不同功效中藥誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞定向分化的研究概況

戴 映,楊萬章,金明月

間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有分化成間質(zhì)起源的任意組織的潛能,包括向神經(jīng)元樣細胞、軟骨、脂肪、造血基質(zhì)及骨等分化成熟的特征[1,2]。MSCs不僅存在于骨髓中,也可從臍血、外周血中以及脂肪組織、肌肉、胎兒器官、大腦、牙齒中分離,也有人從臍帶靜脈內(nèi)皮下層分離出MSCs[3]。由于MSCs向神經(jīng)細胞等多種細胞分化的特性及其特有的免疫調(diào)節(jié)特性[4,5],故而成為目前研究的熱點,使其作為最佳種子細胞在組織工程中令人看好。人們把間充質(zhì)干細胞可以跨系,甚至跨胚層分化這一特性稱為干細胞的可塑性(p lasticity),也稱為橫向分化(transdifferentiation)[6]。利用這一特性在體外大量誘導(dǎo)分化成神經(jīng)細胞后,可作為治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷疾病的種子細胞來源。中醫(yī)藥學(xué)對神經(jīng)功能缺損疾病的治療也有著比較深刻的認識和豐富的經(jīng)驗,近年研究表明,中藥不僅可以保護神經(jīng)細胞,提高神經(jīng)元抵抗損傷的能力,而且還可以促進MSCs增殖并誘導(dǎo)其定向分化為神經(jīng)元樣細胞,達到治療神經(jīng)功能缺損疾病的目的?，F(xiàn)依據(jù)不同功效的中藥對間充質(zhì)干細胞定向誘導(dǎo)為神經(jīng)元樣細胞的思路,將近幾年有關(guān)的實驗研究情況簡單的綜述如下。

1 補中益氣藥誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞分化

中國傳統(tǒng)中藥的應(yīng)用歷史源遠流長,黃芪、人參等更是臨床應(yīng)用較多的中藥。黃芪、人參益氣活血、抗氧化、延緩衰老、增強機體免疫功能等作用,實驗同樣證明對正常大鼠的學(xué)習(xí)、記憶過程有促進作用。賈延劼[7]首次采用黃芩苷誘導(dǎo)大鼠MCS(rMSC)在體外分化成為神經(jīng)細胞,多數(shù)細胞表達神經(jīng)元烯醇化酶(NSE)、神經(jīng)絲蛋白(NF),黃芩苷與巰基乙醇(β-mercaptoethanol,β-ME)相比,雖然在早期誘導(dǎo)效果不如β-ME,但是長期效果優(yōu)于β-ME,且細胞存活率較高。劉金寶等[8-10]采用多種單味中藥(當歸、人參、天麻、黃芪等)誘導(dǎo)rMSC,1 h～3 h后,其中大部分rMSC分化為神經(jīng)元樣細胞,其轉(zhuǎn)化率分別為當歸(74.2±3.8)%、人參(69.3±4.1)%、天麻(75.3±4.1)%、黃芪(93.7±2.3)%。姚曉黎等[11]報道參芪液(含黨參和黃芪)可在體外誘導(dǎo)人MCS(hM SC)分化為神經(jīng)元樣細胞。參芪液具有補中益氣、生津養(yǎng)血的功效,可以促進正常機體生長,有抗氧化、增強免疫和抑制細菌的作用。

2 補腎填精藥誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞分化

劉柏炎等[12]認為干細胞可歸于中醫(yī)正氣范疇,胚胎干細胞與先天之精氣有關(guān)。中醫(yī)學(xué)的“精”在內(nèi)涵上與干細胞有很大的相關(guān)性,干細胞具先天之精屬性,是先天之精在細胞層次的存在形式。腎藏精,精生髓,腦為髓之海。根據(jù)干細胞具先天之精屬性理論及精生髓通腦理論,張進等[13]認為,來自骨髓的MSC與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的NSC同屬先天之精,它們能相互轉(zhuǎn)化,而且MSC可能更是參與了中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的正常細胞更新,補腎填精法可能會對這種MSC向神經(jīng)元樣細胞的分化起促進作用。他們采用龜板水煎液體外誘導(dǎo)rMSC分化為神經(jīng)元樣細胞。陳東風(fēng)等[14]報道rMSC經(jīng)龜板含藥血清體外誘導(dǎo)后分化的神經(jīng)元樣細胞神經(jīng)絲蛋白表達陽性,誘導(dǎo)12 h后,神經(jīng)元樣細胞陽性率達到高峰,細胞存活時間較長,至第7天仍有神經(jīng)元樣細胞存活。鄺學(xué)媚等[15]報道三甲復(fù)脈湯含藥血清體外誘導(dǎo)成年大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞分化也有類似發(fā)現(xiàn),而且其中以三甲復(fù)脈湯中細胞存活時間最長。

3 活血補血藥誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞分化

當歸、丹參、三七、川芎等中藥具有活血補血、抗氧化等作用。近年來,隨著嚴善福等[16]發(fā)現(xiàn)牛膝多糖體外能促進MSC增值,更多的研究集中在活血補血中藥成分可體外誘導(dǎo)MSC向神經(jīng)元樣細胞的分化上。孟凡剛等[17]用丹參誘導(dǎo)成年小鼠骨髓基質(zhì)干細胞,分別于誘導(dǎo)后5 h、24 h、72 h進行免疫細胞化學(xué)染色,結(jié)果顯示巢蛋白(Nestin)和βⅢ-微管蛋白(βⅢ-Tubulin)均呈陽性表達。馮亞波等[18]分別采用堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)和丹參注射液聯(lián)合或2-巰基乙醇(2-ME)單種誘導(dǎo)骨髓間質(zhì)干細胞(rMSCs),免疫組化鑒定NSE、NF、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)。結(jié)果顯示在體外用丹參注射液與bFGF聯(lián)合誘導(dǎo)可以使成年Wistar大鼠rMSCs分化為神經(jīng)元樣細胞,并且存活時間明顯延長。余勤等[19]采用含丹參注射液的無血清Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DM EM)/F-12培養(yǎng)液誘導(dǎo)大鼠rMSCs分化為神經(jīng)元樣細胞,通過觀察rMSCs經(jīng)誘導(dǎo)后細胞的形態(tài)變化和采用免疫組化方法檢測神經(jīng)元特異性核蛋白(NeuN)、神經(jīng)絲蛋白(NFM)、GFAP的表達來鑒定神經(jīng)元樣細胞。發(fā)現(xiàn)丹參注射液可以在體外誘導(dǎo)rMSCs分化為神經(jīng)元樣細胞,其誘導(dǎo)分化率與丹參注射液的濃度有關(guān)。丹參能夠誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)細胞向神經(jīng)元分化的機制目前還不清楚,推測可能是丹參對處于活性氧應(yīng)激狀態(tài)的細胞有保護作用,丹參注射液中的三種水溶性成分對維生素C2NADPH系統(tǒng)及Fe2+半胱氨酸系統(tǒng)誘發(fā)的腦微粒體脂質(zhì)過氧化有很強的抑制作用,能夠清除氧自由基,這些可能是其對神經(jīng)細胞產(chǎn)生保護作用的機制。

復(fù)方活血補血方劑及丹參的有效成分丹參酮都與丹參一樣,其具有的抗氧化作用可能與其定向誘導(dǎo)機制有關(guān)。武衡等[20]應(yīng)用血清藥理學(xué)方法證實,腦溢安(鉤藤、生地黃、牡丹皮、三七、地龍等)含藥血清具有促進大鼠海馬MSC向神經(jīng)元方向分化的作用,提高NSC分化為神經(jīng)元的比率,此外尚具有促進神經(jīng)細胞存活的作用。并認為腦溢安通過影響MSC的增殖、分化、移行來促進神經(jīng)元再生、提高神經(jīng)功能恢復(fù)水平。黃慧等[21]用香丹注射液(含丹參和降香)定向誘導(dǎo)大鼠MSC分化為神經(jīng)元樣細胞,推測丹參的水溶性成分丹參素的抗氧化作用可能是產(chǎn)生定向誘導(dǎo)的主要原因之一。其可能機制是丹參素能抑制環(huán)核甘酸磷酸二酯酶的活力,提高胞內(nèi)環(huán)核甘酸(cAMP)水平,后者進一步激活蛋白激酶A(p rotein kinase A,PKA)、p38ER K 1?2等信號傳導(dǎo),最終引起神經(jīng)突起發(fā)生和延長。另外,丹參素也可能通過刺激MSC產(chǎn)生白細胞介素而誘導(dǎo)或參與MSC定向分化為神經(jīng)元樣細胞。夏文杰等[22]選用第5代、第10代的MSC以bFGF預(yù)誘導(dǎo),再用丹參酮ⅡA和隱丹參酮誘導(dǎo),發(fā)現(xiàn)大部分M SC可轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)元樣細胞,并有軸突和樹突出現(xiàn),多個神經(jīng)元之間可形成網(wǎng)絡(luò)。前者誘導(dǎo)的神經(jīng)細胞表達NSE、NFM,提示該細胞可能尚處于神經(jīng)元前體細胞階段;后者誘導(dǎo)的神經(jīng)細胞表達NSE、高分子量神經(jīng)絲蛋白(neurofilament-H,NF-H),提示神經(jīng)元趨向成熟,并推測兩者的誘導(dǎo)機制可能與其抗氧化作用有關(guān)。

4 芳香藥誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞分化

中藥中走竄開竅的芳香類藥物(如含麝香陳芬的藥物)也能體外誘導(dǎo)MSC向神經(jīng)元樣細胞分化。肖慶忠等[23,24]用含麝香多肽(musk polypeptide,Mu-p)或麝香酮(muscone,M u-n)的培養(yǎng)基體外定向誘導(dǎo)第5代～10代rMSC,結(jié)果發(fā)現(xiàn)細胞突起伸出,形似神經(jīng)元,免疫組化同樣顯示誘導(dǎo)出的神經(jīng)元樣細胞NSE、NF、巢蛋白表達陽性,GFAP陰性。神經(jīng)元樣細胞計數(shù)分析發(fā)現(xiàn)MSC經(jīng)Mu-p誘導(dǎo)后,NSE和NF-H陽性細胞的比例分別高93.5%和88.2%。而含Mu-n的培養(yǎng)基卻無上述變化。表明Mu-p能在體外誘導(dǎo)rMSC定向分化為神經(jīng)元樣細胞,而Mu-n卻無此能力。研究中所誘導(dǎo)得到的神經(jīng)元樣細胞可在體外存活時間較長(7 d后仍有約10%的神經(jīng)元存活)。同時應(yīng)用所獲得的神經(jīng)細胞進行了大鼠脊髓橫斷性損傷和大鼠帕金森病的細胞替代治療發(fā)現(xiàn)其可重建相應(yīng)的神經(jīng)功能,證明其在體內(nèi)發(fā)揮了相應(yīng)的神經(jīng)細胞功能,因此推測研究中所獲得的神經(jīng)元樣細胞極有可能是有功能的神經(jīng)元。Mu-p的誘導(dǎo)機制可能與其對神經(jīng)細胞生長分化和突起生長的調(diào)節(jié)作用以及其具有抗氧化、抗損傷作用有關(guān)。黃潔等[25]采用血清藥理學(xué)方法,從體外實驗證實牛珀至寶微丸含藥血清體外誘導(dǎo)成年大鼠MSC分化為神經(jīng)元。牛珀至寶微丸系由中醫(yī)急癥三寶之一的至寶丹化裁而來,主要藥物為水牛角、玳瑁、麝香、琥珀、血竭、藏紅花、大黃、石菖蒲等。

5 小結(jié)與展望

MSCs體外誘導(dǎo)向神經(jīng)細胞分化,國外研究較多使用的是2-硫基乙醇、二甲亞砜、硫代甘油等作為誘導(dǎo)劑,但這些化學(xué)制劑均有一定毒性,不適宜應(yīng)用于人體內(nèi),利用經(jīng)臨床驗證的傳統(tǒng)中藥作為誘導(dǎo)劑,具有價廉、安全等優(yōu)點,可望成為今后臨床神經(jīng)細胞移植安全有效的誘導(dǎo)分化劑。但中藥誘導(dǎo)MSCs向神經(jīng)元樣細胞分化研究中,尚有許多問題有待解決。如有關(guān)中藥誘導(dǎo)劑的研究并沒有報道其對MSCs誘導(dǎo)后的存活率情況,只是報道了誘導(dǎo)出的細胞表達了神經(jīng)元的標志;而且大部分研究都沒有對誘導(dǎo)后細胞的功能進行檢測,能否有效的刺激宿主細胞分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子,促進神經(jīng)損傷功能的恢復(fù)都需要進一步研究。雖然目前使用中藥誘導(dǎo)干細胞定向分化的研究工作才剛剛起步,其誘導(dǎo)機制也有待進一步深入研究。但中藥誘導(dǎo)干細胞定向分化技術(shù)無疑將推動醫(yī)學(xué)界一場新的革命,推動中醫(yī)藥要走向世界,走向現(xiàn)代化。

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