茶樹(shù)基因組DNA測(cè)試方法概述

譚和平，沈興中，唐祥凱，葉德萍，王 智

（中國(guó)測(cè)試技術(shù)研究院，四川 成都 610021）

1 引 言

核酸是生物體遺傳信息的載體，是最重要的生物信息分子，它控制著蛋白質(zhì)的合成和有機(jī)體細(xì)胞的機(jī)能，在生物的生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖、遺傳和變異等生命活動(dòng)中占有極其重要的地位，針對(duì)茶樹(shù)遺傳的研究歸根結(jié)底還是DNA分子水平，該文就目前茶樹(shù)基因組DNA的主要測(cè)試方法概述如下。

2 DNA提取純化技術(shù)

由于茶樹(shù)富含多酚類(lèi)等次生代謝產(chǎn)物，DNA提取過(guò)程中這些產(chǎn)物極易發(fā)生氧化，且易與DNA形成復(fù)合物，難以獲得高質(zhì)量的DNA。按目前一般植物常用的DNA提取法提取茶樹(shù)DNA，由于沒(méi)有進(jìn)行多酚類(lèi)化合物的處理使得DNA色素含量較高，難以滿(mǎn)足后續(xù)DNA分析的純度要求[1-2]，為此許多文獻(xiàn)對(duì)茶樹(shù)基因組DNA提取方法進(jìn)行了探討和改良，主要有CTAB法和SDS法兩種，它們都在防止多酚類(lèi)物質(zhì)氧化、去除色素類(lèi)物質(zhì)方面進(jìn)行了改良，主要集中在樣品的研磨過(guò)程、抗氧化劑等的選擇方面。

2.1 SDS法

朱旗[1]等將茶樹(shù)葉片進(jìn)行液氮冷凍，然后搗碎成粉末，并嘗試在研磨過(guò)程和DNA粗品純化時(shí)加入聚乙烯吡咯烷酮PVP去除多酚類(lèi)化合物以減少色素物質(zhì)，結(jié)果顯示得到了較高質(zhì)量的DNA，認(rèn)為PVP能顯著降低色素的含量，提高茶樹(shù)DNA的純度。但是有文獻(xiàn)顯示茶樹(shù)葉片經(jīng)過(guò)液氮冷凍處理后，使得部分茶樹(shù)細(xì)胞核破裂，DNA的降解程度較嚴(yán)重，影響提取的DNA質(zhì)量[3]，且在研磨過(guò)程中茶樹(shù)葉片細(xì)胞中的多酚類(lèi)物質(zhì)還是會(huì)不同程度地發(fā)生氧化褐變[4-5]。后來(lái)經(jīng)過(guò)改進(jìn)，普遍采用將茶樹(shù)葉片置于研缽中加入液氮研磨的方式，同時(shí)添加PVP和一些抗氧化劑如β-巰基乙醇。羅軍武[6]等設(shè)計(jì)并比較了茶樹(shù)基因組DNA提取純化的6種方案，主要研究了PVP、液氮以及抽提液飽和酚/氯仿/異戊醇對(duì)茶樹(shù)基因組DNA提取質(zhì)量的影響，經(jīng)過(guò)比較得出研磨過(guò)程中加入液氮和PVP，提取和純化過(guò)程中各用飽和酚/氯仿/異戊醇提取一次最后得到的DNA質(zhì)量最好。譚和平[4]等提出在研磨過(guò)程中除加入PVP和抗氧化劑β-巰基乙醇之外并協(xié)同加入Vc，有助于阻止酚類(lèi)物質(zhì)的氧化，其最適宜添加濃度為Vc 0.05g/g鮮樣。

2.2 CTAB法

高峻[7]等采用改進(jìn)的CTAB微量提取法，提取液中加入β-巰基乙醇，直接將茶樹(shù)嫩葉剪碎后進(jìn)行提取，沒(méi)有經(jīng)過(guò)液氮處理，也沒(méi)有進(jìn)行研磨，結(jié)果顯示得到了質(zhì)量較高的DNA。袁長(zhǎng)春[8]等提出液氮研磨過(guò)程和保溫過(guò)程是影響DNA提取質(zhì)量的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，經(jīng)過(guò)改良認(rèn)為液氮的加入量約為2/5研缽體積，研磨時(shí)間約為20～30 min，60℃水浴保溫1.5 h為宜。Mahipal Singh[9]等用CTAB法，提取市場(chǎng)上購(gòu)回的干茶樣DNA，效果也不錯(cuò)。黃建安[10]等采用了改良的CTAB和SDS兩類(lèi)方法都獲得了較高質(zhì)量的DNA。

2.3 其他方法

梁月榮[11]等采用植物DNA提取試劑盒（Amershan公司產(chǎn)品）提取得到了質(zhì)量較好的茶樹(shù)基因組DNA。但是一般的植物DNA提取試劑盒由于缺乏多酚類(lèi)化合物的處理步驟，所提取的茶樹(shù)基因組DNA顏色黃褐，得率低，純度差，不符合后續(xù)的分析要求。

3 DNA濃度定量技術(shù)

3.1 紫外分光光度法

紫外分光光度法利用核酸在260 nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰的特點(diǎn)，通過(guò)檢測(cè)DNA在該波長(zhǎng)的吸光值，從而對(duì)核酸進(jìn)行直接定量。但該法并不可靠，要求DNA有相當(dāng)高的純度，因?yàn)楹怂針悠分械牡鞍踪|(zhì)等雜質(zhì)對(duì)核酸的定量有較大影響[12]。

近年來(lái)，通過(guò)對(duì)小分子與DNA相互作用的光譜特性的研究，建立了測(cè)定DNA含量的紫外吸收光譜新方法，即通過(guò)測(cè)定小分子與DNA相互作用的吸收光譜，對(duì)DNA進(jìn)行定量，這類(lèi)小分子有釕聯(lián)吡啶配合物[13]、結(jié)晶紫[14]、維多利亞藍(lán)[15]、燦爛綠[16]、生物染色劑燦爛甲酚藍(lán)[17]和天青Ι[18]等。

3.2 熒光分析法

熒光分析法是利用DNA對(duì)小分子熒光探針的熒光強(qiáng)度的改變從而測(cè)定DNA的含量，該法操作簡(jiǎn)便且靈敏度高，重現(xiàn)性好，取樣量少。按原理又分為熒光淬滅測(cè)定法、體系能量轉(zhuǎn)移測(cè)定法、熒光增強(qiáng)測(cè)定法[19]等。

3.3 基于PCR的核酸定量方法

基于PCR技術(shù)的原理，現(xiàn)主要有以下幾種核酸定量方法，包括終點(diǎn)稀釋法、套式PCR、競(jìng)爭(zhēng)PCR、PCR產(chǎn)物微孔板雜交法、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法等[20]。其中實(shí)時(shí)熒光定量PCR法特異性強(qiáng)，靈敏度高，是檢測(cè)生物樣品中微量DNA最現(xiàn)成的方法。

該方法整個(gè)過(guò)程可以實(shí)時(shí)觀(guān)測(cè)，其原理是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)的累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)未知DNA模板進(jìn)行相對(duì)定量和絕對(duì)定量，按原理又分為T(mén)aqMan探針?lè)ê蚐YBR Green I熒光染料法。TaqMan探針?lè)ㄌ砑恿艘粭l5′端帶有熒光基團(tuán)、3′端帶有淬滅基團(tuán)的熒光探針，當(dāng)探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)受到淬滅基團(tuán)的制約，不能發(fā)出熒光。探針被分解后，5′端的熒光物質(zhì)便游離出來(lái)，發(fā)出熒光。所釋放的熒光基團(tuán)數(shù)和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)是一對(duì)一的關(guān)系，由此可對(duì)模板進(jìn)行準(zhǔn)確定量。該法在原理上更為嚴(yán)格，所得數(shù)據(jù)更為準(zhǔn)確，但由于采用熒光淬滅及雙末端標(biāo)記技術(shù)，淬滅難以徹底，本底較高而采用酶外切活性，因此定量時(shí)易受酶活性影響。SYBR Green I熒光染料法是SYBR Green I與雙鏈DNA結(jié)合后發(fā)出熒光，熒光信號(hào)強(qiáng)度代表了雙鏈DNA的分子數(shù)，通過(guò)檢測(cè)反應(yīng)體系中的熒光強(qiáng)度，對(duì)DNA進(jìn)行定量，可在PCR反應(yīng)處于指數(shù)期的某一點(diǎn)上來(lái)檢測(cè)PCR產(chǎn)物量，并且由此來(lái)推斷模板最初含量，這種方法成本更為低廉，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)更為簡(jiǎn)便。

3.4 電化學(xué)分析法

電化學(xué)發(fā)光分析法是近幾年來(lái)興起的一種DNA定量方法，是利用DNA與絡(luò)合物作用后生成新的絡(luò)合物從而導(dǎo)致絡(luò)合物峰電流下降，且峰電流或其減小值在一定范圍內(nèi)與DNA濃度成線(xiàn)性關(guān)系而建立的。原理是對(duì)電極施加一定的電壓進(jìn)行電化學(xué)反應(yīng)，反應(yīng)的產(chǎn)物之間或與體系中的某種組分進(jìn)行化學(xué)發(fā)光，用普通光學(xué)手段測(cè)量發(fā)光光譜和強(qiáng)度，對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定量的一種微量分析強(qiáng)度，從而對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定量的一種微量分析方法，具有靈敏、快速、準(zhǔn)確和分析適應(yīng)性廣等特點(diǎn)的一種技術(shù)。

3.5 其他方法

此外，還有其他一些方法，如化學(xué)放光分析法、共振瑞利散射法、高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法等。

4 分子標(biāo)記技術(shù)

分子標(biāo)記技術(shù)具有客觀(guān)、準(zhǔn)確、快速的特點(diǎn)，是繼形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞標(biāo)記和生化標(biāo)記之后發(fā)展起來(lái)的一種較為理想的遺傳標(biāo)記形式，能對(duì)不同發(fā)育時(shí)期的個(gè)體、任何組織器官甚至細(xì)胞作檢測(cè)，數(shù)量極多，遍及整個(gè)基因組，多態(tài)性高，遺傳穩(wěn)定，不受環(huán)境及基因表達(dá)與否的限制[21-22]。目前運(yùn)用于茶樹(shù)的分子標(biāo)記方法主要有 RAPD、AFLP、SSR、ISSR 等[23]。

4.1 RAPD標(biāo)記技術(shù)

RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA）即隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA技術(shù)，是目前運(yùn)用最普遍的一種分子標(biāo)記技術(shù)。原理是用一系列具有10個(gè)左右堿基的單鏈隨機(jī)引物，對(duì)基因組的DNA全部進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以檢測(cè)多態(tài)性。該技術(shù)原理簡(jiǎn)單，引物設(shè)計(jì)簡(jiǎn)便，用一個(gè)引物就可擴(kuò)增出許多片段，實(shí)驗(yàn)周期短，能在較短的時(shí)間篩選大量樣品，成本低，而且不需要同位素，安全性好，適用于自動(dòng)化操作分析，但它是顯性標(biāo)記，不能識(shí)別雜合子位點(diǎn)，且多態(tài)性水平較低，實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性和重復(fù)性差[24]。一些研究者[4，7，11，25-26]先后利用RAPD技術(shù)對(duì)茶樹(shù)品種的遺傳多樣性、種質(zhì)資源等方面進(jìn)行了研究，表明RAPD可以作為茶樹(shù)優(yōu)異種質(zhì)資源遺傳多態(tài)性、系統(tǒng)演化和分子鑒別研究的有效手段之一。

4.2 AFLP標(biāo)記技術(shù)

AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism）即擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)。原理是基因組DNA經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶酶切后，產(chǎn)生大小不同的片段，用特定的雙鏈接頭與酶切DNA片段連接作為模板，用含選擇性堿基的引物對(duì)模板DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以此來(lái)檢測(cè)多態(tài)性。

該技術(shù)揭示的多態(tài)性高，理論上可產(chǎn)生無(wú)限多的AFLP標(biāo)記，重復(fù)性好，但是對(duì)DNA模板質(zhì)量要求高，且操作過(guò)程復(fù)雜，技術(shù)難度大，成本高。近幾年AFLP在茶樹(shù)中也有了較多的應(yīng)用[27-28]。

4.3 SSR標(biāo)記技術(shù)

SSR（Simple Sequence Repeat）即簡(jiǎn)單重復(fù)序列標(biāo)記技術(shù)。原理根據(jù)微衛(wèi)星重復(fù)序列兩端的特定短序列設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增微衛(wèi)星片段。由于核心序列重復(fù)數(shù)目不同，因而擴(kuò)增出不同長(zhǎng)度的PCR產(chǎn)物，以此檢測(cè)DNA多態(tài)性。

該技術(shù)操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，不僅能夠鑒定純合體和雜合體，而且結(jié)果更加可靠，但引物具有物種特異性，開(kāi)發(fā)引物需要了解基因組的序列信息。近幾年SSR在茶樹(shù)中也有了較多的應(yīng)用[29-30]。

4.4 ISSR標(biāo)記技術(shù)

ISSR（Inter-simple Sequence Repeat）即內(nèi)部簡(jiǎn)單重復(fù)序列標(biāo)記技術(shù)。原理利用生物基因組常出現(xiàn)的SSR本身設(shè)計(jì)引物，保證引物與基因組DNA中SSR的5′或3′末端結(jié)合，通過(guò)PCR反應(yīng)使位于反向排列、間隔不太大的重復(fù)序列間的DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增。

該技術(shù)操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，揭示的多態(tài)性好，成本低，引物通用性強(qiáng)，不需要預(yù)先的DNA測(cè)序，可以提供豐富的基因組信息，通常為顯性標(biāo)記，呈孟德?tīng)柺竭z傳，且具有很好的穩(wěn)定性。

5 結(jié)束語(yǔ)

目前茶樹(shù)相關(guān)研究中還缺乏分子水平上的測(cè)試方法標(biāo)準(zhǔn)，其中茶樹(shù)DNA提取是茶樹(shù)分子水平研究中最基礎(chǔ)的工作，也是最關(guān)鍵的一步，所提DNA質(zhì)量好壞是后續(xù)濃度測(cè)定、分子標(biāo)記成功與否的關(guān)鍵，所以盡快建立一套完整的適合茶樹(shù)DNA提取、純化流程，可以為后面的茶樹(shù)分子水平測(cè)試奠定良好基礎(chǔ)。其次分子標(biāo)記技術(shù)在茶樹(shù)中的應(yīng)用尚未成熟，今后應(yīng)通過(guò)方法學(xué)原理對(duì)分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行考察，評(píng)價(jià)不同標(biāo)記方法對(duì)茶樹(shù)基因組的適用性，指導(dǎo)今后茶樹(shù)的相關(guān)研究。

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