細(xì)胞中微核出現(xiàn)的頻率很低，但在航天搭載的材料中均觀察到了一定頻率的微核.微核的產(chǎn)生可能是空間環(huán)境中的某些因子促進(jìn)染色體斷裂或降低生物自身的修復(fù)功能，阻礙染色體斷片的愈合，染色體斷片由于缺少著絲點(diǎn)，不能隨細(xì)胞分裂移到細(xì)胞兩極而停留在細(xì)胞質(zhì)中，經(jīng)過(guò)一個(gè)細(xì)胞周期形成新的細(xì)胞核時(shí)，染色體斷片在細(xì)胞質(zhì)中凝縮形成的;也可能由于空間環(huán)境的作用引起異常分裂、染色體滯后或分組從而由單染色體或幾條染色體凝縮而形成的.在有絲分裂中期觀察到了染色體斷片，在后期觀察到染色體橋和多極分裂等畸變，說(shuō)明空間環(huán)境可以導(dǎo)致染色體斷裂，形成染色體斷片.具有著絲點(diǎn)的兩條染色單體的斷裂端也常常融合，在分裂的后期，著絲點(diǎn)被牽引移向兩極，而相連的染色體絲會(huì)形成染色體橋，染色體橋可以持續(xù)到末期，隨細(xì)胞分裂也可能形成新的斷片.

本研究結(jié)果從一定程度上為植物航天誘變育種機(jī)制和辣椒航天誘變的研究提供初步的理論參考，但是這種細(xì)胞學(xué)的畸變與農(nóng)藝性狀及分子水平上的變異還需要進(jìn)行更多的研究和探索，還需要對(duì)誘變后代材料做進(jìn)一步的分析.

4 結(jié)論

1)空間環(huán)境有助于提高辣椒SP1代根尖細(xì)胞有絲分裂指數(shù)，促進(jìn)辣椒SP1代根尖細(xì)胞的有絲分裂.航天誘變可以增加辣椒SP1代根尖細(xì)胞的細(xì)胞活性.

2)空間環(huán)境可以誘導(dǎo)辣椒SP1代根尖細(xì)胞產(chǎn)生較高頻率的微核和染色體斷片、染色體橋、多極分裂等染色體畸變.航天誘變技術(shù)可以誘導(dǎo)產(chǎn)生變異，是創(chuàng)造辣椒突變基因資源的一種有效手段.

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