組織工程心臟瓣膜

馬金輝 綜述 李溫斌 審校 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院（北京100029）

組織工程心臟瓣膜

馬金輝 綜述 李溫斌 審校 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院（北京100029）

在心臟外科領(lǐng)域中，人工心臟瓣膜置換術(shù)是治療心臟瓣膜性病變的主要外科治療手段，然而，臨床上可以使用的人工心臟瓣膜存在不同程度的缺陷。隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展，組織工程心臟瓣膜被認(rèn)為是一種潛在的理想的人造瓣膜,具有非常重要的臨床應(yīng)用前景,是目前心臟瓣膜外科領(lǐng)域研究熱點之一。本文對近年來組織細(xì)胞來源和種植、瓣膜支架材料、體外預(yù)適應(yīng)和動物試驗等方面的內(nèi)容進(jìn)行了綜述,并指出目前研究中所存在的問題。

組織工程 心臟瓣膜 動物試驗

Abstract:In the feld of cardiac surgery, valve replacement is an effective approach to treat valve disorders,however, all of heart valves can be used clinically have different degrees of impairment. With the development of tissue engineering, tissue-engineered heart valve is considered a potential and perfect valve, which has bright clinical future,and now it has become a hot area of research. In this article, the resource of tissue cells and implantation, valve scaffold, in vitro pre -adaptation testing and in vivo animal experiment results are reviewed and the problems that in the current study are pointed out.

Key words:tissue engineering, cardiac valves, animal testing

人工心臟瓣膜置換術(shù)是治療心臟瓣膜性病變的主要外科治療手段，目前臨床上可以使用的人工心臟瓣膜主要有三類，即機(jī)械瓣、生物瓣和同種異體瓣。雖然可以有效地改善血流動力學(xué)，提高病人的生活質(zhì)量，延長壽命，但仍然存在不同程度的缺陷[1]。機(jī)械瓣需要終身抗凝防止血栓形成，異種生物瓣和同種瓣容易鈣化和衰敗。尤其這些管道共同缺點是都不具有生長潛能，在小兒心臟手術(shù)應(yīng)用中明顯受到限制[2]。作為理想的瓣膜替代物，尚不能令人滿意。理想的人工心臟瓣膜應(yīng)該具有耐久性能好、無鈣化和衰敗，能夠隨身體的發(fā)育而生長，并且材料來源廣泛、型號多樣等特點，它能夠滿足不同年齡段患者的需要。組織工程瓣膜正是這樣一種綜合了以上種種優(yōu)點的瓣膜替代品[3]。

1 組織工程心臟瓣膜概念

組織工程（Tissue Engineering，TE）是近年來正在興起的一門新學(xué)科，屬于生物高技術(shù)范疇。TE一詞最早是在1987年美國科學(xué)基金會在華盛頓舉辦的生物工程小組會上由美國化學(xué)工程師Robert Langer和外科醫(yī)生Joseph.p.Vacanti提出[4]，1988年正式定義為：應(yīng)用生命科學(xué)與工程學(xué)的原理與技術(shù)，在正確認(rèn)識哺乳動物的正常及病理兩種狀態(tài)下的組織結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的基礎(chǔ)上，研究、開發(fā)用于修復(fù)、維護(hù)、促進(jìn)人體各種組織或器官損傷后的功能和形態(tài)的生物替代物的一門新興學(xué)科。它涉及細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、化學(xué)、生物材料工程、臨床等諸多領(lǐng)域，屬于系統(tǒng)的多學(xué)科性研究范疇。TE的核心是建立由細(xì)胞和生物材料構(gòu)成的三維空間復(fù)合體，其最大優(yōu)點是可形成具有生命力的活體組織，對病損組織進(jìn)行形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能的重建并達(dá)到永久性替代和完美塑形。

組織工程心臟瓣膜（Tissue Engineering Heart Valve TEHV）就是利用生命科學(xué)和TE技術(shù)，采用人工合成材料、同種或異種的脫細(xì)胞心臟瓣膜作為組織工程心臟瓣膜的支架，通過將體外擴(kuò)增的患者自體活細(xì)胞種植在瓣膜支架上，細(xì)胞能夠牢固黏附、生長，使其具有正常瓣膜組織的新陳代謝功能，最后應(yīng)用于置換病變的瓣膜，在體發(fā)揮類似于正常瓣膜的功能。因此，組織工程心臟瓣膜不僅從功能上發(fā)揮正常瓣膜的功能，而且在結(jié)構(gòu)上類似于正常瓣膜， 同時由于具有活性，可在體內(nèi)根據(jù)需要生長、修復(fù)、重構(gòu)，并可抵御感染入侵[5]。目前，組織工程心臟瓣膜的研究包括組織細(xì)胞來源和種植、瓣膜支架材料、體外預(yù)適應(yīng)和在體動物試驗等方面的內(nèi)容。

2 組織細(xì)胞來源和種植

種子細(xì)胞根據(jù)來源又可分為自體細(xì)胞、同種異體細(xì)胞和異種細(xì)胞。在組織工程中，由于種子細(xì)胞的來源不同會引發(fā)不同類型與程度的免疫排斥反應(yīng)，因此選擇合適的種植細(xì)胞是構(gòu)建TEHV的關(guān)鍵之一[6]。

2.1 自體細(xì)胞

主要包括：a、血管內(nèi)皮細(xì)胞； b、成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞； c、骨髓基質(zhì)干細(xì)胞。組織工程心臟瓣膜的種子細(xì)胞的選取現(xiàn)在主要集中在自體細(xì)胞，自體細(xì)胞最大的好處是可以避免由于異體、異種細(xì)胞植入后所引起的免疫排斥反應(yīng)，從而減少瓣膜的退變。種子細(xì)胞最先采用的是血管內(nèi)皮細(xì)胞，這是因為隨著對內(nèi)皮細(xì)胞研究的深入，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞具有很多功能，比如內(nèi)分泌、抗凝血、抗感染的功能等等。但是隨著研究的深入，有作者發(fā)現(xiàn)心臟瓣膜的細(xì)胞組成成分中不僅僅只有內(nèi)皮細(xì)胞在發(fā)揮作用[7]，成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等均參與心臟瓣膜基質(zhì)成份的構(gòu)建，如果僅采用單一的細(xì)胞成份，如內(nèi)皮細(xì)胞，或平滑肌細(xì)胞/成纖維細(xì)胞等，有可能會對心臟瓣膜基質(zhì)的構(gòu)建產(chǎn)生不利影響。

由于對干細(xì)胞研究的不斷深入，有作者提出骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSC）具有多向分化的潛能，在體內(nèi)環(huán)境的作用下可以向多種細(xì)胞方向分化，所以可能可以滿足心臟瓣膜各種細(xì)胞功能的需要[7]。Hoerstrup[7]將人骨髓干細(xì)胞種植在去細(xì)胞瓣膜支架上，在擬生態(tài)環(huán)境生物反應(yīng)器中培養(yǎng)證明了它的可行性。新生組織顯示了人類心臟瓣膜組織的形態(tài)學(xué)特點和機(jī)械特性。人骨髓干細(xì)胞表現(xiàn)出了肌成纖維細(xì)胞分化特性。Werner等[8]也證明MSCs可以分化誘導(dǎo)成為血管內(nèi)皮細(xì)胞。Perry[9]應(yīng)用骨髓間質(zhì)干細(xì)胞作為種子細(xì)胞進(jìn)行研究也獲得了同樣的結(jié)果。

但是并非自體細(xì)胞就是絕對合理的種子細(xì)胞選擇，采用自體細(xì)胞作為組織工程心臟瓣膜種子細(xì)胞來源主要的問題有：(1)培養(yǎng)時間較長，一般為2～4周不等[7]，有貽誤病情的可能； (2)如果采用自體細(xì)胞作為種子細(xì)胞的來源，不可能進(jìn)行批量生產(chǎn)； (3)以及采用自體細(xì)胞作為種子細(xì)胞來源會對機(jī)體本身造成一定的創(chuàng)傷[10]，這些都將限制組織工程心臟瓣膜的臨床應(yīng)用。而且就骨髓基質(zhì)干細(xì)胞而言，它是否能在體內(nèi)向多種細(xì)胞分化，也還是一個有爭議的問題。

2.2 同種異體細(xì)胞

目前同種異體細(xì)胞作為種子細(xì)胞來源的研究主要集中在臍帶內(nèi)皮細(xì)胞[11]和臍帶血內(nèi)皮祖細(xì)胞[12]等方面。臍帶內(nèi)皮細(xì)胞和臍帶血內(nèi)皮祖細(xì)胞最大的優(yōu)勢在于不會造成機(jī)體的損傷[11，16]，而且可以構(gòu)建細(xì)胞庫[16]，形成規(guī)?；a(chǎn)，滿足臨床的需要。目前的研究表明，臍帶內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)要求低，并且該種細(xì)胞生長旺盛，容易在體外生長，并且種植在支架材料上能夠行使內(nèi)皮細(xì)胞的種種功能，因而是一種很有前途的細(xì)胞來源[11]。而臍帶血內(nèi)皮祖細(xì)胞的體外培養(yǎng)證明該種細(xì)胞可以穩(wěn)定的表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞的功能[12]。采用同種異體細(xì)胞最主要的顧慮在于種植以后可能引起免疫排斥造成瓣膜退變；或者患者需要服用免疫抑制藥物，這就喪失了組織工程心臟瓣膜的優(yōu)勢。但是根據(jù)目前的研究證明干/祖細(xì)胞的同種異體移植甚至是異種移植也不會發(fā)生很強的免疫排斥，甚至異種之間進(jìn)行干細(xì)胞移植也不需使用免疫抑制劑[13]。這就說明臍帶血內(nèi)皮祖細(xì)胞可能可以作為種子細(xì)胞的來源，并且可能不需使用免疫抑制劑。而且如果能夠建立組織工程庫細(xì)胞的話，臍帶內(nèi)皮細(xì)胞和臍帶血內(nèi)皮祖細(xì)胞就有可能成為供被采集者自身使用的自體細(xì)胞[16]。不過臍帶血內(nèi)皮祖細(xì)胞的體外培養(yǎng)存在培養(yǎng)條件要求較高，增殖緩慢等缺點[11]，對這種細(xì)胞的研究還在進(jìn)行當(dāng)中。

2.3 異種細(xì)胞

采用異種細(xì)胞作為種子細(xì)胞具有來源廣泛、成本低廉的優(yōu)點，但也具有可引發(fā)強烈排斥反應(yīng)的缺點。異種細(xì)胞進(jìn)入受體體內(nèi)會首先引發(fā)超急性排斥反應(yīng)和延遲性異種移植排斥反應(yīng)。超急性排斥反應(yīng)在幾分鐘至數(shù)小時內(nèi)可發(fā)生，是由人體內(nèi)預(yù)存的一種天然抗體介導(dǎo)的補體激活反應(yīng)，該抗體能識別異種細(xì)胞表面的α1，3-半乳糖苷酶（galactosidase，Gal）抗原。α1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶（galactosyl transferase，GT）可以用來合成存在于除人和靈長類動物以外的幾乎全部動物細(xì)胞表面的Gal表位，而人和靈長類動物體內(nèi)則存在高效價的Gal表位特異的天然抗體。Phelps[14]等成功繁育出純合的α1，3-GT基因敲除豬，這些豬并未因不表達(dá)Gal而使其生長和健康受到不利影響。α1，3-GT基因敲除豬的獲得使得有希望克服超急性排斥反應(yīng)和改善異種移植排斥反應(yīng)過程。異種細(xì)胞與宿主MHC不同所引發(fā)的細(xì)胞免疫排斥反應(yīng)也是異種細(xì)胞移植必須面對的問題。研究表明，用三維基質(zhì)包埋的內(nèi)皮細(xì)胞可因抑制MHCⅡ、輔助刺激因子和黏附分子而轉(zhuǎn)變宿主的免疫反應(yīng)。

2.4 種植條件

目前的種植條件有兩種，一種是靜態(tài)種植，另一種是動態(tài)種植。所謂靜態(tài)種植，就是在培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中將細(xì)胞和支架材料混合培養(yǎng)，使細(xì)胞能種植于支架材料上，國內(nèi)目前多采用這種方案[15]。這種方法培養(yǎng)條件要求低，易于操作。但是國內(nèi)的文獻(xiàn)并沒有在體內(nèi)原位植入后，在動脈血流沖刷下，細(xì)胞是否依然附著于支架材料上的報道。國外作者多采用動態(tài)種植[16]，他們應(yīng)用生物反應(yīng)器，將支架材料固定于反應(yīng)器中，并模擬人體動脈血流的流場，使細(xì)胞種植于支架材料上。這種方案對培養(yǎng)的條件要求較高，但是由于模擬了動脈的流場，所以細(xì)胞在支架材料上的粘附牢固。應(yīng)該說，動態(tài)種植更有利于組織工程心臟瓣膜的體內(nèi)植入。

為了能夠使種子細(xì)胞順利地種植在支架內(nèi)，同時使新形成組織順利地進(jìn)行物質(zhì)代謝，組織工程的支架材料必須具有一定的空間三維結(jié)構(gòu)。其中材料孔隙率、孔隙的大小以及孔隙之間的相互貫通是組織工程血管支架材料最重要的指標(biāo)。很多新技術(shù)應(yīng)用到這一方面，如三維打印技術(shù)、電鍍旋壓技術(shù)、納米技術(shù)等。近年，電鍍旋壓成型技術(shù)(electrospinning)的應(yīng)用，為血管組織工程制造出了具有仿生三維微結(jié)構(gòu)的支架。He[17]等應(yīng)用電鍍旋壓技術(shù)制造的膠原-聚合物混合物poly(L-lactic acid)-co-poly(epsilon-caprolactone)納米纖維材料，聚合物和膠原可以按不同比率相混合，其在形態(tài)學(xué)和化學(xué)結(jié)構(gòu)上模擬了細(xì)胞外基質(zhì)，在組織工程應(yīng)用中有巨大潛力。近來，Hong H[18]等首次嘗試?yán)霉撬栝g充質(zhì)干細(xì)胞種植技術(shù)和電鍍旋壓成型技術(shù)構(gòu)建雜交去細(xì)胞豬主動脈瓣膜支架取得了不錯的效果。

3 瓣膜支架材料

研究表明，理想的支架材料應(yīng)具有以下優(yōu)點：[19](1)具有多孔性(highly porous)三維空間結(jié)構(gòu)以利于細(xì)胞的生長和營養(yǎng)代謝。(2)良好的生物相容性(biocompatibility)和可控制的生物可降解性(biodegradation)以滿足細(xì)胞/組織在體外和/或體內(nèi)的生長。(3)材料表面適合細(xì)胞粘附、增殖和分化。(4) 降解速率通常與新組織合成速率相適應(yīng)，且能在新生瓣膜細(xì)胞生成之前提供足夠的機(jī)械強度，承受快速血流所產(chǎn)生的張力和剪切力；（5）良好的材料-細(xì)胞界面：材料應(yīng)能提供良好的材料-細(xì)胞界面，利于細(xì)胞粘附、生長，更重要的是能激活細(xì)胞特異基因表達(dá)，維持正常細(xì)胞表型表達(dá)。（6）易于消毒。目前，主要采用3類支架材料：（1）去細(xì)胞成份的生物瓣（同種或異種）如豬主動脈瓣或人肺動脈瓣等；（2）天然材料，如明膠、膠原、彈力蛋白、殼聚糖、纖維蛋白凝膠（fbringel）等；（3）可降解型高分子材料：Polyglycoliacid（PGA）Poly-4-hydroxybutyrate（P4HB），Polyhydroxyoctanoate（PHO），Polyhydroxyalkanoate（PHA）等。

3.1 脫細(xì)胞瓣膜支架材料

脫細(xì)胞同種或異種組織纖維支架由于完整保留了細(xì)胞生存的三維微環(huán)境，成為細(xì)胞黏附的良好平臺，其機(jī)械性能也于原組織基本相同，因此脫細(xì)胞瓣膜支架的良好特性是任何人工合成材料支架無法比擬的[20]。

3.1.1 異種脫細(xì)胞瓣膜支架材料

將異種生物瓣(如豬肺動脈瓣)經(jīng)過高滲液、低滲液、酶溶液及清洗液處理后，即可達(dá)到脫細(xì)胞的目的，并且能夠完整保存異種瓣膜組織內(nèi)免疫原性低的細(xì)胞外間質(zhì)的組織結(jié)構(gòu)，再經(jīng)伽馬射線照射消毒滅菌后，即可獲得種植人體活細(xì)胞的異體生物瓣移植物的優(yōu)質(zhì)支架[21]。采用這種支架不僅消除了抗原性和免疫原性，而且保持了正常瓣膜的三維空間，其纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)有利于細(xì)胞種植和生長，并且有很好的抗張強度。由于異種生物瓣組織種存活的細(xì)胞是引起受體反映的主要因素，如果清除異體生物瓣組織種原有的細(xì)胞，在組織種重建具有活性的人體細(xì)胞，即可不易引發(fā)受體的免疫排斥反映；還可能存在某些復(fù)合生長因之，可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長和分化等[22]。其不足之處是：異種瓣膜支架存在性能難以重現(xiàn)；具有一定的壓縮性，再體內(nèi)水解的過程種不能保持空間構(gòu)型抗原性消除不確定；同時也會存在某些傳染病隱患等[23]。

3.1.2 同種脫細(xì)胞瓣膜支架材料

是將同種瓣膜去細(xì)胞后再種植受體細(xì)胞，可有效抑制瓣膜的炎性和免疫反應(yīng)，減慢鈣化衰敗過程，是支架構(gòu)建的另一個方向[24]。同種瓣具有優(yōu)良的抗血栓、抗感染性能及良好的血流動力學(xué)效果，且移植技術(shù)日趨成熟，使用方便，廣泛應(yīng)用于臨床治療先天性心臟病及瓣膜病。但同種瓣移植后遠(yuǎn)期易鈣化毀損，再次移植率高。

3.1.3 脫細(xì)胞方法

去細(xì)胞基質(zhì)是指采用一定的方法脫除組織中的細(xì)胞成分，而保留的以細(xì)胞外膠原等為主的纖維支架，該支架基本保持原有的三維結(jié)構(gòu)和理化特性。目前脫細(xì)胞的方法包括化學(xué)、酶消化法和機(jī)械法。具體到心血管領(lǐng)域主要有單純?nèi)ス竸┓ê腿ス竸?、酶消化法。去垢劑目前采用較多的為Triton X-100， 十二烷基磺酸鈉（SDS），和膽脂酸鈉。去垢劑法首先用Triton X-100對組織進(jìn)行處理后，再用SDS、Triton X-100或膽脂酸鈉對組織進(jìn)行脫細(xì)胞處理；而去垢劑、酶消化法去細(xì)胞包括3個基本步驟(1)將組織浸入含蛋白酶抑制劑的低滲液內(nèi)；(2)含Triton X-100高滲鹽溶液處理；(3)酶溶液消化處理[25]。單純?nèi)ス竸┓ㄌ幚砗蟮慕M織主要成分為膠原、彈性蛋白、纖維粘連素(fbronectin)及層粘連蛋白(laminin)；去細(xì)胞基質(zhì)的結(jié)構(gòu)與正常組織非常相似。去垢劑、酶消化法處理后的組織主要成分為彈性蛋白、非可溶性膠原和緊密連接的糖性蛋白。Lifecell公司還發(fā)展了一種去垢劑和凍干法結(jié)合的去細(xì)胞方法[26]。 在去垢劑和消化酶等的使用上有不同的觀點。有學(xué)者認(rèn)為SDS對瓣膜的膠原結(jié)構(gòu)有損傷，而Booth等[27]應(yīng)用十二烷基磺酸鈉(SDS)-去氧膽酸鈉(sodium deoxycholate)法脫細(xì)胞，其效果確切，未見殘留細(xì)胞或細(xì)胞碎片，且組織學(xué)分析表明瓣膜的主要結(jié)構(gòu)蛋白成分得以保留。石開虎等[28]對4種去細(xì)胞方法進(jìn)行比較，結(jié)果表明去垢劑-酶消化法去細(xì)胞效果較好，去細(xì)胞完全，纖維支架保留完整，其后種植細(xì)胞生長也較好，而且可以控制。

目前，研究中主要應(yīng)用的去細(xì)胞方法還是化學(xué)去垢劑-酶消化法。實驗中一般均采用胰酶、SDS，乙二胺四乙酸(EDTA)、Triton X-100、RNA酶Ⅰ和DNA酶Ⅰ的去垢劑-酶消化法處理選取的瓣膜材料，但根據(jù)不同的材料，在處理過程中消化液濃度的選擇和消化時間的控制應(yīng)適當(dāng)選擇。

3.1.4 脫細(xì)胞在材料抗鈣化中的作用

在典型的交叉連接處理過程中，雖然組織細(xì)胞破裂了，但細(xì)胞碎片仍然得以保留。這些細(xì)胞殘存成分與組織早期的鈣化結(jié)晶有關(guān)聯(lián)。去垢劑法、酶消化法和超聲法等幾種方法可以脫除促使組織鈣化的細(xì)胞成分和脂質(zhì)。因此已被成功用于組織的去細(xì)胞化處理。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，組織經(jīng)醚提取磷脂后再用戊二醛固定，其鈣化程度較戊二醛直接固定組織明顯減輕。因而可以推測脫磷脂可以減少羥磷灰石(鈣化形成基礎(chǔ))沉積的位點。實驗證明，利用氯仿或甲醇或SDS選擇性的從牛心包脫除脂質(zhì)，可以明顯的減輕牛心包在兔體內(nèi)的鈣化程度。盡管鈣化的機(jī)制沒有完全清楚，但可以認(rèn)為清除脂質(zhì)和磷脂可以減輕移植組織的鈣化程度。脫細(xì)胞處理(如去垢劑法)通常也同時將在鈣化過程中起重要作用的蛋白多糖脫除。實驗證明，對牛心包采用鹽酸胍脫除蛋白多糖可以減輕鈣化。但有實驗表明，過多的脫除蛋白多糖可以增加鈣化程度。Jorge-Herrero等[29]認(rèn)為過強的脫除可導(dǎo)致某些緊密連接的蛋白多糖以及蛋白多糖和膠原之間的連接喪失，形成鈣鹽得以沉積的多孔基質(zhì)。雖然有報道，在戊二醛固定組織中添加蛋白多糖可以減輕鈣化，但蛋白多糖在鈣化中的作用目前還不清楚。

3.1.5 脫細(xì)胞在減輕材料免疫反應(yīng)中的作用

瓣膜組織中的細(xì)胞，尤其是內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的MHC-I和MHC-II是引起免疫反應(yīng)的主要原因。去細(xì)胞化后，脫除了組織內(nèi)的細(xì)胞，可以減輕或消除免疫反應(yīng)。炎癥反應(yīng)不僅可導(dǎo)致組織的降解，同時也是組織鈣化的又一個重要原因。有假設(shè)認(rèn)為，去抗原性(如細(xì)胞表面蛋白)可以減弱體內(nèi)受到的免疫攻擊；因此，去細(xì)胞可以減弱甚至消除炎癥反應(yīng)。但是，去細(xì)胞后的細(xì)胞外基質(zhì)仍然可能引起免疫反應(yīng)。盡管不同種屬間膠原的免疫原性實驗室中可以測到，但膠原的差異很小，在臨床中的實際意義很小。Kasimir MT[30]報道盡管各種去細(xì)胞方法的效果不盡相同，但都不能消除異種瓣膜的致血栓性和炎癥反應(yīng)。因此有人認(rèn)為，盡管去細(xì)胞化可以去除組織的主要免疫原性，但是無法完全消除炎癥反應(yīng)。有報道稱，異種去細(xì)胞基質(zhì)移植后的炎癥反應(yīng)與重塑有關(guān)，而與排斥反應(yīng)無關(guān)。

3.2 天然材料

天然可降解高分子材料多由正常組織細(xì)胞外的高分子合成，本身包含許多生物信息，能夠提供細(xì)胞所需的信號。天然材料與細(xì)胞親和性強，能為細(xì)胞的生長、增殖、分化及功能發(fā)揮提供近似體內(nèi)的發(fā)生發(fā)育的細(xì)胞外基質(zhì)支架條件，能使細(xì)胞聚集成組織，控制組織結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)細(xì)胞表型。植入體內(nèi)時無或只有極低的免疫排斥反應(yīng)，而且構(gòu)建的組織工程瓣膜具有良好的順應(yīng)性，是組織工程心臟瓣膜支架材料發(fā)展的一個重要方向。該類材料包括膠原、明膠、甲殼素、海藻酸鹽、氨基葡聚糖和脂質(zhì)體等。Flanagan[31]等人用纖維蛋白制作心臟瓣膜支架，在自制的生物動態(tài)反應(yīng)器中進(jìn)行動態(tài)培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)該支架材料在低壓動態(tài)環(huán)境下能增加細(xì)胞黏附和取向。天然材料的另外一種使用方式是凝膠。近年來，對多種天然水凝膠材料，如將膠原蛋白，纖維素和殼聚糖幾種材料混合起來形成各種支架材料，這類支架材料也可作為載體成為可注射型支架。這類材料在注射的狀態(tài)下具有可流動性(溶膠)，注射入體內(nèi)后經(jīng)過物理和化學(xué)變化后形成具有一定形狀和機(jī)械強度的支架(凝膠)。Flanagan[32]等用膠原蛋白(collagen)和葡萄糖氨聚糖(glycosaminoglycan)的水凝膠材料作為冠狀瓣膜(mitralvalve)體外培養(yǎng)支架材料，通過研究發(fā)現(xiàn)這種材料是適合瓣膜體外培養(yǎng)的。

3.3 人工合成可降解高分子材料

最初應(yīng)用人工合成聚乙醇酸(polyglycolicacid，PGA)、聚乳酸(polylacticacid，PLA)或二者共聚物(copolymer PLGA)。這類材料具有良好的組織相容性、生物可降解性和吸收性，但材料厚而硬，強度和可屈性不夠。聚乙醇酸結(jié)晶度高，是線性脂肪族聚酯化合物易于吸收降解，細(xì)胞易附著，但存聚乙醇酸缺乏結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，在組織培養(yǎng)的過程中不能抵抗平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生的收縮力，降解速率快，很難維持預(yù)先設(shè)計的形態(tài)。聚乳酸相對于聚乙醇酸具有疏水性大、結(jié)晶性低、降解速率慢的特點。因此將聚乙醇酸和聚乳酸按一定的比例混合，以更好的控制降解速率和保持預(yù)先設(shè)計的形態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)將聚乳酸/聚L-乳酸和聚乙醇酸按照一定的比例混合可以更好的控制降解速率和保持預(yù)設(shè)形態(tài)。心臟瓣膜組織工程中常用90%的聚乙醇酸和10%的聚乳酸混合，作為心臟瓣膜支架材料。Breuer等[33]在該材料上種植自體同源的成纖細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞后，移植到小羊心臟內(nèi)，替代肺動脈取得成功。也有研究者將幾種聚合物的均聚物、共聚物和混合物作為支架材料。

雖然人工合成材料的強度、降解速度、微結(jié)構(gòu)和滲透性均可在生產(chǎn)過程中進(jìn)行控制，人工合成降解材料構(gòu)建TEHV動物實驗雖然取得了一定進(jìn)展，但人工合成材料缺乏細(xì)胞外基質(zhì)中的生物信號和功能基團(tuán)，與種子細(xì)胞的黏附性較差；而且，在材料降解過程中，會產(chǎn)生一些酸性物質(zhì)，對局部會產(chǎn)生一定的影響；此外尋找理想的聚合物仍是一大難題，聚合物的免疫原性、細(xì)胞毒性、炎癥反應(yīng)很難避免。聚合支架的重要參數(shù)包括孔隙率、厚度、降解率和形狀正在尋找。

3.4 其他支架材料

高分子材料可以提供一個穩(wěn)定的力學(xué)環(huán)境且易成型，而天然生物材料中一些氨基酸殘基序列如精氨酸甘氨酸天冬氨酸(RGD)、精氨酸谷氨酰氨天冬氨酸纈氨酸(REDV)等，可以被細(xì)胞膜的整合素受體識別，參與細(xì)胞分裂，加快細(xì)胞的分化，因此可以增加細(xì)胞親和性2004年，有多個學(xué)者報道將天然去細(xì)胞豬主動脈瓣結(jié)合人工可降解材料，或?qū)⑷斯た山到獠牧吓c天然材料相結(jié)合構(gòu)建瓣膜支架[34]。這類混合型支架既有良好的生物相容性，易于細(xì)胞的黏附及生長，又具有與人體瓣膜相匹配的三維構(gòu)型及完整的細(xì)胞外基質(zhì)，能更好滿足體內(nèi)血流環(huán)境的力學(xué)要求。最近，SchaefermeierPK[35]等利用計算機(jī)技術(shù)設(shè)計了一種構(gòu)建組織工程瓣膜三維支架的新方法：用X線掃描人的主動脈瓣，在計算機(jī)上重建三維模型，按照這個模型生產(chǎn)出新的硅樹脂瓣膜，通過試驗，這種新的瓣膜在高度、長度、內(nèi)徑上和同種瓣膜相比僅僅有3-4%的差異，顯示了很好的效果。這種基于患者自身特殊性構(gòu)建的組織工程瓣膜支架或許是未來組織工程瓣膜發(fā)展的一個方向。

4 體外預(yù)適應(yīng)

生物反應(yīng)器是一種可嚴(yán)格監(jiān)控、培養(yǎng)環(huán)境可精細(xì)調(diào)節(jié)、操作條件可控的細(xì)胞

生物、生化培養(yǎng)裝置。它是構(gòu)建組織工程瓣膜有力的工具，既可為體外組織工程種子細(xì)胞的生長提供理想的環(huán)境，也可以為體外構(gòu)建組織工程組織和器官提供模擬體內(nèi)生理條件的三維環(huán)境。研究發(fā)現(xiàn)[36]，體外構(gòu)建的組織工程瓣膜在逐漸經(jīng)過模擬體內(nèi)血流的生物反應(yīng)器后，其功能和生物學(xué)特性均有明顯改善，再行在體動物實驗后的結(jié)果表明其瓣膜結(jié)構(gòu)和細(xì)胞生物學(xué)特性要明顯優(yōu)于未經(jīng)體外預(yù)適應(yīng)的組織工程瓣膜。一些專門設(shè)計的反應(yīng)器如脈動反應(yīng)器提供了最接近體內(nèi)環(huán)境的條件，使在此條件下構(gòu)建的心臟瓣膜、血管機(jī)械性能遠(yuǎn)勝于靜態(tài)培養(yǎng)!Hoertrup SP等[37]將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外增殖到一定數(shù)量后接種到三尖瓣支架上，分別置入脈動生物反應(yīng)器和普通培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，結(jié)果脈動生物反應(yīng)器中培養(yǎng)的三尖瓣組織結(jié)構(gòu)與機(jī)械性能接近人體三尖瓣，而靜態(tài)培養(yǎng)的三尖瓣組織結(jié)構(gòu)松散，生物性能遠(yuǎn)不如前者。最近，有報道[38]新型生物反應(yīng)器的研制，能夠提供瓣膜以脈動力學(xué)環(huán)境，模擬體內(nèi)環(huán)境。該裝置采用體外循環(huán)轉(zhuǎn)子泵提供動力源，可達(dá)到正常心排量，并能夠精確調(diào)節(jié)流量，方便計算出瓣膜所承受的切應(yīng)力大小.隨著生物反應(yīng)器不斷發(fā)展和完善，生物反應(yīng)器將不僅僅是細(xì)胞、組織的培養(yǎng)容器，而是向著成為真正意義上能培育出生命的裝置發(fā)展。生物反應(yīng)器的進(jìn)一步完善也必將會促進(jìn)組織工程的發(fā)展。

5 構(gòu)建TEHV的動物實驗研究

5.1 人工合成降解材料構(gòu)建TEHV動物實驗

目前組織工程心臟瓣膜的應(yīng)用大多局限于實驗階段，主要以大型動物實驗如犬、羊等為主。最早的動物實驗由1995年Shin’oka等完成[39]，他們在PGA/PGLA支架上種植了羊頸、股動脈肌纖維母細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞后，將其移植于羊肺動脈瓣觀察11周， 結(jié)果顯示組織工程心臟瓣膜植入動物體內(nèi)后是有生物活性的。人工合成降解材料構(gòu)建TEHV動物實驗雖然取得了一定進(jìn)展，但尋找理想的聚合物仍是一大難題。聚合物的免疫原性、細(xì)胞毒性、炎癥反應(yīng)很難避免?；诮到獠牧蠘?gòu)建的TEHV目前仍有許多無法克服的困難，許多科研機(jī)構(gòu)采用脫細(xì)胞的生物源性支架構(gòu)建TEHV用于動物實驗，甚至初步應(yīng)用于臨床。

5.2 異種脫細(xì)胞瓣膜構(gòu)建TEHV動物實驗

Bader等[40]取豬主動脈瓣脫細(xì)胞處理，將冠狀動脈旁路移植術(shù)中分離的人大隱靜脈內(nèi)皮細(xì)胞種植在支架上。病理檢驗可見脫細(xì)胞豬主動脈瓣膜膠原纖維保存完好，3日后內(nèi)皮細(xì)胞融合為單層；人內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志CD31染色陽性，體外研究已證明了用脫細(xì)胞豬主動脈瓣構(gòu)建TEHV的可行性。此后他們用此法構(gòu)建TEHV，在羊體內(nèi)進(jìn)行了實驗，肺動脈置換1個月后超聲檢查瓣膜活動良好。

也有學(xué)者取豬肺動脈瓣脫細(xì)胞處理后構(gòu)建TEHV。Dohmen等[41]將豬的肺動脈瓣取下，于無菌條件下化學(xué)法脫細(xì)胞，將獲取的羊內(nèi)皮細(xì)胞種植在瓣膜上，7日后替換綿羊的肺動脈瓣。分別于術(shù)后7日、3、6個月檢查，瓣膜功能良好，無墜生物、血腫形成，瓣葉無撕裂、穿孔、變形、返流、變硬。病理檢查及電鏡示瓣葉表面內(nèi)皮細(xì)胞完整，有成纖維細(xì)胞長入基質(zhì)。X線和原子吸收光譜檢測瓣葉鈣化情況，瓣葉只在縫合線的兩邊有輕度的鈣化。

國內(nèi)方寧濤等[42]采用人臍帶血分離出的內(nèi)皮祖細(xì)胞在去細(xì)胞豬主動脈瓣膜上體外進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞能夠在支架上分化為內(nèi)皮細(xì)胞。

5.3 同種脫細(xì)胞瓣膜構(gòu)建TEHV動物實驗

2000年，Gudtav等[43]報道他們將羊的同種肺動脈帶瓣管道經(jīng)脫細(xì)胞處理后種植以羊的肌成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，再移植回該羊體內(nèi)，3個月后，瓣膜的功能良好，表面有再細(xì)胞化及細(xì)胞基質(zhì)的形成。不過從臨床的角度來看，同種瓣膜的來源較少，同時會涉及復(fù)雜的倫理問題，都會限制其應(yīng)用前景。Akatov等[44]

利用組織工程方法對同種瓣進(jìn)行改造，方法是在體外用患者自身組織培育并提取的成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞先后植入同種瓣，結(jié)果表明成纖維細(xì)胞已長入了同種瓣組織中，認(rèn)為此法能延長同種瓣移植后的壽命。但這種方法的主要問題在于支架本身抗原性不能完全消除，置入體內(nèi)后支架不能降解，且無生長性，兒童換瓣仍受到限制。

5.4 其他方法構(gòu)建TEHV的動物實驗

正如上所述，體外構(gòu)建TEHV需要體外生物反應(yīng)器才能使種植的細(xì)胞具有循環(huán)內(nèi)的內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)和功能。但是，體外生物反應(yīng)器畢竟不能完全模擬體內(nèi)的血液循環(huán)特點，并且瓣膜容易受到二次污染。再加上工序復(fù)雜，難以在臨床上廣泛推廣。有許多研究者一直在致力于采用其他的方法構(gòu)建TEHV。比如：心臟瓣膜支架直接移植到受體體內(nèi)，在真正的血流環(huán)境下重建TEHV；也有的研究者采用其他的方法，比如對心臟瓣膜支架材料進(jìn)行一定的預(yù)處理，使心臟瓣膜支架具有更好的組織相容性、機(jī)械強度，從而改善瓣膜支架特性，加速瓣膜在體內(nèi)的組織重塑。

1995年Wilson等[45]率先采用去垢劑、核酶法對豬半月瓣進(jìn)行了脫細(xì)胞處理，并移植于狗的肺動脈瓣區(qū)，進(jìn)行觀察。結(jié)果顯示：(1)去細(xì)胞成分是完全的，基質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)保持正常；(2)1個月后瓣膜及周圍動脈壁無炎癥反應(yīng)；(3)瓣根部有多角形細(xì)胞植入；(4)瓣膜表面內(nèi)皮化；(5)動脈壁部分細(xì)胞化。O'Brien[46]等人報道，他們將脫細(xì)胞的豬主動脈支架直接移入肺動脈瓣區(qū)，150 d后瓣膜支架有成纖維細(xì)胞長入和新的基質(zhì)形成。Iwai S等[47]采用新的脫細(xì)胞方法制作脫細(xì)胞豬主動脈瓣膜支架，體外不種植細(xì)胞，直接埋置到鼠的皮下60天后發(fā)現(xiàn)受體細(xì)胞長入、瓣膜結(jié)構(gòu)完整、鈣化輕微，之后把這種主動脈瓣膜移植到犬的肺動脈位置。觀察6個月，發(fā)現(xiàn)瓣膜完整，未見反流現(xiàn)象，未見明顯鈣化。Hayashida K等[48]采用新的方法體內(nèi)構(gòu)建心臟瓣膜管道，首先在體外構(gòu)建心臟瓣膜支架模具，然后埋置到大鼠皮下，移植一段時間后取出心臟瓣膜管道，此時模具已經(jīng)被受體細(xì)胞及纖維包裹，分離模具和纖維組織得到體內(nèi)構(gòu)建的心臟瓣膜管道。經(jīng)體外測試其功能良好，細(xì)胞和纖維比例合適，具有活性。國內(nèi)學(xué)者吳松、劉應(yīng)龍等[49]采用雜交辦法，以脫細(xì)胞豬主動脈瓣作為支架，用可降解聚合材料3-羥基丁酸與3-羥基己酸共聚酯(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate， PHBHHx)涂層，構(gòu)建新型復(fù)合組織工程瓣膜，再植入到綿羊肺動脈區(qū)。18周后，發(fā)現(xiàn)這種雜交瓣膜保持了自然瓣形態(tài)，抗拉強度顯著提高；瓣膜柔軟，表面光滑無血栓；免疫熒光染色檢測，瓣膜新生內(nèi)膜中內(nèi)皮細(xì)胞呈CD31陽性反應(yīng)，沿瓣表面連續(xù)排列，間質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)單克隆鼠抗人平滑肌actin(SMA)陽性反應(yīng)；復(fù)合組織工程瓣膜鈣含量明顯低于脫細(xì)胞豬主動脈瓣。顯示出復(fù)合組織工程瓣膜具有自然瓣膜的三維形態(tài)結(jié)構(gòu)，良好的生物力學(xué)特性、生物相容性和細(xì)胞引導(dǎo)性。

6 臨床應(yīng)用

在臨床應(yīng)用方面具有開創(chuàng)意義的是Dohmen等[50]將體外構(gòu)建的組織工程心臟瓣膜植入施行Ross手術(shù)患者的肺動脈瓣，他們采用經(jīng)胸超聲，磁共振和多層螺旋CT于術(shù)后3、6、12個月后隨訪，證實，肺動脈瓣位的組織工程心臟瓣膜僅有少許中心性返流，而且返流程度并未因時間延長而加重；一年后的隨訪經(jīng)CT證實，該組織工程心臟瓣膜無鈣化，功能良好。雖然Dohmen等采用的是同種瓣作為支架材料，并且植入部位是壓力相對較低的肺動脈瓣，但是，這次臨床應(yīng)用的成功還是讓大家看到了組織工程心臟瓣膜進(jìn)入臨床的曙光。

P.Simon等[51]在臨床給4例兒童用去細(xì)胞豬主動脈和肺動脈帶瓣管道Synergraft TM（500型和700型）（Cryolife Inc.，USA）行Ross術(shù)和右室流出道重建，結(jié)果卻與前面學(xué)者的動物實驗截然不同，4例兒童分別在術(shù)后2天、7天、6周和1年全部死亡，死亡原因是早期瓣膜穿孔破裂和晚期瓣膜褪變衰敗所致的心源性猝死，對這種去細(xì)胞而又沒有再細(xì)胞化的生物移植物做解剖學(xué)、組織學(xué)和細(xì)胞學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)：在管道外有纖維素鞘形成并向管內(nèi)延伸導(dǎo)致吻合口嚴(yán)重狹窄；早期是嚴(yán)重而強烈的非特異性炎癥反應(yīng)，晚期有淋巴細(xì)胞反應(yīng)和鈣鹽沉積；4例移植物上均沒有自體細(xì)胞生長。研究者發(fā)現(xiàn)Synergraft TM在移植前存在去細(xì)胞不完全和鈣鹽沉積，建議應(yīng)停用此產(chǎn)品，需要進(jìn)一步改進(jìn)。這表明去細(xì)胞組織工程瓣膜的研究距離臨床應(yīng)用還有一定的距離。

7 問題與展望

組織工程心臟瓣膜的研究方興未艾，前景廣闊。目前，存在的問題主要有以下幾個方面：(1)人工可降解材料的性能不足以在現(xiàn)階段應(yīng)用于臨床，還需要材料工作者共同能夠努力；(2)去細(xì)胞異種生物瓣膜的支架制備方法不統(tǒng)一，有待進(jìn)一步規(guī)范化；(3)種子細(xì)胞的旋轉(zhuǎn)等基礎(chǔ)研究尚待進(jìn)一步的深入，以期建立理想的種子細(xì)胞庫；(4)設(shè)計的各種生物反應(yīng)器距離人體內(nèi)血流動力學(xué)要求差距較大；體外構(gòu)建的方法需進(jìn)一步改進(jìn)，這樣構(gòu)建的組織工程心臟瓣膜可以大規(guī)模應(yīng)用于主動脈位置。

組織工程心臟瓣膜的研究進(jìn)展較快，但距離臨床應(yīng)用還有很長的路要走， 需要該領(lǐng)域的廣大工作者繼續(xù)不懈的努力。相信隨著研究的不斷深入，人工可降解材料的不斷優(yōu)化，對種子細(xì)胞不斷的篩選和體外構(gòu)建方法的改進(jìn)，組織工程心臟瓣膜必有更大的發(fā)展?jié)摿Γ诓贿h(yuǎn)的將來造福于廣大心臟瓣膜病患者。

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Heart Valve Tissue Engineering

MA Jin-hui LI Wen-bin Beijing Anzhen Hospital of the Capital University of Medical Sciences (Beijing 100029)

1006-6586(2010)04-0035-09

R318.1

A

2010-01-26

馬金輝，北京安貞醫(yī)院住院醫(yī)師