貫葉連翹中金絲桃素的提取分離方法

崔 穎,梁劍平,王 玲,王曙陽(yáng),白衛(wèi)兵,王學(xué)紅,華蘭英

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所新獸藥工程重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室,甘肅 蘭州 730050;2.蘭州大學(xué),甘肅 蘭州 730000;3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,甘肅 蘭州 730070)

貫葉連翹(Hypericum perforatum L.)是藤黃科(Clusiaceae)金絲桃屬(Hypericum L.)植物貫葉連翹的全草,為多年生草本植物,具有抗菌消炎、收斂止血、消腫止痛等功效[1]。國(guó)外研究發(fā)現(xiàn),金絲桃素(Hypericin)是貫葉連翹中最具生物活性的物質(zhì),其醫(yī)用價(jià)值很高。臨床上除了用于抗抑郁、抑制中樞神經(jīng)作用外,還是一種有前途的內(nèi)源性光敏劑,可用于腫瘤的光化學(xué)診斷與治療。近年來(lái)的研究證明,金絲桃素有顯著的抗DNA、RNA病毒作用,曾用于艾滋病的治療。在德國(guó)金絲桃素已與白蛋白結(jié)合用于臨床治療艾滋病及甲型、乙型肝炎[2]。國(guó)內(nèi)新近研究發(fā)現(xiàn),金絲桃素對(duì)禽流感病毒和口蹄疫病毒均有較強(qiáng)的抑制作用[3-5]。

貫葉連翹主要分布在我國(guó)的華東、中南、西南和西北地區(qū),資源相當(dāng)豐富[6]。由于全草中所含金絲桃素僅有萬(wàn)分之幾,只有通過(guò)化學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行提取、分離,才能達(dá)到國(guó)際市場(chǎng)對(duì)貫葉連翹提取物中金絲桃素含量須大于0.3%的要求。關(guān)于從貫葉連翹中提取金絲桃素的工藝研究,國(guó)外在1980年代已開(kāi)始進(jìn)行,國(guó)內(nèi)直到1990年代末才有報(bào)道,現(xiàn)行工藝產(chǎn)品中金絲桃素的含量在0.3%～0.7%之間[7-8]。為了得到含量更高的金絲桃素提取物,用于藥理和藥效試驗(yàn),筆者根據(jù)金絲桃素的理化特性,研究、篩選出一種成本低、操作簡(jiǎn)單的從貫葉連翹中提取、分離金絲桃素的工藝方法,結(jié)果得到了含量為0.914%和1.08%的2種產(chǎn)品。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備 Waters高效液相色譜儀系列,510型泵,480型紫外檢測(cè)器;557型HITACHI紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì);RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵;HHS21-N型電熱恒溫水浴鍋;DMF-100型電動(dòng)植物粉碎機(jī)。

1.2 藥材與試劑 干燥貫葉連翹全草,購(gòu)自甘肅省康縣;金絲桃素標(biāo)準(zhǔn)品,購(gòu)自美國(guó) Sigma公司;乙醚、無(wú)水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、甲醇、丙酮、冰醋酸均為分析純;色譜甲醇、乙腈均為色譜純;水為雙蒸水;薄層層析硅膠G(青島海洋化工有限公司);LSA-20大孔吸附樹(shù)脂(西安藍(lán)深交換吸附材料有限責(zé)任公司);羧甲基纖維素鈉(CMC)。

1.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取金絲桃素標(biāo)準(zhǔn)品1 mg于25mL棕色容量瓶中,加入無(wú)水乙醇使溶解,定容。置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 薄層色譜分析 取適量薄層層析硅膠G,加入0.1%的CMC溶液,攪拌均勻,制成薄層板,自然晾干后,105℃活化1 h,置干燥器中備用。展開(kāi)劑為石油醚-乙酸乙酯-甲醇(1∶4∶3)。在金絲桃素的提取、分離過(guò)程中用薄層色譜(TLC)法進(jìn)行跟蹤檢查,具體方法為:將對(duì)照品溶液和樣品溶液點(diǎn)于同一塊薄層板上,用展開(kāi)劑展開(kāi)后置紫外燈(254 nm)下觀察,金絲桃素顯紅色熒光斑點(diǎn),Rf值為0.85。

1.5 金絲桃素的提取、分離與純化

1.5.1 預(yù)處理 將干燥的貫葉連翹全草粉碎成粗粉,稱取該粗粉1 kg,裝入滲漉柱中,加入乙醚進(jìn)行滲漉,從而除去貫葉連翹中的葉綠素等脂溶性雜質(zhì)。滲漉速度為1～2mL/min。隨著滲漉的進(jìn)行,漉液的顏色由深綠色逐漸變淺,當(dāng)接近無(wú)色時(shí),表明葉綠素基本除去,停止?jié)B漉。將藥粉取出晾開(kāi),以揮發(fā)去乙醚,漉液通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙醚,重復(fù)利用。

1.5.2 金絲桃素的提取 將預(yù)處理過(guò)的貫葉連翹藥粉裝入三頸圓底燒瓶中,一個(gè)瓶口連接空氣冷凝管,一個(gè)瓶口插入溫度計(jì)。加入無(wú)水乙醇2000mL,59℃～60℃水浴溫浸 2 h,過(guò)濾,濾液備用,濾渣中再次加入1000mL無(wú)水乙醇,同樣條件下進(jìn)行第2次溫浸,過(guò)濾,取少量濾液作TLC檢查,結(jié)果發(fā)現(xiàn)仍有金絲桃素,重復(fù)以上操作,至第9次時(shí),T LC結(jié)果顯示濾渣中已無(wú)金絲桃素。將前10次濾液合并,在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上55℃減壓濃縮為浸膏Ⅰ。

1.5.3 金絲桃素的分離 將新樹(shù)脂用95%以上的乙醇浸泡,充分?jǐn)噭?dòng)以除去氣泡,靜置過(guò)夜,濕法裝入玻璃柱中。將浸膏Ⅰ用50mL無(wú)水乙醇溶解,過(guò)濾,濾液上LSA-20大孔吸附樹(shù)脂柱,然后用無(wú)水乙醇洗脫,收集流出液,用TLC跟蹤檢測(cè)至流出液中無(wú)金絲桃素時(shí),在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上55℃減壓濃縮為浸膏Ⅱ。

1.5.4 金絲桃素的純化 將薄層層析硅膠G干法裝柱,盡量裝得均勻、緊密,上面覆蓋一層濾紙,取浸膏Ⅱ用30mL丙酮溶解,過(guò)濾,濾液上硅膠柱,用丙酮洗脫至色層完全展開(kāi)后,層析柱由上至下顯示出黃色、棕黃色、紅色、棕紅色、綠色等色帶,掏出紅色部分硅膠,裝入小玻璃柱內(nèi)用丙酮沖洗至硅膠無(wú)色,沖洗液濃縮干燥后,得紅色浸膏Ⅲ。

1.6 金絲桃素的含量測(cè)定

1.6.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 精密稱取金絲桃素標(biāo)準(zhǔn)品1 mg于10mL棕色容量瓶中,加入甲醇使溶解,定容。置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 用557型HITACHI紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行掃描(190～900 nm),出現(xiàn)多個(gè)吸收峰,取浸膏 Ⅱ,溶解后在218 nm和284 nm波長(zhǎng)處檢測(cè),發(fā)現(xiàn)284 nm雜質(zhì)峰較少,干擾小,所以確定284 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

1.6.3 色譜條件[9-10]Kromasil C18(5 μ m,250×4.6 mm)色譜柱;流動(dòng)相為乙腈-水(140∶10,內(nèi)含1%的冰醋酸),柱溫30℃,流速1mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)284nm。

2 結(jié)果

2.1 經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂分離得到的浸膏Ⅱ通過(guò)高效液相色譜法分析、測(cè)定,其金絲桃素的含量為0.914%。

2.2 大孔吸附樹(shù)脂分離后又通過(guò)硅膠柱純化得到的浸膏Ⅲ,經(jīng)高效液相色譜法分析、測(cè)定,其金絲桃素的含量為1.08%。

3 討論

3.1 葉綠素在貫葉連翹中的含量較高,如果不除去,對(duì)金絲桃素的分離、純化帶來(lái)很大干擾,筆者通過(guò)對(duì)氯仿、石油醚及乙醚的多次試驗(yàn)、檢測(cè),最終篩選出用乙醚滲漉法除去葉綠素,效果較好。

3.2 據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[11],金絲桃素的TLC在紫外燈下顯紅色熒光,提示筆者在提取、分離時(shí),采用T LC跟蹤檢測(cè),薄層板上紅色熒光斑點(diǎn)的消失可以作為終點(diǎn)的判斷指標(biāo)。

3.3 金絲桃素的化學(xué)性質(zhì)非常不穩(wěn)定,對(duì)光照、溫度和空氣中的氧極其敏感[12],所以在提取、分離、純化過(guò)程中盡可能避免強(qiáng)光照射和高溫環(huán)境,濃縮、干燥的溫度控制在60℃以下,浸膏務(wù)必密封,冷藏保存。

[1]江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1986:1488-1489.

[2]潘映紅,郭寶林.國(guó)產(chǎn)金絲桃屬植物有效成分研究概況[J].中藥材,1993,16(8):40-42.

[3]趙曉虹,梁劍平,祝艷華,等.金絲桃素蛋白絡(luò)合物體外抗H5N1亞型禽流感病毒的活性研究[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志,2006(3):13-15.

[4]祝艷華,梁劍平,趙曉虹,等.金絲桃素蛋白絡(luò)合物在雞體內(nèi)對(duì)H9N2亞型禽流感病毒殺滅效果的研究[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志,2006(3):5-8.

[5]王曙陽(yáng),楊林西,梁劍平,等.金絲桃素的體外抗口蹄疫病毒活性[J].中國(guó)獸醫(yī)科技,2005,35(4):310-314.

[6]潘映紅,郭寶林,彭勇.國(guó)產(chǎn)金絲桃屬植物資源現(xiàn)狀及利用前景[J].中藥材,1993,16(3):14-18.

[7]李俊,莫琪,張健.乙醇法提取金絲桃素的研究[J].現(xiàn)代化工,1998,18(8):27-29.

[8]溫普紅,王曉玲,楊得鎖.貫葉連翹中金絲桃素醇法提取工藝的改進(jìn)[J].中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志,2002,33(4):174-176.

[9]張博.HP LC法測(cè)定貫葉連翹中貫葉金絲桃素含量[J].中草藥,2001,32(4):321-322.

[10]崔穎,梁劍平,王學(xué)紅,等.RP-HP LC測(cè)定貫葉連翹中的金絲桃素含量[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2005,26(9):43-45.

[11]溫普紅,王曉玲,張亞妮.T LC-分光光度法測(cè)貫葉連翹中金絲桃素含量[J].應(yīng)用化工,2000,29(3):30-31.

[12]白潔,楊得坡,王冬梅,等.貫葉金絲桃素的化學(xué)不穩(wěn)定性及藥理活性[J].中草藥,2004,35(3):338-340.