含蟾酥膠囊血清誘導人肝癌細胞株凋亡及機制探討

頓愛社,張春菊,呂伯實,劉 帥,侯海峰,呂方啟

(1泰山醫(yī)學院,山東泰安 271000;2泰安衛(wèi)生學?；A(chǔ)護理教研室; 3泰山醫(yī)學院附屬醫(yī)院)

蟾酥是我國傳統(tǒng)的名貴中藥材,蟾酥膠囊(CC)是重慶市中醫(yī)研究院研制的以蟾酥為主要成分的一種蟾酥制劑,動物實驗和臨床報告表明,蟾酥提取物及各種蟾酥制劑具有治療肝癌的作用[1,2],而利用血清藥理學方法研究蟾酥制劑誘導肝癌細胞凋亡并探討其誘導機制的報道甚少。近兩年,我們采用血清藥理學方法,觀察CC血清對體外培養(yǎng)的人肝癌細胞株BEL-7402凋亡的誘導作用,并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、藥物及主要試劑人肝癌細胞株 BEL-7402購自華西臨床醫(yī)學院移植與免疫實驗室,CC水溶液由重慶市中醫(yī)研究院提供;純種新西蘭大白兔由華西實驗動物中心提供。培養(yǎng)基RPMI-1640,碘化丙啶(PI),MTT,二甲基亞砜(DMSO)。兔抗人Bcl-2單克隆抗體,SABC免疫組化SABC試劑盒,DNA提取試劑盒。

1.2 含藥血清的制備 參考文獻[3]的方法并作改進。20只新西蘭大白兔(體質(zhì)量2.0～2.5 kg)隨機分為兩組,各 10只,分別用于制備含藥血清和無藥血清。前者給予CC水溶液灌胃6ml/(kg?d),后者給予以等量NS灌胃,均3 d,兩組均自由進食和飲水。末次灌胃 1 h后,心臟穿刺抽血,4℃冰箱過夜,離心,無菌分離血清,滅活,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 細胞培養(yǎng)及分組 BEL-7402用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng),至對數(shù)生長期,消化收集,分別加入無藥血清(對照組),含10%(實驗1組)、20%(實驗2組)、30%(實驗3組)CC血清的RPMI-1640培養(yǎng)液重懸調(diào)整,以1×105/ml接種于培養(yǎng)瓶,分別培養(yǎng) 24、48 h備測。

1.4 各組細胞形態(tài)學觀察及細胞抑制率、凋亡率測算 采用倒置顯微鏡下觀察各組細胞形態(tài)學變化情況,用MTT比色法測算各組細胞抑制率[4],用流式細胞術(shù)測算細胞周期和細胞凋亡率。

1.5 各組細胞DNA梯度條帶測定 用瓊脂糖凝膠電泳檢測。取PBS洗過的BEL-7402(1×106),按試劑盒說明書抽提細胞中DNA,1.5%瓊脂糖凝膠、100 V恒壓電泳,紫外燈下觀察DNA條帶,用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。

1.6 各組細胞Bcl-2檢測 采用免疫組化SABC法染色,按試劑盒說明書操作。用真彩色醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)對Bcl-2染色結(jié)果進行定量分析,測定其吸光值(A值)。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。計量資料用±s表示,組間比較采用t檢驗和方差分析,兩兩比較用LSD法。α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞形態(tài)學變化 ①細胞貼壁能力變化：誘導培養(yǎng) 24 h時,實驗 2組細胞貼壁能力明顯下降,部分細胞呈漂浮生長狀態(tài),實驗 1、3組細胞貼壁能力未見明顯變化;48 h時,實驗2組細胞貼壁能力進一步下降,大部分細胞呈懸浮生長,實驗 1、3組細胞貼壁能力有所下降,少許細胞呈懸浮生長。②細胞集落性的變化：誘導培養(yǎng) 24 h,實驗 2組細胞集落生長特性明顯降低,部分細胞呈單個生長狀態(tài),實驗1、3組細胞集落生長特性無明顯變化;48 h時,實驗1組細胞集落生長特性無明顯變化,實驗 2組大部分細胞、實驗 3組有少許細胞呈單個生長狀態(tài)。③細胞大小和形狀變化：誘導培養(yǎng) 24 h,實驗2組大多數(shù)細胞仍呈梭形,個別細胞變小、變圓,實驗 1、3組細胞大小與形狀未見明顯變化;48 h時,實驗1組細胞大小、形狀仍未見明顯變化,實驗 2組大部分細胞和實驗 3組少部分細胞變小、變圓。對照組細胞培養(yǎng) 24 h時呈集落性、貼壁生長,長梭形,胞質(zhì)飽滿,折光性強;48 h后,相鄰細胞生長匯合成片,逐漸形成細胞單層,細胞貼壁能力無明顯下降,無細胞脫落。

2.2 各組細胞生長抑制率、細胞周期及凋亡率比較見表1。

表1 各組細胞生長抑制率、凋亡率及細胞周期(±s)

表1 各組細胞生長抑制率、凋亡率及細胞周期(±s)

注：與對照組同時點比較,＊P＜0.05,△P＜0.01

組別 細胞生長抑制率(%)細胞凋亡率(%)細胞周期(%) G1期 S期 G2/M期對照組24 h 0 3.3±0.45 55.8 33.6 10.6 48 h 0 4.3±0.22 54.6 29.9 15.4實驗1組24 h 10.3±0.17＊10.5±0.22＊54.3 33.2 12.5＊48 h 13.6±0.14＊14.6±0.41＊44.1＊ 26.6 29.3＊實驗2組24 h 26.5±0.25△32.6±0.51△50.6 31.0 18.4＊48 h 30.2±0.28△38.5±0.45△40.4＊ 27.7 31.8＊實驗3組24 h 15.6±0.24＊13.3±0.32＊53.3 32.4 14.3＊48 h 18.4±0.16＊23.6±0.54＊43.5＊ 28.4 28.0＊

2.3 各組細胞DNA電泳結(jié)果 對照組未見DNA階梯狀電泳條帶,各實驗組均見典型的DNA階梯狀電泳條帶(詳見圖1)。

圖1 凋亡細胞DNA含量電泳分析

2.4 各組Bcl-2表達結(jié)果 細胞培養(yǎng)24 h時,對照組及實驗1、2、3組Bcl-2 A值分別為0.80±0.03、0.44±0.03、0.35±0.05、0.42±0.04;48 h時分別為0.75±0.03、0.40±0.04、0.30±0.03、0.32± 0.02。各實驗組Bcl-2 A值均低于對照組(P均＜0.05),與實驗1、3組比較,實驗2組48 h時Bcl-2 A值最低(P均＜0.05)。

3 討論

血清藥理學由日本學者田代真一在 1984年首屆和漢醫(yī)藥學會上首次提出[5]。指將單味或復方中藥制劑經(jīng)口灌胃給動物一定時間后,采集動物血液,分離血清,用此含藥血清進行體外實驗的方法,從機理上更接近口服中藥后體內(nèi)環(huán)境中產(chǎn)生藥理效應(yīng)的真實過程,克服了中藥粗制劑在細胞藥理實驗上的缺點,提高了實驗結(jié)果的科學性。

有研究證實[6～11],原癌基因 Bcl-2是重要的抑制腫瘤細胞凋亡的基因,在抑制細胞凋亡的過程中起重要作用,可以增強細胞的存活力,參與細胞增殖與凋亡動態(tài)平衡的調(diào)控,Bcl-2異常表達與腫瘤的發(fā)生有關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),各實驗組 BEL-7402與含CC血清共同孵育后,出現(xiàn)了一系列凋亡細胞的生物學特征[12],如細胞變小、變圓,細胞膜完整但有發(fā)泡現(xiàn)象等;各實驗組細胞生長抑制率和凋亡率均較對照組明顯升高,提示含 CC血清可誘導肝癌細胞株凋亡。細胞周期分析發(fā)現(xiàn),G1、S期細胞減少, G2/M期細胞增多;細胞Bcl-2表達明顯下調(diào),提示含CC血清誘導細胞凋亡的機制可能是使處于分裂活躍階段的S期細胞減少,使細胞阻滯于 G2/M期,阻止細胞進入下一個分裂周期,抑制細胞增殖,從而導致細胞生長受抑制。含CC血清誘導BEL-7402凋亡的機制可能與下調(diào)細胞 Bcl-2表達有關(guān),這與Green等[13]研究結(jié)果一致。

本研究中,各實驗組細胞凋亡率均高于對照組,且各實驗組之間比較,誘導48 h時較24 h的細胞凋亡率高,以實驗 2組在誘導 48 h的細胞凋亡率最高。分析原因可能是細胞凋亡率并非一定隨藥物濃度及作用時間增加而增加,在藥物濃度達到一定量、且作用一定時間后,細胞開始凋亡,凋亡率隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長而升高;開始時細胞凋亡率與藥物劑量呈正相關(guān)關(guān)系;但藥物達到一定劑量后細胞凋亡率不再增加,需等到其他周期的細胞過渡到該周期才有可能被誘發(fā)凋亡而繼續(xù)發(fā)揮其藥物作用。因此我們推測,含 CC血清的最佳濃度應(yīng)該在20%左右。

總之,CC血清具有良好的誘導肝癌細胞株凋亡的作用,其有望作為一種新的治療肝癌藥物,但其誘導細胞凋亡機制、是否引起肝癌細胞耐藥及臨床應(yīng)用劑量和療效方面尚不十分清楚,有待于進一步研究。

[1].唐靜,靳榮,葉云.蟾酥制劑在抗腫瘤方面的應(yīng)用[J].藥學專論,2008,17(20)：15-16.

[2]張加梅.蟾酥抗癌作用研究進展[J].齊魯藥事,2008,27(7)：417-418.

[3]李秀榮,張丹,齊元富,等.消瘤平移合劑含藥血清誘導肝癌H-7402細胞凋亡的實驗研究[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2001,21 (9)：684-687.

[4]宋金丹.組織和細胞培養(yǎng)技術(shù)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社, 2002：111-112.

[5]賀玉琢.日本漢方藥血清藥理學、血清藥化學的研究概況[J].國外醫(yī)學：中醫(yī)中藥分冊,1998,20(5)：3-7.

[6]Zhou C,Li X,DuW,et al.Antitumor effects of ginkgolic acid in human cancer cell occur via cellcyclearrest and decrease theBcl-2/ Bax ratio to induce apoptosis.[J]Chemotherapy,2010,56(5)：393-402.

[7]Kanematsu S,Uehara N,Miki H,et al.Autophagy inhibition enhances sulforaphane-induced apoptosis in human breast cancer cells [J].Anticancer Res,2010,30(9)：3381-3390.

[8]Deeb D,Gao X,Jiang H,et al.Growth inhibitory and apoptosisinducing effects of xanthohumol,a prenylated chalone present in hops,in human prostate cancer cells[J].Anticancer Res,2010, 30(9)：3333-3339.

[9]Chaudhry P,Srinivasan R,Patel FD.Expression of themajor fas family and Bc l-2 fam ily of proteins in epithelial ovarian cancer (EOC)and their correlation to chemotherapeutic response and outcome[J].OncolRes,2010,18(11-12)：549-559.

[10]Li Y,Xia AZ,Xing SH.Protective effect of edaravone against renal ischem ia/reperfusion injury and compared with ischem ic postconditioning in rats[J].藥學學報,2010,45(7)：840-848.

[11]Ayhan S,Nalbant OA,Isisag A,etal.Immunohistochem icalanalysisof Ki-67,p53 and Bc l-2 expression related to histological features in gastroesophageal reflux disease[J].Turk JGastroenterol, 2010,21(3)：199-205.

[12]宋金丹.醫(yī)學細胞生物學[M].北京：人民衛(wèi)生出版社,2005：308-309.

[13]Green DR,Reed JC.Mitochondria and apoptosis[J].Science, 1998,281(5381)：1309-1312.