單純皰疹病毒實(shí)驗(yàn)室檢測方法的研究進(jìn)展

賴迪輝綜述 朱 威 連 石審校

單純皰疹病毒(HSV)感染是由 HSV侵犯皮膚黏膜,引起炎癥、水皰、糜爛、潰瘍性病變的一種疾病,根據(jù)抗原性不同,可將 HSV分為 HSV 1型和 HSV 2型,兩者雖有約 50%的基因同源性,但 HSV1主要引起腰以上部位,如眼、口、唇的皮膚黏膜以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的感染[1]。HSV 2主要引起生殖器部位的皮膚黏膜及新生兒感染,并與女性外陰癌和宮頸癌的發(fā)生有關(guān)[2]。HSV2外生殖器感染是發(fā)病率僅次于人免疫缺陷病毒(HIV)感染的性傳播疾病,已引起了醫(yī)學(xué)界的高度重視[3,4]。近年來,由 HSV 1型引起的生殖器皰疹及 HSV亞臨床感染或隱性感染有增多趨勢,并且HSV兩種亞型感染的預(yù)后和處理方法不同,復(fù)發(fā)頻率亦有差異[5],HSV1感染引發(fā)的生殖器皰疹癥狀較輕,易于治療。而 HSV2感染發(fā)作時(shí)的癥狀一般是生殖器周圍出現(xiàn)疼痛性皮膚皰疹損害,并容易復(fù)發(fā)。當(dāng)需要與其他生殖器潰瘍性疾病,如非感染性或感染性龜頭炎、宮頸炎、梅毒等進(jìn)行鑒別診斷時(shí),實(shí)驗(yàn)室證據(jù)非常重要。因此對 HSV感染進(jìn)行診斷和分型具有重要的臨床意義和流行病學(xué)意義。本文對HSV的病毒細(xì)胞培養(yǎng)、抗原檢測、抗體檢測及分子生物學(xué)檢測等目前實(shí)驗(yàn)室常用診斷與分型方法及新進(jìn)展作一綜述。

一、病毒細(xì)胞培養(yǎng)

病毒細(xì)胞分離培養(yǎng)是實(shí)驗(yàn)室診斷 HSV感染最為敏感的方法,并可對其分離株進(jìn)行分型。細(xì)胞培養(yǎng)是以組織活細(xì)胞為宿主,使活病毒得到擴(kuò)增,引起細(xì)胞病變。雖然目前細(xì)胞培養(yǎng)被廣泛當(dāng)作是金標(biāo)準(zhǔn)[6],但因其實(shí)驗(yàn)條件要求嚴(yán)格、成本高、操作繁瑣、周期長等原因,一般只用作科研或流行病學(xué)調(diào)查,而在臨床常規(guī)應(yīng)用有很大的局限性,不易開展。

二、HSV抗原檢測

臨床上常用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)法進(jìn)行皮損處標(biāo)本的 HSV抗原檢測,由于典型病例可表現(xiàn)為集簇性水皰、膿皰、潰瘍、結(jié)痂、皸裂、毛囊炎、非特異性紅斑等,取標(biāo)本時(shí)用棉拭子吸取水皰液;潰瘍?nèi)円夯驖B出液;結(jié)痂取痂皮;丘疹、紅斑用鈍刀刮取組織滲出液;皸裂用棉拭子用力擦拭取滲出液[7],然后可以采用雙抗體夾心法(雙次酶免反應(yīng)放大技術(shù))檢測抗原,以同時(shí)檢測HSV1型和 HSV 2型。國外研究表明,其敏感性為 93.7%,特異性為 97.9%[8]。

張俊等[7]報(bào)道 ELISA法檢測不同類型的皮損,HSV抗原檢出率有差異,水皰、潰瘍、結(jié)痂、丘疹紅斑和皸裂的 HSV抗原檢出率分別為 83.7%、66.3%、34.6%、12.9%和 12.6%?？梢钥闯龅湫桶捳钇p的 HSV抗原檢出率較高,而皰疹后期皮損的HSV抗原檢出率較低。這可能與水皰期發(fā)生于病程的早期,皮損較為新鮮,活動(dòng)的 HSV量多、毒性強(qiáng),而水皰破裂,病毒釋放,皮疹處病毒逐漸減少等因素有關(guān)[9],總體來說,ELISA法檢測HSV抗原的敏感性和特異性較強(qiáng),具有方便、快速(大約 2h左右)等特點(diǎn)[8],適合大批量樣本的檢測,尤其適用于皰疹初期皮損明顯的患者,值得臨床推廣使用,而對于敏感性相對較低的后期皮損標(biāo)本,可以通過選擇抗體檢測或熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(FQ-PCR)加以彌補(bǔ)。

三、HSV血清特異性抗體檢測

HSV原發(fā)感染后,機(jī)體迅速產(chǎn)生特異性免疫力而康復(fù),且無明顯癥狀。但大多數(shù)個(gè)體不能徹底清除病毒,病毒以潛伏狀態(tài)長期存在宿主體內(nèi),而不引起臨床癥狀。當(dāng)宿主機(jī)體抵抗力下降時(shí),潛伏狀態(tài)的病毒被激活,轉(zhuǎn)為增殖性感染,使機(jī)體產(chǎn)生病理性損害。HSV感染后產(chǎn)生的潛伏狀態(tài),使得正常的非發(fā)病人群仍有較高的 HSV抗體陽性率。血液中的抗體在病毒感染后 1周出現(xiàn),3～4周達(dá)高峰,可持續(xù)多年[10]。

據(jù)費(fèi)選文等[10]報(bào)道,正常人的 HSV 2 IgM陽性率為3.3%,HSV 2 IgG陽性率為 41.7%;患者 HSV 2 IgM陽性率為16.2%,HSV2 IgG陽性率為 62.9%。即患者的 HSV 2 IgM與IgG陽性率均高于正常人,其中以 HSV 2 IgM陽性率的差異更具顯著性。報(bào)道還顯示正常人群(包括無癥狀病毒攜帶者及潛伏感染者)的 HSV 2 IgG陽性率也處于較高水平,提示存在著既往感染或病毒潛伏的狀態(tài)。研究認(rèn)為 IgM特異性抗體是HSV2原發(fā)早期感染的指標(biāo),在首次感染后約 2～3d出現(xiàn),一周左右達(dá)到峰值,此后IgM抗體水平維持一段時(shí)間,愈合期則快速下降,在感染 2周左右滴度可下降至檢測不到的水平[11],潛伏期、無癥狀感染及復(fù)發(fā)時(shí)檢測不出 IgM抗體。HSV2 IgG特異性抗體產(chǎn)生于首次感染后 7d左右,2周左右達(dá)到峰值,至愈合期維持平衡。當(dāng) HSV再次感染時(shí)特異性 IgG抗體迅速升高,并于一周內(nèi)達(dá)到峰值,因此 HSV2 IgG是發(fā)現(xiàn)亞臨床無癥狀HSV感染者及復(fù)發(fā)人群最可行的方法,對防止生殖器皰疹的性傳播和母嬰傳播有重要意義。青春期后90%的人群HSV抗體陽性,胎兒與新生兒是否被感染主要取決于母親孕期的感染類型及其免疫狀態(tài),約 75%新生兒的感染是經(jīng)產(chǎn)道由HSV 2型感染引起的。多數(shù) HSV 2型感染孕婦處于亞臨床狀態(tài),很多新生兒HSV感染可以在生后很長時(shí)間才表現(xiàn)出臨床癥狀或處于亞臨床感染,很難早期診斷[12]。因此,早期對孕母進(jìn)行HSV 2 IgG抗體檢測就顯得尤為重要,研究顯示 HSV的隱性感染比有癥狀、體征的感染更常見,單純依靠臨床做出的診斷只能發(fā)現(xiàn) HSV感染病例的 20%左右[13]。有國外學(xué)者通過臨床跟蹤隨訪發(fā)現(xiàn),原來無癥狀或皮損的 HSV 2血清陽性者,75%在一年內(nèi)有了癥狀或出現(xiàn)皮損[14]。另外,對皮損不明顯且 HSV抗原檢測陰性患者,血清HSV特異性抗體檢測是一個(gè)很好的補(bǔ)充。因此通過血清HSV 2特異性抗體檢測,對血清HSV 2抗體陽性者采取行為干預(yù)及治療,對降低HSV傳播的危險(xiǎn)性及復(fù)發(fā)率具有十分重要的意義。HSV血清特異性抗體 IgG和IgM常用ELISA方法進(jìn)行檢測,近年來,HSV 2抗體ELISA診斷方法有了很大的發(fā)展,通過對微孔板進(jìn)行重組糖蛋白 G2(gG2)抗原的包被,檢測的敏感性和特異性有了很大提高[6]。

四、分子生物學(xué)檢測

在分子生物學(xué)檢測中主要應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù),包括多重 PCR、聚合酶鏈反應(yīng)限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)、套式 PCR、PCR-ELISA、PCR產(chǎn)物的微流控芯片技術(shù)、PCR產(chǎn)物的 DNA測序技術(shù)以及多重 FQ-PCR等[5,15～17],這些方法分別存在引物較多、成本高、操作較復(fù)雜、設(shè)備要求較高的缺點(diǎn),因此臨床實(shí)驗(yàn)室檢測比較常用的有常規(guī) PCR、PCR產(chǎn)物的 DNA測序以及 FQ-PCR法。

1.常規(guī)PCR法。常規(guī) PCR方法可以快速檢測標(biāo)本中是否存在特定病毒,但由于病毒的變異性,以及 PCR引物選擇的局限性,PCR反應(yīng)的特異性完全取決于所設(shè)計(jì)的引物,另外,操作時(shí)要開蓋檢測PCR產(chǎn)物,因此在實(shí)踐中可能會(huì)出現(xiàn)假陰性和假陽性的結(jié)果。目前已有逐漸被淘汰的趨勢。

2.PCR產(chǎn)物的DNA測序。PCR擴(kuò)增并測序的方法能夠?qū)?biāo)本中的 HSV進(jìn)行檢測和鑒定。通過測定序列與數(shù)據(jù)庫的比較,確定在標(biāo)本中是否有HSV。根據(jù)序列的差異,很容易區(qū)分病毒的種類及型別[18]。同時(shí),根據(jù)序列比對,也能得知病毒在同種及相近病毒分子進(jìn)化樹中的位置,這對于分析病毒來源和變異等具有重要意義,因此DNA測序用于病毒鑒定和分型,是一種準(zhǔn)確有效的方法。此法在實(shí)驗(yàn)條件及實(shí)驗(yàn)技術(shù)上要求嚴(yán)格,成本也比較高,目前難以在臨床上推廣。

3.FQ-PCR。FQ-PCR是目前比較先進(jìn)的分子生物學(xué)技術(shù),具有特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn),FQ-PCR應(yīng)用熒光探針技術(shù),可以通過光電傳導(dǎo)系統(tǒng)直接探測 PCR擴(kuò)增過程中熒光信號(hào)的變化以獲得定量結(jié)果,所以還具有DNA雜交的高特異性和光譜技術(shù)的高精確性,該技術(shù)已被應(yīng)用于HSV病原體的檢測[5]。FQ-PCR方法通過選擇 HSV1和 HSV2的糖蛋白B基因,設(shè)計(jì)一對通用引物和對應(yīng)的探針組建 2個(gè)FQ-PCR反應(yīng)體系,應(yīng)用克隆的質(zhì)粒建立系列標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,進(jìn)行重復(fù)性和敏感性試驗(yàn),以其他種類的細(xì)菌、病毒、真菌進(jìn)行特異性分析。此法無需開蓋檢測PCR產(chǎn)物,避免了傳統(tǒng) PCR易發(fā)生假陽性污染的缺點(diǎn),增強(qiáng)了特異性和準(zhǔn)確性[19]。陳剛等[20]報(bào)道皮損組織液、生殖道分泌物標(biāo)本中 HSV DNA檢出陽性率分別為 91.5%(75/82)和 24.2%(64/265),說明有典型皮損的患者 HSV DNA的檢出率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于無皮損或皮損不明顯的患者,且在正常人標(biāo)本中均未檢出 HSV DNA,說明該方法檢測特異性強(qiáng)。FQ-PCR可對靶核酸定量,通過連續(xù)測定患者治療過程中分泌物的 HSV DNA值,可為臨床療效觀察提供參考。但標(biāo)本的取材量會(huì)影響到測定的數(shù)值,臨床在分析結(jié)果時(shí)要考慮取材量的影響,FQ-PCR方法從處理標(biāo)本到核酸擴(kuò)增分析所需時(shí)間為 2 h左右,該方法用于 HSV DNA的檢測,能快速、準(zhǔn)確地為臨床提供可靠的病原學(xué)診斷依據(jù),有助于HSV感染的流行病學(xué)和病理機(jī)制的研究。

總之,隨著HSV檢測技術(shù)的不斷深入與完善,將會(huì)有更具優(yōu)勢的HSV檢測技術(shù)出現(xiàn),更好地為臨床診斷及科學(xué)研究服務(wù)。

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