燃煤型氟中毒大鼠睪丸組織中SCFmRNA的表達變化及意義

肖躍海,孫 發(fā)＊,石家齊,谷 江,李崇斌,謝 春,夏曙華

(1貴陽醫(yī)學院附屬醫(yī)院,貴陽 550004;2貴陽醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院)

已有研究證實[1,2],睪丸支持細胞分泌的干細胞因子(SCF)對生精細胞的增殖、分化、發(fā)育及凋亡關系密切,同時又有研究表明,氟中毒可導致睪丸生精細胞凋亡增加,精子質(zhì)量下降[3～6]。但關于睪丸SCFmRNA在燃煤型氟中毒后睪丸組織中的表達目前尚無報道。2008年 1月 ～2010年 8月,我們通過構(gòu)建燃煤型氟中毒大鼠模型,觀察睪丸支持細胞超微結(jié)構(gòu)和睪丸組織中SCFmRNA的表達,探討燃煤型氟中毒所致雄性大鼠生精障礙的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及燃煤型氟中毒動物模型制作 雄性SD大鼠20只,重 90～110 g,由貴陽醫(yī)學院實驗動物中心提供。隨機分為對照組、低氟組、中氟組、高氟組(后三組為染毒組),各5只。各組飼料成分相同(氟、玉米、豆粉、豆餅、麥麩、面粉、酵母粉、骨粉、芝麻餅、雞蛋、奶粉、鹽、菜油),含氟量及比例不同成分見表 1,余成分所占比例相同。自由飲用自來水。

表1 各組動物飼料中氟含量及比例不同成分

1.2 檢測方法

1.2.1 主要試劑及器械 Trizol試劑、焦碳酸二乙酯、總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒。透射電子顯微鏡、紫外可見分光光度計、PCR擴增儀、凝膠成像分析系統(tǒng),高速冷凍離心機。

1.2.2 檢測指標及方法 喂飼90 d后,置大鼠于代謝籠,收集每只大鼠 24 h尿,用氟離子選擇電極法測定尿氟水平;觀察氟斑牙出現(xiàn)情況,參考氟斑牙分度標準[4]給予分度。均采用股動脈放血法處死大鼠,無菌取雙側(cè)睪丸。右側(cè)睪丸稱重用以計算臟器系數(shù)(睪丸系數(shù)=睪丸質(zhì)量/大鼠體質(zhì)量)。取左側(cè)睪丸取部分組織用以電鏡觀察,部分組織采用RT-PCR法檢測其中SCF mRNA表達變化。

1.2.2.1 睪丸支持細胞超微結(jié)構(gòu)觀察 冰盒上剔除白膜取睪丸組織,2.5%戊二醛固定,10%乙二胺四乙酸(EDTA)蔗糖緩沖液,1%鋨酸后固定,梯度丙酮脫水,Epon 812浸透、包埋,6℃聚合12 h,制備超薄切片(50～70 nm),經(jīng)醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛雙重染色后,透射電子顯微鏡觀察。

1.2.2.2 RT-PCR法檢測大鼠睪丸組織中SCF mRNA表達情況 ①總RNA提取：無菌狀態(tài)下稱取新鮮睪丸組織100 mg,提取總RNA,嚴格按照試劑盒說明書操作。提取總 RNA后用紫外分光光度計檢測RNA純度良好,經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳顯示3條帶,提示RNA完整。②cDNA合成：取各組總RNA 1μl,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行操作。③PCR目的片段擴增：從美國國立生物技術信息中心(NCBI)查找大鼠SCFmRNA系列,大鼠SCF引物系列、β-actin經(jīng)Primer 5.0軟件自行設計,由上海金斯瑞公司合成。SCF mRNA上游引物為5′-CAAAACTGGTGGCGAATCTT-3′、下游引物為5′-GCCACGAGGTCATCCACTAT-3′,242 bp; β-actin上游引物為 5′-CAAAACTGGTGGCGAATCTT-3′、下游引物系列為5′-GCCACGAGGTCATCCACTAT-3′,242 bp。PCR反應體系總體積50μl,反應條件：94℃預變性 5min,94℃變性 30 s,60℃退火 30 s,72℃延伸 30 s,共 35個循環(huán),72℃終延伸5m in。分別取PCR產(chǎn)物于2.0%瓊脂糖凝膠上電泳,用紫外觀察儀進行觀察拍照,用ImageJ軟件系統(tǒng)半定量分析。以同一體系中目的基因產(chǎn)物電泳條帶光密度值與內(nèi)參照β-actin條帶光密度值的比值來表示該樣品SCFmRNA的相對表達水平。(100 bp的DNA Marker購自美國MBI公司)。

1.3.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件。資料用±s表示,用t檢驗和F檢驗行統(tǒng)計分析。α =0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組尿氟水平和氟斑牙發(fā)生情況 對照組及低、中、高氟組尿氟分別為(1.7±0.1)、(3.0± 0.1)、(6.0±0.1)、(13.0±0.3)mg/L,發(fā)生氟斑牙分別為 0、2、5、5只;低、中、高氟組與對照組比較,P均 ＜0.01。氟斑牙 0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ度者,對照組分別為5、0、0、0只,低氟組分別為 3、2、0、0只,中氟組分別為 1、2、2、0只,高氟組分別為 0、1、3、1只,證明成功建立氟中毒模型。

2.2 各組大鼠體質(zhì)量、睪丸質(zhì)量及睪丸系數(shù)比較見表2。

表2 各組大鼠體重、睪丸重量及睪丸系數(shù)比較(±s)

表2 各組大鼠體重、睪丸重量及睪丸系數(shù)比較(±s)

注：與對照組相比,＊P＜0.05,△P＜0.01

組別 體質(zhì)量(g)右側(cè)睪丸質(zhì)量(g)右側(cè)睪丸系數(shù)(%)對照組 377.8±6.18 1.814±0.02 0.480±0.01低氟組 375.4±5.55 1.734±0.03＊ 0.462±0.01＊中氟組 375.8±3.56 1.718±0.02△ 0.457±0.01△高氟組 376.0±4.85 1.620±0.06△ 0.430±0.01△

2.3 各組支持細胞超微結(jié)構(gòu)變化 電鏡下對照組呈正常支持細胞表現(xiàn);低、中、高氟組睪丸支持細胞胞質(zhì)中初級溶酶體增多,核高度畸形,染色質(zhì)邊集,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增生并高度擴張,胞質(zhì)空泡化,且隨染氟劑量的增加核畸形加重。

2.4 SCFmRNA表達 低、中、高、氟組睪丸組織中SCFmRNA相對表達量分別為0.71±0.05、0.68± 0.01、0.49±0.02,均明顯低于對照組的 0.73± 0.03(P分別 ＜0.05、0.01、0.01),且隨著氟中毒劑量的增加,低、中、高氟組睪丸組織中SCFmRNA依次降低(P均＜0.05)。

3 討論

大量研究表明[6,7],過量氟可破壞睪丸生殖細胞的形態(tài)和功能。氟可直接作用于睪丸組織,破壞睪丸各級生精細胞、支持細胞、間質(zhì)細胞及精子,導致精子畸形率增加、精子密度和精液質(zhì)量下降,燃煤型氟中毒是我國特有的氟中毒類型,我們前期研究發(fā)現(xiàn),燃煤型氟中毒和其他類型氟中毒相似,可導致生殖細胞的凋亡,影響精子質(zhì)量,但氟中毒所致生殖細胞凋亡機制至今尚不清楚。

SCF在睪丸組織中由睪丸支持細胞分泌,由于蛋白水解酶酶切位點不同,SCF分為sSCF和mSCF兩類,前者主要在造血系統(tǒng)中起作用,促進骨髓造血細胞的增殖、分化、成熟;后者主要在睪丸組織中起作用,與生精關系密切[8]。在睪丸組織中,mSCF介導生精細胞黏附到支持細胞,誘導精原細胞由G1期向 S期過渡,促進精原細胞增殖分化,減少精原細胞過度凋亡[9]。有研究發(fā)現(xiàn)[10],給予大鼠睪丸支持細胞損害劑2,5-己二酮后,總SCF mRNA的表達降低,其中模型mSCFmRNA降低明顯,sSCFmRNA無明顯變化,表明睪丸組織中SCF mRNA可以反映生精障礙。

本研究結(jié)果顯示,染氟 90 d后,對照組與各染氟組比較,大鼠的體重的變化不明顯,各染氟組大鼠睪丸質(zhì)量及睪丸系數(shù)較對照組有所下降,與文獻[11,12]的觀點相符。此外,與對照組比較,各染毒組睪丸支持細胞的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化：初級溶酶體增多,核高度畸形,染色質(zhì)邊集,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增生并高度擴張,胞質(zhì)空泡化,胞質(zhì)電密度增高多突起,細胞間隙大。損傷程度隨染劑量的增加而加重。本研究結(jié)果還顯示,染氟 90 d后,低、中、高氟組睪丸組織中SCFmRNA較對照組下調(diào),并隨著氟中毒程度的加重而表達逐漸降低(P＜0.05),表明染氟程度與SCF表達有關。

精子的發(fā)生是一個復雜的過程。睪丸支持細胞是睪丸中唯一產(chǎn)生SCF的細胞,SCF與生精過程的啟動有關,與生精細胞分化、增殖、營養(yǎng)、支持、保育及吞噬密切相關,調(diào)控精子排放[1,2,8]。我們推測,氟可能影響睪丸支持細胞的超微結(jié)構(gòu),從而下調(diào)了SCFmRNA的表達,導致生精功能變化。氟影響睪丸組織表達SCFmRNA的具體機制有待于進一步研究。

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