熱休克蛋白70的生物學(xué)功能及應(yīng)用的研究進展

武漢工業(yè)學(xué)院 楊震國

熱休克蛋白（HSP）是指所有生物細(xì)胞在應(yīng)激原（包括原核細(xì)胞及真核細(xì)胞在受熱、生物應(yīng)激、理化因素等）誘導(dǎo)下所產(chǎn)生的高度保守的一組蛋白質(zhì)，根據(jù)其分子質(zhì)量大小可將HSP分為HSP 110、HSP 90、HSP 70、HSP 60 和 HSP 28 等 5 個家族。HSP 70是熱休克家族中研究最為深入的一種。近年來，許多試驗研究表明，HSP 70具有分子伴侶、抗細(xì)胞凋亡、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等功能，適量的HSP 70對于動物機體及人類的急性胰腺炎、常見肝病治療、腸黏膜保護和急性肺損傷等都具有非常重要的作用。

1 HSP 70的結(jié)構(gòu)及其分類

1.1 HSP 70的結(jié)構(gòu)組成 一般認(rèn)為，HSP 70蛋白包括ATP酶區(qū)、多肽結(jié)合區(qū)（或底物識別區(qū)）和功能不明區(qū)三部分。

1.1.1 ATP酶區(qū) ATP酶區(qū)位于HSP 70蛋白的氨基端，包括385個氨基酸殘基，相對分子質(zhì)量為44 ku，此區(qū)域高度保守，具有水解ATP的活性。HSP 70的ATP酶區(qū)在結(jié)構(gòu)上與己糖磷酸激酶和肌動蛋白的ATP酶區(qū)有著高度的同源性（陳蘭英等，2004）。

1.1.2 多肽結(jié)合區(qū) 多肽結(jié)合區(qū)位于HSP 70蛋白的羧基端，分子質(zhì)量約27 ku，由底物結(jié)合域和可變動功能域組成，具有結(jié)合未折疊多肽的功能。Kumaraguru等（2002）認(rèn)為，HSP 70的多肽結(jié)合區(qū)能與主要組織相容性復(fù)合物抗原結(jié)合，能夠協(xié)助區(qū)分體細(xì)胞和入侵細(xì)胞。

1.1.3 功能不明區(qū) 功能不明區(qū)包括近C端大小為10 ku結(jié)構(gòu)多變氨基酸序列，具體的作用機制現(xiàn)在還不明確。

1.2 HSP 70的分類 HSP 70家族主要包括4類蛋白質(zhì)：（1）結(jié)構(gòu)型HSC 70（Heat shock cognate 70，p 73），存在于細(xì)胞漿中，在所有的細(xì)胞內(nèi)均能表達，是哺乳動物細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)蛋白，外界應(yīng)激原刺激后只有少量增加；（2）誘導(dǎo)型 HSP 70（p 72），存在于細(xì)胞核中，在正常細(xì)胞內(nèi)表達量較少，細(xì)胞發(fā)生應(yīng)激后，表達量迅速增加；（3）葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白 78（GRP 78），位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上；（4）葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白 75（GRP 75），位于線粒體內(nèi)。 GRP 78和 GRP 75在機體受到應(yīng)激時稍有表達，它們在細(xì)胞內(nèi)分別以分子伴侶的形式發(fā)揮作用（任寶波等，2005）。

2 HSP 70的主要生物學(xué)功能

2.1 分子伴侶 HSP 70是一種非特異性的細(xì)胞保護蛋白，是目前發(fā)現(xiàn)的主要分子伴侶蛋白之一。在應(yīng)激狀態(tài)下，動物機體的蛋白質(zhì)代謝會發(fā)生紊亂，某些蛋白質(zhì)肽鏈伸展、失去原有盤旋及折疊狀態(tài)、分子空間構(gòu)型改變甚至使寡聚復(fù)合物解聚，以致喪失原有功能。此時，HSP 70可作為分子伴侶，與新生、未折疊、錯折疊或聚集的蛋白質(zhì)結(jié)合，使這些蛋白質(zhì)聚集物解離，從而減少產(chǎn)生不溶性聚集物的危險性，并加速肽鏈的正確折疊和重折疊，最終調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的正常合成與代謝。HSP 70同時還促進某些變性蛋白質(zhì)的降解和清除，重新激活某些酶，維持細(xì)胞的正常生理功能（Diamant等，2000）。

2.2 抗細(xì)胞凋亡 有害應(yīng)激包括熱休克、氧化應(yīng)激等可以導(dǎo)致細(xì)胞程序性死亡，即細(xì)胞凋亡。HSP 70現(xiàn)在被認(rèn)為是一種抗凋亡蛋白，但其作用機制比較復(fù)雜。Beere等（2000）研究證實，HSP 70可以在誘導(dǎo)凋亡酶激活因子-1（Apaf-1）合成后，與之結(jié)合，同時阻止caspase-9前體被聚集到A-paf-1凋亡蛋白體上，從而阻斷了功能性凋亡蛋白體的裝配，抑制細(xì)胞凋亡。另外，HSP 70還可能通過抑制應(yīng)激激酶P 38的活性發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用。Yin等（2001）研究報道，HSP 70的陽性率與細(xì)胞凋亡指數(shù)成正比。

2.3 抗氧化 Hiratsuka等（1999）研究證明，用轉(zhuǎn)基因的方法誘導(dǎo)呼吸上皮細(xì)胞表達HSP 70，可以減輕高濃度氧或H2O2介導(dǎo)的蛋白氧化、脂質(zhì)過氧化、中性粒細(xì)胞浸潤和細(xì)胞凋亡，防止ATP耗竭，從而起到細(xì)胞保護作用。HSP 70發(fā)揮抗氧化作用的機制很可能是：（1）HSP 70抑制氧自由基的關(guān)鍵酶即NADPH氧化酶的產(chǎn)生，通過反饋作用減少氧自由基；（2）HSP 70直接釋放內(nèi)源性過氧化酶如超氧化物歧化酶，使機體內(nèi)源性抗氧化劑合成和釋放增加，對隨之而來的應(yīng)激有較強的抵抗作用。

2.4 免疫調(diào)節(jié) Schett等（1998）研究認(rèn)為，細(xì)胞外HSP 70來源于細(xì)胞內(nèi)的HSP 70的釋放。細(xì)胞外的HSP 70通過其受體的介導(dǎo)來對免疫細(xì)胞的功能進行調(diào)節(jié)。動物機體內(nèi)許多的細(xì)胞表面均存在細(xì)胞外HSP 70受體，例如，自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）、中性粒細(xì)胞、B細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞等。

正常狀態(tài)下，核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）與其抑制蛋白（IκB）結(jié)合成復(fù)合物后存在于細(xì)胞液中，此時NF-κB處于失活狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞受到刺激（感染、氧化和抗原等）時，IκB發(fā)生磷酸化后被相應(yīng)的蛋白酶降解，NF-κB被激活。NF-κB隨即通過核膜上受體進入細(xì)胞核與靶基因κB位點結(jié)合，迅速誘導(dǎo)靶基因轉(zhuǎn)錄，形成的大量的炎性介質(zhì)（如IL-1、TNF-α 等），引起炎癥反應(yīng)。

Chan等（2004）試驗證實，HSP 70可與 NF-κB結(jié)合，從而阻斷NF-κB向細(xì)胞核移位。與此同時，HSP 70可誘導(dǎo)IκB合成，也可通過阻止IκB磷酸化而抑制IκB降解，從而增加IκB的含量，抑制NF-κB活化，最終使HSP 70參與機體的免疫調(diào)節(jié)。此外，細(xì)胞外HSP 70可以作為免疫肽傳送者，誘導(dǎo)細(xì)胞因子的釋放或為NK細(xì)胞提供識別位點，從而對機體組織器官起到免疫保護作用。

3 HSP 70在疾病治療方面的應(yīng)用

3.1 HSP 70與急性胰腺炎 試驗證實，預(yù)先誘導(dǎo)胰腺HSP 70表達具有保護由精氨酸、蛙皮素、丁基氯化錫（DBTC）誘導(dǎo)的大鼠急性胰腺炎的作用。Bhagat等（2002）在動物模型體內(nèi)注射HSP 70反義引物，抑制熱應(yīng)激誘導(dǎo)HSP 70表達，恢復(fù)了最大量蛙皮素引起胰腺內(nèi)胰蛋白酶原的激活能力，淀粉酶和胰蛋白酶原激活肽（TAP）水平升高，結(jié)果發(fā)現(xiàn)預(yù)先熱應(yīng)激的保護作用失效。另有研究報道，由亞砷酸鈉誘導(dǎo)大鼠體內(nèi)HSP 70高效表達的情況下，蛙皮素和精氨酸誘導(dǎo)的胰腺炎得到緩解（Bhagat等，2008）。Grise等（2000）發(fā)現(xiàn)，預(yù)先熱休克可以保護乙硫酸食物（CDE）誘發(fā)小鼠壞死型胰腺炎。Qiu等（2006）研究發(fā)現(xiàn)，HSP 70通過抑制白細(xì)胞介素和誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶（iNOS）的生成而起保護胰腺生理功能作用。

總而言之，HSP 70可能是通過干擾溶酶體酶／消化酶原的共區(qū)域化和溶酶體酶使腺泡內(nèi)胰蛋白酶原活性降低而起到保護胰腺的作用。

3.2 HSP 70與肝病治療 肝癌（HCC）是臨床常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生發(fā)展過程漫長而又復(fù)雜。王星輝等（2008）對78例肝硬化患者標(biāo)本進行試驗后，發(fā)現(xiàn)HSP 70可能作為主要的抑制凋亡蛋白參與HCC的凋亡調(diào)控。Fidlay等（1988）的研究表明，HSP 70作為一種應(yīng)激蛋白在HCC中高表達，可能與P 53突變有關(guān)。HSP 70能與突變型P 53選擇性結(jié)合成穩(wěn)定復(fù)合物，使細(xì)胞核內(nèi)P 53蛋白轉(zhuǎn)運到細(xì)胞漿中，從而喪失控制細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控能力。

陳輝等（2002）對肝細(xì)胞生長因子（HGF）研究后發(fā)現(xiàn)，HGF通過誘導(dǎo)HSP 70合成來抑制腫瘤壞死因子（TNF-α）所介導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡，這對于肝功能衰竭的治療提供了新思路。

但近年來有學(xué)者則認(rèn)為，熱休克反應(yīng)是應(yīng)激反應(yīng)的一種，嚴(yán)重創(chuàng)傷時它會出現(xiàn)過度反應(yīng)，這時產(chǎn)生的HSP 70與正常生理和一般性應(yīng)激反應(yīng)情況下的HSP 70可能存在著功能性的差異，動物應(yīng)激后高效表達的HSP 70可能對肝臟造成繼發(fā)性損傷。有試驗發(fā)現(xiàn)，HSP 70在機體嚴(yán)重創(chuàng)傷后的高表達，可能會影響糖皮質(zhì)激素抗炎功能的發(fā)揮，從而導(dǎo)致創(chuàng)傷后繼發(fā)性肝損傷，但其作用機制則有待進一步研究（朱梅菊等，2005）。

3.3 HSP 70與腸黏膜保護 黏膜防御屏障與損傷因子或涉及到黏膜損傷形成的過程之間的平衡是非常重要的。腸道不僅是消化、吸收和營養(yǎng)物質(zhì)交換的重要場所，也是人體最大的免疫器官，而黏膜屏障是腸道最重要的一道屏障。腸道上皮細(xì)胞（IEC）是腸黏膜屏障的重要組成部分，它們是阻止抗原進入機體免疫系統(tǒng)的重要屏障，對有害病原菌產(chǎn)生免疫防御。Ohkawara等（2006）研究認(rèn)為，作為細(xì)胞內(nèi)保護者的熱休克蛋白對腸道上皮細(xì)胞有重要的保護作用。Jin等（1997）報道，熱處理產(chǎn)生的HSP 70對腸黏膜具有保護作用。袁志強等（2003）證實，亞砷酸鈉誘導(dǎo)的 HSP 70表達增加可明顯減輕大鼠嚴(yán)重燙傷后早期的腸黏膜屏障破壞，降低腸黏膜通透性，減少腸道內(nèi)毒素移位。Odashima等（2000）通過鋅L型肌肽誘導(dǎo)大鼠直腸內(nèi)HSP 70的表達的研究發(fā)現(xiàn)，HSP 70可以通過抑制NF-κB的激活來提高對腸黏膜的保護功能。Ehrenfried等 （1995） 和 Wischmeyer等（1997）則認(rèn)為，谷氨酰胺（Gln）對腸道的保護作用是通過誘導(dǎo)HSP 70的表達而產(chǎn)生的。

綜上所述，HSP 70可能通過多種途徑參與腸黏膜的保護，它可能通過對IEC進行細(xì)胞保護而間接地維持黏膜防御屏障與損傷因子或涉及到黏膜損傷形成的過程之間的平衡。

3.4 HSP 70與急性肺損傷的保護作用 肺是感染性疾病、膿毒癥常累及的靶器官，常并發(fā)急性肺損傷。其病理特點為肺泡毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞損傷，表現(xiàn)為廣泛肺水腫和微小肺不張。臨床上表現(xiàn)為低氧血癥、呼吸頻速和X線胸片出現(xiàn)雙肺彌漫性浸潤。Hiratsuka等（1999）對大鼠靜脈注射載有HSP 70基因的腺病毒，使其肺組織細(xì)胞大量表達HSP 70后，取出肺臟進行移植，則肺動脈血氧含量明顯高于對照組，并且肺濕/干比率和肺組織髓過氧化物酶活性均顯著降低，明顯的緩解了急性肺損傷癥狀。Wischmeyer等（2003）報道，用谷氨酰胺預(yù)處理，可以減輕細(xì)菌脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的組織損傷，促進大鼠肺等組織細(xì)胞中HSP 70表達，減少外周血單核細(xì)胞致炎因子的釋放，而這一機制可能是通過誘導(dǎo)HSP 70表達增加實現(xiàn)的。于東云等（2006）采用LPS誘導(dǎo)Wistar大鼠急性肺損傷，觀察由此引起的支氣管、細(xì)支氣管和肺上皮細(xì)胞HSP 70應(yīng)激性表達，免疫組織化學(xué)陽性細(xì)胞率和蛋白免疫印跡（Western blotting）結(jié)果均高于正常對照組，提示HSP 70參與肺損傷后組織保護作用。目前認(rèn)為，細(xì)胞凋亡是急性肺損傷發(fā)病機制之一。因此，HSP 70可以通過抑制肺組織細(xì)胞凋亡保護急性肺損傷，但確切的作用機制目前尚無定論。

4 小結(jié)與展望

HSP 70具有較強分子伴侶、抗細(xì)胞凋亡、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等功能。HSP 70在應(yīng)激狀態(tài)與正常生理狀態(tài)的表達水平存在顯著差異，其是否可以作為監(jiān)測指標(biāo)，用于評價不同動物機體的環(huán)境適應(yīng)能力、身體健康狀況以及應(yīng)激程度等有待進一步研究。另外，尋找對機體無損傷或損傷小的強HSP 70誘導(dǎo)劑，以便發(fā)揮HSP 70功能來保護動物免遭有害因素?fù)p害，也是其推廣應(yīng)用急待解決的問題。

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