Tadenan對早期糖尿病大鼠膀胱組織中NGF及P物質(zhì)表達的影響

張貴旺,史本康,王 平,劉屹立,李永智

(1冠縣人民醫(yī)院,山東冠縣 252500;2山東大學(xué)齊魯醫(yī)院; 3中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院)

Tadenan是非洲臀果木提取物,在臨床上用于治療良性前列腺增生(BPH)以及由于膀胱出口梗阻(BOO)導(dǎo)致的膀胱形態(tài)及功能改變,但其對糖尿病引發(fā)的膀胱功能障礙作用的研究尚未有所報道。2005年 5月 ～2007年 6月,我們建立糖尿病大鼠動物模型后,采用Tadenan干預(yù),觀察Tadenan對大鼠糖尿病膀胱組織中神經(jīng)生長因子(NGF)及P物質(zhì)的影響,為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 健康成年雄性Wistar大鼠36只,體質(zhì)量(200±10)g,上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供,均飼養(yǎng)于山東大學(xué)實驗動物中心SPF實驗室。大鼠隨機分為正常對照組(對照組)、糖尿病組、治療組、藥物對照組(藥物組),前三組每組各 10只,藥物組 6只。

1.2 糖尿病大鼠模型的制備及用藥方法 糖尿病組和治療組先建立糖尿病大鼠模型[1]。飼養(yǎng) 4周后,治療組及藥物組給予Tadenan 100 mg/(kg?d),溶于2 ml花生油中,經(jīng)胃管注入;對照組及糖尿病組大鼠給予同等劑量花生油賦形劑。以上動物共飼養(yǎng) 8周。8周后處死,完整切取膀胱組織。

1.3 主要試劑 RNA提取試劑盒(Trizol Reagent)、DL2000(50T)DNA Marke。NGF產(chǎn)物長度為505 bp;β-actin內(nèi)參：正義鏈：5′-AAGATCCTGACCGAGCGTGG-3′;反義鏈：5′-CAGCACTGTGTTGGCATAGAGG-3′,擴增產(chǎn)物長度為101 bp。

1.4 膀胱組織中NGF及P物質(zhì)檢測方法 ①NGF檢測方法：采用RT-PCR法檢測標(biāo)本中NGFmRNA。用Trizol試劑提取對照組、糖尿病組、治療組大鼠膀胱組織總RNA,行變性膠電泳,檢測總RNA的完整性,采用752紫外分光光度計檢測樣品中總RNA含量。分別取總RNA 10μg依次加入：5×Buffer 4μl、dNTP 2μl、MgCl24μl、Oligo dT 1μl、RNAse抑制劑0.5μl、莫洛尼氏鼠白血病病毒(MMLV)反轉(zhuǎn)錄酶1 μl,用去RNAse水補齊,總計20μl,37℃水浴60min后,于95℃加熱5min以終止反應(yīng)。以第1鏈cDNA 2μl為模板,進行PCR擴增。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min,94℃、20 s,68℃、20 s,72℃、1min,35個循環(huán), 72℃延伸10min。4℃保存,反應(yīng)產(chǎn)物取10μl進行1%瓊脂糖電泳鑒定,Kodak凝膠成像系統(tǒng)分析電泳結(jié)果,其結(jié)果與內(nèi)參的比值為各組NGF相對表達量。采用ELISA法測定標(biāo)本中NGF蛋白。按ELISA試劑盒說明書操作。②P物質(zhì)檢測方法：四組膀胱組織經(jīng)4%多聚甲醛固定,石蠟包埋,5～6μm厚連續(xù)切片,采用免疫組化SP法檢測膀胱組織中P物質(zhì)陽性纖維,操作按試劑盒說明書進行。每張切片隨機觀察 5～10個高倍視野,對 P物質(zhì)陽性神經(jīng)纖維數(shù)采用雙盲計數(shù)。采用ELISA法測定標(biāo)本中P物質(zhì)蛋白表達情況。按ELISA試劑盒說明書操作。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)據(jù)以±s表示。組間比較用單因素方差分析和student′s t檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四組大鼠體質(zhì)量及血糖水平比較 建模后,糖尿病組和治療組大鼠體質(zhì)量分別為(240.82± 10.32)、(245.76±9.87)g,明顯低于對照組及藥物組的(340.34±10.12)、(328.45±9.68)g(P均＜0.01);血糖分別為(25.46±4.45)、(25.41± 4.45)mmol/L,明顯高于對照組及藥物組的(4.36± 3.46)、(4.56±3.32)mmol/L(P均＜0.01)。證明建模成功。

2.2 四組膀胱組織中NGFmRNA表達及蛋白水平見表1。

表1 各組大鼠NGFmRNA表達及蛋白水平比較(±s)

表1 各組大鼠NGFmRNA表達及蛋白水平比較(±s)

注：與糖尿病組相比,＊P＜0.05;與對照組和藥物組相比,＊＊P＜0.05

組別 n NGFmRNA NGF蛋白(pg/μg)對照組 10 0.766±0.213 73.541±5.628糖尿病組 10 0.350±0.253＊＊ 17.219±2.856＊＊治療組 10 1.844±1.174＊ 54.632±4.735＊藥物組 6 2.815±1.825 74.375±5.819

2.3 四組膀胱組織中P物質(zhì)檢測結(jié)果 見表2。

表2 各組膀胱組織中P物質(zhì)陽性纖維密度及P物質(zhì)蛋白水平比較(±s)

表2 各組膀胱組織中P物質(zhì)陽性纖維密度及P物質(zhì)蛋白水平比較(±s)

注：與糖尿病組相比,＊P＜0.05;與對照組和藥物組相比,＊＊P＜0.05

組別 n P物質(zhì)陽性纖維(個/HP) P物質(zhì)蛋白(pg/μg)對照組 10 28.81±5.05 63.541±5.478糖尿病組 10 9.83±3.16＊＊ 10.219±2.647＊＊治療組 10 20.75±4.60＊ 46.632±4.526＊藥物組 6 29.32±5.75 64.375±5.723

3 討論

糖尿病是臨床常見的內(nèi)分泌疾病,其對膀胱功能的損傷受到越來越多的關(guān)注。血糖升高狀態(tài)下,糖代謝紊亂、植物神經(jīng)發(fā)生病變,導(dǎo)致尿量增多、排尿反射減弱、膀胱容量增大、出現(xiàn)殘余尿,由此而引起尿頻、排尿不凈、充溢性尿失禁、腎功能不全等[2]。但其膀胱功能損害的具體機制尚不清楚,因此目前的臨床治療缺乏針對性,效果不佳。

我們先建立糖尿病大鼠模型,觀察糖尿病大鼠膀胱組織中NGF及P物質(zhì),同時觀察Tadenan對糖尿病大鼠膀胱組織中NGF、P物質(zhì)的影響作用。我們的數(shù)據(jù)顯示,糖尿病組及治療組大鼠的體質(zhì)量及血糖指標(biāo)完全符合糖尿病模型的要求,說明糖尿病大鼠模型建立成功。

NGF是一種多肽物質(zhì),主要存在于交感神經(jīng)中,后者在膀胱分布豐富,其作用有以下幾方面：①維持交感神經(jīng)和感覺神經(jīng)的生長發(fā)育及功能;②誘導(dǎo)軸突發(fā)芽、決定軸突的伸長時間,并可穩(wěn)定神經(jīng)結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)微絲蛋白的合成;③促進細胞分化及創(chuàng)傷愈合;④對神經(jīng)細胞的凋亡有抑制作用[3]。高血糖狀態(tài)下,NGF的表達呈時序性降低,促進了糖尿病膀胱病變進程[4,5]。本研究結(jié)果說明Tadenan能顯著增強糖尿病大鼠膀胱組織中 NGF表達水平,降低高血糖對膀胱的損害,在一定程度上起到保護膀胱的作用。

P物質(zhì)是一種受NGF調(diào)控的基因表達產(chǎn)物,是膀胱和尿道壁內(nèi)組織傳入神經(jīng)纖維(感覺纖維)的重要組成部分,主要位于膀胱和尿道黏膜和黏膜下層組織內(nèi),傳導(dǎo)疼痛、溫度覺和觸覺,在排尿過程中與感覺傳入有關(guān)[6]。糖尿病狀態(tài)下,NGF表達顯著降低,勢必導(dǎo)致其調(diào)控的膀胱組織中P物質(zhì)水平下降[7]。本研究結(jié)果說明Tadenan能顯著提高糖尿病大鼠膀胱組織中P物質(zhì)水平,降低高血糖狀態(tài)對P物質(zhì)的損耗,從而在一定程度上減輕糖尿病對膀胱的損傷。

對于Tadenan能改善糖尿病對大鼠膀胱組織的損害的機制,目前尚無相關(guān)報道。本研究結(jié)果顯示, Tadenan可上調(diào)NGFmRNA在正常大鼠膀胱組織中的表達,而對其蛋白水平和P物質(zhì)無明顯作用。國外有研究顯示Tadenan在膀胱缺血再灌注及膀胱出口梗阻的動物模型中,能改善膀胱神經(jīng)及肌肉中細胞膜及亞細胞器膜的損傷,降低線粒體及肌漿網(wǎng)的損害[8,9],結(jié)合Tadenan在其它模型中的作用及本次實驗結(jié)果,我們考慮是否Tadenan通過對堿性成纖維細胞因子的抑制作用,改善逼尿肌內(nèi)微細胞器內(nèi)結(jié)構(gòu),增加NGF及P物質(zhì)的表達,減輕糖尿病對膀胱感覺功能的損害。其機制待進一步研究。

[1]Markle RA,Kwader DE.Effects of streptozotocin-induced diabetes and insulin treatment on substance Pof the rat arterialwall[J].Life Sci,1996,58(14)：1123-1129.

[2]熊恩慶,龔宇,宋波,等.糖尿病大鼠膀胱儲尿期功能改變的實驗研究[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2003,25(22)：1999-2001.

[3]Steers WD,Tuttle JB.Mechanisms of disease：the role of nerve growth factor in the pathophysilogy of bladder disorders[J].Nat Clin PractU rol,2006,3(2)：101-110.

[4]Tong YC,Cheng JT.Changes in bladder nerve growth factor and p75 genetic expression in streptozotocin-induced diabetic rats[J]. BJU Int,2005,96(9)：1392-1396.

[5]Sasaki K,Chancellor MB,Phelan MW,et al.Diabetic cystopathy correlateswith a long-term decrease in nerve growth factor levels in the bladder and lumbosacral dorsal root Ganglia[J].JUrol,2002, 168(3)：1259-1264.

[6]Karl-Erik A.Bladder activation：afferentmechanisms[J].Urology, 2002,59(Suppl 5A)：43-50.

[7]Dahlstrand C,Dahlstrom A,Ahlman H,etal.Effectofsubstance P on detrusor muscle in rats with diabetic cystopathy[J].Br JU rol, 1992,70(4)：390-394.

[8]Levin RM,Whitbeck C,Horan P,et al.Low-dose tadenan protects the rabbit bladder from bilateral ischem ia/reperfusion-induced contractile dysfunction[J].Phytomedicine,2005,12(1-2)：17-24.

[9]Levin RM,Hass MA,Bellamy F,et al.Effect of oral Tadenan treatment on rabbit bladder structure and function after partial outlet obstruction[J].JUrol,2002,167(5)：2253-2259.