基因芯片技術(shù)在中醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用研究

曹 健，周美啟，楊 影

（安徽中醫(yī)學(xué)院，安徽合肥 230038）

基因芯片技術(shù)是一項(xiàng)融分子生物學(xué)、半導(dǎo)體微電子、激光、化學(xué)染料、生物住處學(xué)等領(lǐng)域各項(xiàng)技術(shù)，一次微排列實(shí)驗(yàn)可對(duì)上千種基因的表達(dá)水平、突變和多態(tài)性進(jìn)行快速、準(zhǔn)確檢測(cè)的高新技術(shù)，主要包括芯片制備、樣品制備、雜交反應(yīng)、信號(hào)檢測(cè)和結(jié)果分析4個(gè)主要步驟，是當(dāng)今微觀整體研究的一項(xiàng)最新技術(shù)。目前，基因芯片技術(shù)主要應(yīng)用于基因表達(dá)譜分析、新基因發(fā)現(xiàn)、基因突變及多態(tài)性分析、基因組文庫作圖、疾病診斷和預(yù)測(cè)、藥物篩選、基因測(cè)序等領(lǐng)域?；蛐酒娘w速發(fā)展引起世界各國的廣泛關(guān)注和重視。近年來，應(yīng)用基因芯片技術(shù)在尋找中醫(yī)證候的基因組、探索針灸作用機(jī)制以及研究中藥療效的基因表達(dá)譜方面取得了一定的成果。

1 應(yīng)用基因芯片技術(shù)探討中醫(yī)證候的本質(zhì)

中醫(yī)證候是中醫(yī)藥研究的核心，證候本質(zhì)的研究是中醫(yī)現(xiàn)代化研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)，如能獲得突破性進(jìn)展，必將使中醫(yī)理論研究取得質(zhì)的飛躍。應(yīng)用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論和分子生物學(xué)技術(shù)闡明中醫(yī)證候本質(zhì)是實(shí)現(xiàn)中醫(yī)藥現(xiàn)代化的基礎(chǔ)和關(guān)鍵，具有重大科學(xué)意義。中醫(yī)藥在功能基因調(diào)控方面具有潛在的優(yōu)勢(shì)[1]，通過對(duì)足夠數(shù)量的同一病位或病性患者的基因表達(dá)進(jìn)行分析，建立辨證要素的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫，再相互組合便可建立證型基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫，以此可作為辨證的客觀規(guī)范化標(biāo)準(zhǔn)。

楊裕華等[2]應(yīng)用基因芯片檢測(cè)了“勞倦過度、房室不節(jié)”腎陽虛小鼠模型腦基因的改變情況，研究結(jié)果提示，腎陽虛模型小鼠基因表達(dá)改變涉及生長激素、泌乳素、促性腺激素、黑色素和腦脂肪酸結(jié)合蛋白（B-FABP）相關(guān)基因；炎癥/免疫、促細(xì)胞凋亡相關(guān)基因以及影響多巴胺生成的限速酶、影響凝血纖溶機(jī)制和精子發(fā)育代謝的相關(guān)基因。宋潔等[3]觀察了“勞倦過度、房室不節(jié)”腎陽虛小鼠模型睪丸基因的改變，共篩選出差異表達(dá)基因5 505個(gè)，其中上調(diào)2 425個(gè)，下調(diào)3 080個(gè)。上調(diào)基因前百位中已知基因41個(gè)，下調(diào)基因前百位中已知基因62個(gè)，主要涉及細(xì)胞結(jié)構(gòu)/功能、物質(zhì)/能量代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)/傳遞、炎癥/免疫、細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)錄/翻譯、增殖/分化及細(xì)胞周期等。潘志強(qiáng)等[4]探索絲裂原激活蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路基因在不同證候H22 肝癌荷瘤小鼠腎上腺中的表達(dá)特征，結(jié)果提示，不同證候肝癌小鼠的腎上腺組織主動(dòng)參與了MAPK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。楊麗萍等[5]則利用基因芯片數(shù)據(jù)挖掘的最新技術(shù)手段——基因功能模塊，從功能模塊水平研究虛寒證發(fā)生的分子機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用25個(gè)差異基因分類樣本準(zhǔn)確率為93%，用11個(gè)功能模塊分類樣本準(zhǔn)確率為87%～100%。認(rèn)為基于特征功能模塊法研究基因表達(dá)譜更有利于對(duì)疾病的闡釋。

2 應(yīng)用基因芯片技術(shù)探討針灸的作用機(jī)制

針灸以其明顯的臨床療效已在世界范圍內(nèi)被廣泛認(rèn)可，而基因芯片技術(shù)是建立在基因探針和雜交測(cè)序技術(shù)上的一種高效快速的核酸序列分析手段，可以在一次試驗(yàn)中同時(shí)對(duì)成千上萬個(gè)基因進(jìn)行分析。針刺既然可引起人體多系統(tǒng)、多功能的同步變化，因此可以設(shè)想，通過觀察不同穴位、刺激方法、頻率、強(qiáng)度等，導(dǎo)致有關(guān)組織基因轉(zhuǎn)錄的差異，從而在分子水平全面而深刻地反映其廣泛的作用途徑和治療靶點(diǎn)，探明針刺的作用機(jī)制，體現(xiàn)針灸的整體調(diào)節(jié)作用，完善針灸理論，為臨床治療提供依據(jù)和指導(dǎo)。

筆者在既往的實(shí)驗(yàn)中，采用結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支法復(fù)制大鼠急性心肌梗死模型，比較肺經(jīng)組與模型組、心經(jīng)組與模型組、小腸經(jīng)組與模型組的下丘腦基因表達(dá)譜變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，肺經(jīng)組中大于2倍的差異表達(dá)基因（包括EST）有26個(gè)下調(diào)和57個(gè)上調(diào)，心經(jīng)組中有34個(gè)下調(diào)和190個(gè)上調(diào)，小腸經(jīng)組中有97個(gè)下調(diào)和122個(gè)上調(diào)。就大于2倍的表達(dá)基因而言，僅僅在心經(jīng)組和小腸經(jīng)組出現(xiàn)促甲狀腺激素釋放激素（TRH）基因表達(dá)明顯上調(diào)和促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（CRH）基因表達(dá)明顯下調(diào)。認(rèn)為下丘腦差異表達(dá)基因，特別是TRH和CRH 基因表達(dá)，可能參與了電針心經(jīng)、小腸經(jīng)對(duì)急性心肌缺血的保護(hù)作用[6-8]。曲怡等[9]應(yīng)用基因芯片技術(shù)研究電針對(duì)局灶性腦缺血-再灌注大鼠腦組織基因表達(dá)譜的影響，研究結(jié)果表明，篩選出的差異表達(dá)基因可能參與腦缺血-再灌注后腦損傷的發(fā)生及發(fā)展過程，并參與了針灸抗損傷的機(jī)制。江勵(lì)華等[10]采用基因芯片技術(shù)觀察了電針治療抑郁癥的機(jī)制，結(jié)果表明，電針治療抑郁癥的機(jī)制與調(diào)控凝血、免疫、炎癥反應(yīng)和凋亡等相關(guān)的基因表達(dá)有關(guān)。

3 應(yīng)用基因芯片技術(shù)探究中藥作用機(jī)制

中藥由于所含有效成分復(fù)雜、作用靶點(diǎn)不明確、重現(xiàn)性差，難以用現(xiàn)行生物醫(yī)學(xué)理論解釋，嚴(yán)重地制約了中藥的現(xiàn)代化發(fā)展?；蛐酒鳛橐环N高通量、大規(guī)模研究基因功能的新技術(shù)，能夠從基因表達(dá)水平上闡明中醫(yī)藥治病的機(jī)制。伴隨后基因組時(shí)代的來臨，基因芯片技術(shù)平臺(tái)可以將中藥的藥性、功能及主治與其對(duì)特定模型細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)和調(diào)控的影響關(guān)聯(lián)起來，在分子水平上用現(xiàn)代基因組學(xué)的理論來解釋傳統(tǒng)中藥理論及作用機(jī)制。

3.1 中藥單方研究

李昊等[11]應(yīng)用基因芯片研究藤梨根對(duì)胃癌細(xì)胞的作用，結(jié)果表明，ERBB2、TRAILR2、p53、TNF、Cyclin E 基因的表達(dá)改變可能與藤梨根殺傷和誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡有關(guān)。于華蕓等[12]利用基因芯片技術(shù)研究寒性中藥黃連對(duì)正常大鼠肝臟全基因表達(dá)譜的影響，結(jié)果提示，黃連可上調(diào)炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、防御反應(yīng)相關(guān)基因，增強(qiáng)抗感染、防御能力，調(diào)控代謝、凋亡相關(guān)基因，影響P450 家族成員，發(fā)揮代謝抑制、抗感染作用。其后，于華蕓等[13]又利用基因芯片技術(shù)探討大黃“清熱瀉火解毒”作用的分子機(jī)制，結(jié)果表明，調(diào)控機(jī)體防御反應(yīng)、花生四烯酸代謝相關(guān)基因表達(dá)，可能是大黃發(fā)揮“清熱瀉火解毒”作用的分子機(jī)制之一。

3.2 中藥復(fù)方研究

毛秉豫等[14]觀察加味四物湯對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）的心肌組織基因表達(dá)譜的影響。結(jié)果表明，陽性基因重疊有18 條，其中高表達(dá)的基因有4 條，低表達(dá)的有14 條。該方作用靶點(diǎn)較多，可上調(diào)或下調(diào)SHR 的某些與生物酶、血管活性物質(zhì)、心肌纖維化、脂肪酸代謝有關(guān)基因的表達(dá)，這可能是其產(chǎn)生藥理作用的重要因素。王剛等[15]利用基因芯片技術(shù)對(duì)復(fù)方丹參滴丸對(duì)心肌梗死大鼠基因表達(dá)的影響進(jìn)行評(píng)價(jià)和研究，基因芯片結(jié)果表明，復(fù)方丹參滴丸可通過調(diào)節(jié)Wnt 信號(hào)通路等多個(gè)基因和信號(hào)途徑來減少心肌梗死模型大鼠心臟缺血區(qū)的心肌損傷。袁丁等[16]觀察中藥復(fù)方小金丹對(duì)人肝癌細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因表達(dá)的影響，結(jié)果表明，小金丹能顯著影響SMMC-7721 細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因表達(dá)。

3.3 中藥有效成分研究

呂純芳等[17]應(yīng)用基因芯片研究藏花素對(duì)膀胱移行細(xì)胞癌T24 細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3 mmol/L 藏花素作用于T24 細(xì)胞48h 引起該細(xì)胞系基因表達(dá)譜的廣泛改變，其中表達(dá)差異2倍以上的基因共836個(gè)，這些差異表達(dá)基因的功能涉及多個(gè)方面，最為明顯的是與細(xì)胞生長調(diào)節(jié)相關(guān)的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因、細(xì)胞凋亡調(diào)控基因、DNA 復(fù)制相關(guān)基因等類型。譚敏等[18]觀察補(bǔ)骨脂素對(duì)人乳腺癌MCF-7（ER陽性）細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響。結(jié)果顯示，經(jīng)補(bǔ)骨脂素作用的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞樣本與對(duì)照組細(xì)胞樣本比較，呈現(xiàn)差異表達(dá)的基因有1 113個(gè)。其中，表達(dá)上調(diào)的有456個(gè)，表達(dá)下調(diào)的有657個(gè)。差異表達(dá)明顯的基因主要與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控、核酸轉(zhuǎn)譯調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)譯因子活性、核苷酸轉(zhuǎn)移酶活性、血管收縮調(diào)節(jié)等有關(guān)。黃杉等[19]應(yīng)用基因芯片技術(shù)研究黃芩素對(duì)白色念珠菌基因表達(dá)譜的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，共有522個(gè)差異表達(dá)基因，其中，上調(diào)基因251個(gè)，下調(diào)基因271個(gè)。差異基因功能主要涉及細(xì)胞周期、跨膜物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、多藥耐藥、毒力因子及熱休克蛋白等。

4 小結(jié)

從基因概念的提出到人類基因組學(xué)計(jì)劃的完成，基因芯片相關(guān)技術(shù)得到了飛速的發(fā)展。目前，基因芯片技術(shù)以其具有高通量、簡便、微縮、集約化、平行化等優(yōu)點(diǎn)，而廣泛應(yīng)用于中醫(yī)藥領(lǐng)域，主要體現(xiàn)在：中醫(yī)證候、中藥藥效及藥理學(xué)研究、中藥有效成分篩選研究、中藥毒性及不良反應(yīng)研究等方面，在基因組學(xué)與中醫(yī)藥學(xué)研究之間架起了一座橋梁，為中醫(yī)藥客觀化、定量化、標(biāo)準(zhǔn)化研究提供了技術(shù)上的保證。雖然基因芯片技術(shù)費(fèi)用相對(duì)昂貴，部分芯片特異性相對(duì)較低等局限了其在中醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用，但仍有其廣闊的發(fā)展和應(yīng)用前景。

[1]沈自尹.基因科學(xué)和21 世紀(jì)中醫(yī)藥學(xué)的走向[J].上海中醫(yī)藥雜志,2000,(10):7-9.

[2]楊裕華,李震.“勞倦過度、房室不節(jié)”腎陽虛小鼠模型腦基因芯片研究[J].中華中醫(yī)藥雜志,2008,23(5):396-401.

[3]宋潔,李震,張丹,等.“勞倦過度、房室不節(jié)”腎陽虛小鼠模型睪丸基因芯片研究[J].中華中醫(yī)藥雜志,2010,25(2):213-216.

[4]潘志強(qiáng),方肇勤,盧文麗,等.基于芯片數(shù)據(jù)分析絲裂原激活蛋白激酶信號(hào)通路基因在不同證候H22 肝癌小鼠腎上腺的表達(dá)差異[J].中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志,2009,19(1):27-31.

[5]楊麗萍,黃睿,張洛欣,等.用特征功能模塊法挖掘一個(gè)虛寒證家系的基因表達(dá)譜[J].中華中醫(yī)藥雜志,2010,25(5):683-685.

[6]周美啟,周逸平,汪克明,等.針刺小腸經(jīng)干預(yù)急性心肌缺血大鼠心臟基因表達(dá)譜研究[J].中國中醫(yī)急癥,2006,15(5):513-515.

[7]周美啟,周逸平,汪克明,等.針刺心經(jīng)干預(yù)急性心肌缺血大鼠心臟基因表達(dá)譜研究[J].中國針灸,2006,26(8):587-594.

[8]周美啟,周逸平,汪克明,等.針刺心經(jīng)、小腸經(jīng)干預(yù)急性心肌缺血下丘腦基因表達(dá)[J].安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2007,26(2):18-21.

[9]曲怡,張立德,才麗平,等.電針督脈穴對(duì)局灶性腦缺血-再灌注大鼠大腦基因表達(dá)譜的影響[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2009,27(1):218-220.

[10]江勵(lì)華,王玲玲.電針治療抑郁癥的全基因組表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)分析[J].針刺研究,2010,35(2):83-89.

[11]李昊,楊慧萍,魯小青.應(yīng)用基因芯片研究藤梨根對(duì)胃癌細(xì)胞的作用[J].同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2010,31(1):45-52.

[12]于華蕓,吳智春,馬清翠,等.黃連對(duì)大鼠肝臟全基因表達(dá)譜的影響[J].山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2010,34(4):291-295.

[13]于華蕓,王世軍,季旭明,等.基因芯片技術(shù)研究大黃“清熱瀉火解毒”作用機(jī)制[J].世界中西醫(yī)結(jié)合雜志,2010,5(7):572-575.

[14]毛秉豫,郭志軍,康立源,等.加味四物湯對(duì)SHR 心肌組織基因表達(dá)譜的影響[J].南陽理工學(xué)院學(xué)報(bào),2009,1(1):76-81.

[15]王剛,崔佩佩,宋生有,等.復(fù)方丹參滴丸對(duì)急性心肌梗死大鼠基因表達(dá)譜的影響[J].藥物評(píng)價(jià)研究,2010,33(2):98-102.

[16]袁丁,謝佐福,魏莉,等.基因芯片研究小金丹對(duì)人肝癌細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因表達(dá)的影響[J].福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2010,44(2):107-111.

[17]呂純芳,羅春麗,冀慧瑩,等.藏花素對(duì)膀胱移行細(xì)胞癌T24 細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響[J].中國中藥雜志,2008,33(13):1612-1617.

[18]譚敏,賓曉農(nóng),肖剛,等.補(bǔ)骨脂素對(duì)乳腺癌MCF-7 細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響[J].腫瘤防治研究,2009,36(12):1008-1012.

[19]黃杉,孫建英,曹穎瑛,等.黃芩素對(duì)白色念珠菌基因表達(dá)譜的影響[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2010,31(7):796-799.