日本腦炎病毒囊膜蛋白的基因原核表達(dá)及抗原性分析

張 寧,金洪濤,夏志平*,張瑞巖,劉 雯,李 勇,薛慧亮,李 丹,丁 壯*

(1.吉林大學(xué)動物科技學(xué)院,吉林長春130062;2.解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所,吉林長春130062)

日本腦炎(Japanese encephalitis,JE)是由日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus JEV)引起的一種嚴(yán)重的人畜共患蟲媒病毒性疾病,是人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的蟲媒病之一[1]。JEV可引起妊娠母豬發(fā)生流產(chǎn)和死胎,公豬表現(xiàn)為睪丸炎,育肥豬持續(xù)高熱,新生仔豬腦炎[2]。本病不但對養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,而且在世界許多國家廣泛存在。在中國,JEV分布于除新疆維吾爾自治區(qū)、青海、西藏外的所有省市自治區(qū)。由于日本腦炎疫苗的廣泛應(yīng)用,使得疫情大幅度降低[3],但日本腦炎病毒仍然嚴(yán)重威脅著人類健康,因此,有必要及時的了解JEV的流行趨勢及建立綜合防控的技術(shù)措施和示范體系。

日本腦炎病毒屬黃病毒科(Flaviviridae),黃病毒屬(Flavivirus),病毒基因組為單股正鏈RNA,其基因組長度約為11 kb,其中5′端有Ⅰ型帽狀結(jié)構(gòu),3′端無polyA尾,病毒基因組僅含有一個開放閱讀框(open reading frame,ORF)編碼產(chǎn)物通過裂解和加工形成約10個蛋白,由5′端末端編碼,而3′端編碼非結(jié)構(gòu)蛋白(nonstructural protein,NS)[4]。日本腦炎病毒包括3個結(jié)構(gòu)蛋白基因,7個非結(jié)夠蛋白基因和2個非翻譯區(qū),其中囊膜糖蛋白E表面有囊膜糖蛋白刺突[5]。因此基因工程重組表達(dá)的JEV E蛋白抗原有望成為標(biāo)準(zhǔn)化的診斷抗原。試驗對JEV E蛋白進(jìn)行原核表達(dá)并對抗原性進(jìn)行鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 日本腦炎弱毒株SA 14-14-2,為解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所基礎(chǔ)實驗室保存。

1.1.2 菌種和質(zhì)粒 大腸埃希菌DH 5α、BL21(DE3)感受態(tài)為解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所基礎(chǔ)實驗室保存;克隆質(zhì)粒pMD-18T為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品;pET-28a表達(dá)載體為本實保存。

1.1.3 試劑 限制性內(nèi)切酶(XhoⅠ、Eco RⅠ)T4 DNA連接酶、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶、等為Takara公司產(chǎn)品;兔抗JEV多克隆抗體為解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所基礎(chǔ)實驗室自制;豬JEV陽性、陰性血清、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗豬IgG為深圳綠詩源公司產(chǎn)品;DNA回收試劑盒;金屬螯和親和層析介質(zhì)(Ni-NTA)為Merck公司產(chǎn)品;IPTG、HRP標(biāo)記羊抗兔IgG為Promega公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 病毒RNA提取 參照Trizol法提取病毒RNA,按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.2 RT-PCR擴(kuò)增JEV E基因及產(chǎn)物的回收取10μL RNA作為模板、2μL隨機引物,70℃水浴5min,冰浴5min,0.5μL RNA酶抑制劑、8μL 5×bu ffer、8μL dNTP、0.5μLAMV逆轉(zhuǎn)錄酶、加水補足至40μL體系,42℃水浴1 h。取2.0μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板,以P1:5′-GCGAATTCTTACCATCCTCCTGCTGTTG-3′,P2:5′-ATCTCGAGCGCATCTCATCTCTTTTCTTGT-3′(P1、P2引物的5′端分別含有Eco RⅠ和XhoⅠⅠ內(nèi)切酶識別位點)作為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)條件為:94℃10 min;94℃1 min,58℃1 min,72℃2 m in,35個循環(huán);最后72℃10min,擴(kuò)增結(jié)束,將上述產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測,檢測正確后,純化回收PCR產(chǎn)物。

1.2.3 JEV E蛋白基因克隆載體pMD-18T-E的構(gòu)建 取上述回收產(chǎn)物溶于20μL超純水,將目的片段連接到pMD-18T中。連接體系:5μL膠回收產(chǎn)物、4.5μL solutionⅠ、0.5μL pMD-18T,16℃過夜。然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH 5α,涂布于含Ka+(50μg/mL)的LB平板上,37℃培養(yǎng)過夜,次日挑單菌落于5 mL LB中,37℃搖床振蕩(200 r/min)培養(yǎng)過夜。次日,堿裂解法提取質(zhì)粒,并以Eco RⅠ和XhoⅠ酶切進(jìn)行鑒定。

1.2.4 重組質(zhì)粒的序列測定 由寶生物工程(大連)有限公司完成。

1.2.5 JEV E蛋白重組表達(dá)載體pET28a-E的構(gòu)建 以Eco RⅠ+XhoⅠ酶切測序正確的質(zhì)粒及pET-28a空載體質(zhì)粒,將上述酶切產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定,并回收目的片段E基因和載體片段(按照凝膠試劑盒說明書進(jìn)行回收)。5μL E基因雙酶切膠回收產(chǎn)物,3.5μL pET-28a雙酶切膠回收產(chǎn)物,0.5μL T4 DNA連接酶,1μL T4緩沖液,16℃連接過夜,然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH 5α,堿裂解法提取質(zhì)粒,以Eco RⅠ+XhoⅠ酶切進(jìn)行鑒定。

1.2.6 JEV E蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

1.2.6.1 JEV E蛋白表達(dá)產(chǎn)物的可溶性分析 將酶切正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21(DE3),涂布于含Kan(50μg/mL)的LB平板上,37℃培養(yǎng)過夜,次日挑取單菌落,于5 mL LB液體培養(yǎng)基中,37℃搖床振蕩(200 r/min)培養(yǎng)過夜。以1∶100比例接種于新鮮的含Kan(50μg/mL)的LB培養(yǎng)基中,劇烈振蕩,待OD600約為0.4～0.6,加入IPTG誘導(dǎo)劑,終濃度為1.0 mmol/L,繼續(xù)在搖床37℃(200 r/m in),4 h后收集菌液。并設(shè)BL21誘導(dǎo)對照、未誘導(dǎo)的pET-28a(+)/BL21對照、pET-28a(+)/BL21誘導(dǎo)對照、未誘導(dǎo)的pET-E/BL21對照、pET-E/BL21誘導(dǎo)對照、各取1 mL,以6 000 r/min,4℃離心5 min,收菌,用PBS重懸,加入2×SDS-PAGE上樣緩沖液進(jìn)行處理。另外離心收集菌體1mL,以細(xì)胞裂解液重懸菌體,超聲破菌。分別收集上清和沉淀,取上述各樣品做SDSPAGE電泳檢測表達(dá)情況。

1.2.6.2 不同濃度的IPTG對JEV E蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)分析 將菌液按1∶100接種于5 mL含有Kan 50μg/mL)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.4～0.6時,加入IPTG至終濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、1.5、2.0mmoL/L,37℃誘導(dǎo)表達(dá)4 h～5 h,收獲細(xì)菌,然后進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.2.6.3 不同時間對JEV E蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)分析將凍存菌液按1∶100擴(kuò)大接種于5 mL含有Kan(50μg/mL)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.4～0.6時,加入IPTG至終濃度0.8mmol/L,37℃誘導(dǎo)表達(dá)1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 h,收獲細(xì)菌,然后進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.2.7 工程菌的大量制備及親和層析純化E蛋白

取凍存的陽性菌種,接種于5 mL含Kan(50μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中,37℃,200 r/m in震蕩培養(yǎng)過夜,次日,按1∶100轉(zhuǎn)接至100mL含Kan+(50μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中,至OD為0.6左右加入IPTG至終濃度為0.8 mmoL/L,37℃誘導(dǎo)表達(dá)6 h;4℃,5 000 r/m in離心15 m in,收集菌體;用10mL l×PBS緩沖液洗滌細(xì)菌1遍,然后再用10mL l×PBS緩沖液重懸,用超聲破碎重懸的細(xì)菌,冰浴超聲破碎:超聲4 s,停止9 s,15 min,功率為300 w,4℃條件下,以8 000 r/m in,離心15min,棄上清,2 mol/L尿素將沉淀溶解后,4℃條件下,以12 000 r/min離心10 min,棄上清,用8 mol/L尿素將剩下透明沉淀溶解,冰上1 h,4℃條件下,以12 000 r/min離心10 min,取上清。

參照M erck公司鎳離子親和層析柱(Ni-NTA)操作說明進(jìn)行。將50%的Ni-NTA樹脂懸浮液1mL與一定量的清亮裂解上清于室溫輕柔混勻(100 r/m in搖60min)后,將混合液裝柱;收集穿過峰,留小樣進(jìn)行SDS-PAGE;然后用不同變性緩沖液洗脫,收集洗脫液,取不同峰值樣品進(jìn)行SDSPAGE分析。

圖1 JEV E基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 PCR amplification products of JEVE gene

1.2.8 純化E蛋白的Western b lot鑒定 純化后的目的蛋白做SDS-PAGE,隨后將電泳蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜上,用50 mL/L的脫脂奶封閉37℃1 h,用TBS°T洗膜3次,10 min/次,1∶800稀釋兔抗JEV多克隆抗體,4℃孵育過夜,然后用TBS°T洗膜3次,10 min/次,再用HRP標(biāo)記羊抗兔IgG 37℃作用90min,TBS°T洗膜3次,10 min/次,DAB顯色。

1.2.9 純化E蛋白的ELISA鑒定 純化的E蛋白分別按1∶5、1∶10、1∶20、1∶40稀釋包被ELISA板,100μL/孔,4℃過夜;棄孔中液體,PBST洗板3次,3 min/次～5 min/次;封閉液200μL/孔,37℃孵育2 h;PBST洗板3次,3 min～5 min/次;分別加入1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640稀釋的豬乙型腦炎陰、陽性血清,100μL/孔;37℃孵育1 h;棄孔中液體,洗板3次,5min/次,加入辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗豬IgG作為二抗,100μL/孔,37℃孵育1 h;棄孔中液體,洗板3次5m in/次,各反應(yīng)孔中加入OPD底物液,室溫孵育15 min,于各反應(yīng)孔中加2 moL/L H2SO4終止液50μL,在酶標(biāo)儀(492 nm)上進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 JEV E蛋白基因片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10μL在10 g/L的瓊脂糖上進(jìn)行電泳,結(jié)果顯示擴(kuò)增出約1 500 bp的片段,與目的基因的預(yù)期大小相符,擴(kuò)增出了E蛋白基因(圖1)。

2.2 重組E蛋白克隆載體的構(gòu)建和鑒定結(jié)果

獲得重組克隆質(zhì)粒pMD-18T-E,經(jīng)限制性內(nèi)切酶Eco RⅠ/XhoⅠ雙酶切鑒定,切出了1.5 kb和2.7 kb的片段,與預(yù)期大小相符(圖2)。

圖2 pMD18-T-E質(zhì)粒酶切鑒定Fig.2 Identification of plasm id pM D-18T-E digested by Eco RⅠ/XhoⅠ

2.3 重組E蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定結(jié)果

重組原核表達(dá)載體pET28a-E經(jīng)限制性內(nèi)切酶Eco RⅠ/XhoⅠ雙酶切鑒定結(jié)果如下,切出了1.5 kb和5.4 kb片段,與預(yù)期大小相符(圖3)。

圖3 pET28a-E質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.3 Identification of plasmid pET28a-E digested by Eco RⅠ/XhoⅠ

2.4 JEV E蛋白基因核酸序列分析結(jié)果

借助Blast軟件,進(jìn)行序列比較發(fā)現(xiàn),該基因片段與減毒株SA 14-14-2、強毒株SA 14、標(biāo)準(zhǔn)強毒株JaOA rS982堿基序列同源性分別為100%、99%、98%,氨基酸序列同源性分別為100%、99%、98%。

2.5 E蛋白的表達(dá)及其可溶性分析

重組質(zhì)粒經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后分別收集上清和沉淀,經(jīng)SDS-PAGE檢測,在相對分子質(zhì)量約56 ku處有明顯的條帶,與預(yù)期的結(jié)果大小相符,融和蛋白主要以包涵體形體存在于沉淀中,上清中也有少量的融和蛋白。誘導(dǎo)空菌,未誘導(dǎo)的和誘導(dǎo)的空載體及未誘導(dǎo)的重組載體對照均無目的蛋白表達(dá)(圖4)。

圖4 乙型腦炎E蛋白的表達(dá)及其可溶性分析Fig.4 Expression and solubility analysis of Japanese encephalitis E protein

2.6 不同濃度IPTG對JEV E蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)分析

加入IPTG至終濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.8、1、2 mmol/L,37℃誘導(dǎo)表達(dá)4 h收菌,然后進(jìn)行SDS-PAGE分析?？梢娀蚬こ叹T導(dǎo)加入IPTG至終濃度0.8mm ol/L后,目的蛋白表達(dá)量達(dá)高峰(圖5)。

圖5 不同濃度IPTG對JEV E蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)分析Fig.5 Analysis of induced expression of JEV E protein by different IPTG con centrations

2.7 不同時間對JEV E蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)分析

加入IPTG至終濃度0.8mmol/L,37℃誘導(dǎo)表達(dá)1、2、3、4、5、6 h后收獲細(xì)菌,然后進(jìn)行SDSPAGE分析?？梢娀蚬こ叹T導(dǎo)4 h后目的蛋白的表達(dá)量達(dá)高峰(圖6)。

圖6 不同時間對JEV E蛋白的表達(dá)分析Fig.6 Analysis of the JEV E protein expression at different time

2.8 JEV E蛋白的純化

利用Ni-NTA柱親和層析,從誘導(dǎo)表達(dá)菌體的沉淀中純化得到了6His E融合蛋白,SDS-PAGE的鑒定結(jié)果表明如下(圖7)。紫外光吸收法定量分析表明獲得蛋白的濃度約為1.722m g/mL。

圖7 JEV E蛋白純化結(jié)果 Fig.7 Purification results of JEV E protein

2.9 純化JEV E蛋白的Western blot鑒定

經(jīng)純化后的E蛋白進(jìn)行Western b lot分析,在預(yù)期大小處可見清晰條帶(圖8),表達(dá)的E蛋白較好地保持了與兔抗JEV多克隆抗體的結(jié)合活性,說明,目的蛋白具有較好的抗原性。

2.10 純化E蛋白的ELISA檢測結(jié)果

將重組表達(dá)并純化的JEV E蛋白包被于ELISA板上,用不同稀釋度的豬JEV陽性血清檢測包被于ELISA板上的蛋白,檢測結(jié)果如表1,結(jié)果P/N＞2(表2),說明表達(dá)并純化后的蛋白具有較高的抗原性,可明顯地區(qū)分豬的陽性、陰性血清。

圖8 融合E蛋白與JEV多抗的Western blot結(jié)果Fig.8 Western blot analysis of E fusion protein with JEV polyclonal antibodies

表1 純化E蛋白的JEV多抗的ELISATable 1 ELISA of purified E protein with polyclonalantibody of JEV

表2 P/N值Table 2 Positive number/negative number

3 討論

E蛋白是JEV的主要蛋白,基因大約1 500 bp,E結(jié)構(gòu)蛋白基因含有病毒的抗原決定簇,是毒粒表面的重要成份,具有血凝活性和中和活性[6],E蛋白與病毒的毒力、宿主范圍、組織嗜性、膜融合保護(hù)性免疫、血凝反應(yīng)和血清特異性有關(guān),它能刺激機體產(chǎn)生中和抗體和血凝抑制抗體,為免疫原性蛋白[7]。因此,克隆乙型腦炎弱毒疫苗SA 14-14-2株E蛋白1 500 bp的基因片段,病毒的天然結(jié)構(gòu)而使構(gòu)象依賴型抗原表位得以正確呈現(xiàn),使其更具有免疫原性,這樣才會有更高的使用價值,目前,針對乙型腦炎病毒的疫苗大多包含E蛋白中的抗原表位[8-10]。

pET-28a(+)是Novagen公司的一個融合表達(dá)載體,具有產(chǎn)物易于純化,表達(dá)效率高的等優(yōu)點。pET28a-E(+)中的His°Tag融合標(biāo)簽是高度可溶的多肽,可以增強一些蛋白的可溶性。本實驗采用pET-28a做為載體,提高了目的蛋白在大腸埃希菌中的表達(dá)。本文初步研究了不同濃度IPTG及誘導(dǎo)不同時間對表達(dá)的影響,其中以IPTG誘導(dǎo)終濃度為0.8 mmo l/L、37℃、誘導(dǎo)4 h的培養(yǎng)條件最佳,可獲得高效率的表達(dá),誘導(dǎo)后目的蛋白主要是以包函體的形式存在,經(jīng)過Ni-NTA親和層析法純化,獲得了高純度的目的蛋白。Western b lot檢測抗原性時,兔JEV多抗與目標(biāo)蛋白結(jié)合,出現(xiàn)了目的條帶,說明目的蛋白具有抗原性。本文采用豬乙腦病毒抗體血清進(jìn)行ELISA檢測純化的蛋白抗原性,結(jié)果表明抗原稀釋1∶40、血清稀釋1∶640時,P/N值仍大于2,可見表達(dá)的蛋白具有很好的抗原性,所以,本實驗制備的乙腦E蛋白可作為鑒別流行性乙型腦炎的實驗室診斷抗原,并為進(jìn)一步研究診斷試劑盒及JEV E蛋白結(jié)構(gòu)與功能奠定了基礎(chǔ)。

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