寵物重要疫病免疫與監(jiān)測

張改平

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)部動物免疫學(xué)重點(diǎn)開放實驗室；河南省動物免疫學(xué)重點(diǎn)實驗室，鄭州 450002）

隨著國民生活水平的提高和生活方式的改變，我國寵物的飼養(yǎng)數(shù)量與種類急劇增加，寵物產(chǎn)業(yè)也迅速興起，伴隨而來的寵物疫病防控問題越來越突出，威脅到了人類自身的安全與公共衛(wèi)生安全。尤其是發(fā)生傳染性非典型肺炎（SARS）和禽流感疫情以來，寵物疫病的防控問題及這些疫病與人類的關(guān)系引起了社會的廣泛關(guān)注。

早期寵物的飼養(yǎng)主要以犬、貓為主，隨著寵物種類越來越多樣化，其它種類的寵物也逐漸進(jìn)入人們的生活，從犬、貓、觀賞魚、鳥、兔、龜，到比較另類的蝎子、蜘蛛、蜥蜴等，涵蓋多種動物種類，包括哺乳類、鳥類、魚類、昆蟲類、兩棲與爬行類等。而這些寵物多數(shù)未實施相關(guān)的免疫措施，其相關(guān)疫病的潛在危險性不容忽視，直接威脅著人類的健康與安全。

1 寵物重要疫病

寵物的疫病種類繁多，包括病毒病、細(xì)菌病和寄生蟲病等，其中多數(shù)疫病為人獸共患傳染病，如狂犬病、SARS、禽流感、H1N1甲型流感、埃博拉出血熱、裂谷熱、尼帕腦炎、西尼羅熱、弓形蟲病、旋毛蟲病、萊姆病、鼠疫和鉤端螺旋體病等，具有非常重要的公共衛(wèi)生意義。近年來，重大動物源性人獸共患病在我國頻頻暴發(fā)流行，嚴(yán)重威脅我國相關(guān)產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展和公共衛(wèi)生安全，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。例如，狂犬病疫情在我國持續(xù)存在，并重新呈現(xiàn)連續(xù)快速增長的趨勢，南方和東部地區(qū)的狂犬病疫情居高不下，既往發(fā)病率較低的中原和華北地區(qū)疫情也急劇上升。2007年全國已有23?。▍^(qū)、市）984個縣區(qū)報告狂犬病疫情，占全國縣區(qū)總數(shù)的34.30％，全國報告死亡數(shù)高達(dá)3 300人。2002年11月～2003年7月SARS疫情在我國和世界32個國家和地區(qū)暴發(fā)流行，全球報告病例8437例，死亡813人，中國內(nèi)地報告病例5327例，死亡348人。禽流感疫情持續(xù)發(fā)生，截至2010年8月3日，全球共報告人感染禽流感503例，死亡299例，死亡率59.44％，其中中國感染39例，死亡26例。2009年H1N1甲型流感全球大流行，截至2010年8月1日，疫情已蔓延214個國家或地區(qū)，全球報告H1N1甲型流感死亡病例18 449例；截至2010年3月31日，全國31個省份累計報告甲型H1N1流感確診病例12.7余萬例，其中境內(nèi)感染12.6萬例，境外輸入1 228例，死亡病例800例。弓形蟲在人體多為隱性感染，孕婦可經(jīng)胎盤傳染給胎兒，與優(yōu)生有密切關(guān)系。目前，我國疫源地鼠疫進(jìn)入活躍期，動物鼠疫疫情出現(xiàn)了回升趨勢鼠疫疫情。此外，犬類疫?。ㄈ缛翢?、犬細(xì)小病毒病、犬傳染性肝炎、犬腺病毒病、犬副流感、犬冠狀病毒病和犬輪狀病毒病等）和貓類疫病（如貓瘟熱、貓傳染性鼻氣管炎、貓杯狀病毒病、貓傳染性腹膜炎、貓白血病和貓冠狀病毒病等）也對寵物和野生動物造成嚴(yán)重危害，制約寵物產(chǎn)業(yè)健康、可持續(xù)發(fā)展。

2 寵物疫苗與免疫監(jiān)測

2.1 寵物疫苗

我國是全球最大的疫苗生產(chǎn)國，疫苗的種類和數(shù)量為世界之最，也是世界上疫苗產(chǎn)品生產(chǎn)企業(yè)最多的國家。我國年產(chǎn)各種疫苗10億人份，其中用于預(yù)防乙肝、脊髓灰質(zhì)炎、麻疹、百日咳、白喉、破傷風(fēng)的兒科常見病的疫苗生產(chǎn)量達(dá)到5億人份，已經(jīng)全部實現(xiàn)計劃免疫接種。動物疫苗的研發(fā)和生產(chǎn)則主要以經(jīng)濟(jì)動物疫苗為主，2009年中國動物疫苗市場規(guī)模達(dá)62億元左右，同比增長14.8％，未來動物疫苗市場規(guī)模仍將穩(wěn)定上升。據(jù)統(tǒng)計，2008年我國動物疫苗市場豬、牛、家禽等經(jīng)濟(jì)型動物疫苗比例分別為44.37％、14.13％和24.22％，而寵物疫苗僅占1.66％。受國家動物疫苗采購政策影響，目前中國在口蹄疫疫苗、禽流感疫苗、豬藍(lán)耳疫苗、豬瘟等傳統(tǒng)的國家強(qiáng)制疫苗方面發(fā)展比較成熟，2009年國家強(qiáng)制疫苗占整個動物疫苗市場的86％以上份額，并且這部分市場基本被中牧股份、青島易邦、金宇集團(tuán)、哈藥生物疫苗以及天康生物等內(nèi)資企業(yè)占據(jù)，2009年上述五家企業(yè)合占中國動物疫苗市場66.7％份額，而國內(nèi)市場化動物疫苗，特別是寵物疫苗進(jìn)口依存度較高。

寵物疫苗市場提供的主要是用于犬和貓的疫苗，其中犬貓兼用疫苗為狂犬疫苗（荷蘭英特威、美國富道、美國輝瑞、法國維克、梅利亞），犬用疫苗包括犬咳疫苗（荷蘭英特威）、犬六聯(lián)疫苗（荷蘭英特威、美國富道、法國維克、法國優(yōu)利康）、犬七聯(lián)疫苗（荷蘭英特威）、犬五聯(lián)疫苗（百思特），貓用疫苗為貓三聯(lián)疫苗（荷蘭英特威、美國富道、法國維克），而其他寵物疫苗則十分匱乏。國內(nèi)在寵物疫苗研究方面比較滯后，夏咸柱院士率先研制成功的“犬五聯(lián)活疫苗”，預(yù)防犬瘟熱、細(xì)小病毒、傳染性肝炎、犬副流感、狂犬病，獲得了二類新獸藥證書和國家科技進(jìn)步二等獎（2000），并成功進(jìn)行了產(chǎn)業(yè)化開發(fā)，開創(chuàng)了中國寵物疫苗的先河，但我國自主研發(fā)的寵物疫苗產(chǎn)品還非常有限。國產(chǎn)寵物疫苗僅有犬狂犬病、犬瘟熱、副流感、腺病毒病、細(xì)小病毒病五聯(lián)活疫苗（吉林五星）、狂犬病活疫苗（Flury株）（浙江易邦）、犬狂犬病、犬瘟熱、副流感、腺病毒和細(xì)小病毒病五聯(lián)活疫苗（楊凌綠方）和犬瘟熱活疫苗（CDV-11株）（齊魯）等4種疫苗產(chǎn)品獲得新獸藥注冊，并獲得農(nóng)業(yè)部核發(fā)的獸藥產(chǎn)品批準(zhǔn)文號。目前，國內(nèi)寵物疫苗市場由進(jìn)口疫苗占主導(dǎo)地位，2002年英特威狂犬疫苗注冊成功，中國開始進(jìn)口寵物疫苗，形成以進(jìn)口疫苗產(chǎn)品為核心的寵物疫苗市場，銷量占總體市場30％左右，銷售額占總銷售額的70％，主要來自美國、荷蘭、法國等企業(yè)，產(chǎn)品在單價和市場占有率上都具有十分突出的優(yōu)勢。然而，上述進(jìn)口寵物疫苗僅有犬細(xì)小病毒病活疫苗（美國輝瑞）、犬瘟熱、腺病毒2型、副流感和細(xì)小病毒病四聯(lián)活疫苗（美國輝瑞）、犬、貓狂犬病滅活疫苗（荷蘭英特威）、狂犬病滅活疫苗（美國富道）、犬瘟熱、細(xì)小病毒病二聯(lián)活疫苗（荷蘭英特威）、犬瘟熱、腺病毒病、細(xì)小病毒病、副流感病毒2型呼吸道感染四聯(lián)活疫苗-犬鉤端螺旋體病、黃疸出血鉤端螺旋體病二聯(lián)滅活疫苗（法國梅利亞）、狂犬病滅活疫苗（VPl2株）（法國維克）、犬瘟熱、腺病毒2型、細(xì)小病毒病、副流感四聯(lián)活疫苗-犬冠狀病毒病滅活疫苗（美國富道）、犬瘟熱、傳染性肝炎、細(xì)小病毒病、副流感四聯(lián)活疫苗（荷蘭英特威）、犬鉤端螺旋體（犬型、黃疸出血型）二價滅活疫苗（荷蘭英特威）和貓鼻氣管炎、嵌杯病毒病、泛白細(xì)胞減少癥三聯(lián)滅活疫苗（美國富道）等11種疫苗為合法注冊的進(jìn)口疫苗產(chǎn)品，寵物疫苗市場有相當(dāng)一部分疫苗為非正常渠道進(jìn)入國內(nèi)的進(jìn)口疫苗產(chǎn)品，嚴(yán)重影響我國寵物疫苗市場。在寵物疫苗知識產(chǎn)權(quán)方面，近10年國內(nèi)科研院所或企業(yè)申報寵物疫苗相關(guān)國家發(fā)明專利11項，主要涉及狂犬病、犬瘟熱等犬類疫苗，國外研究機(jī)構(gòu)或公司在我國申報發(fā)明8項，涉及狂犬病、犬瘟熱、犬流感、犬萊姆病、鉤端螺旋體和貓杯狀病毒等犬貓疫苗，但上述發(fā)明專利均尚未獲得國家知識產(chǎn)權(quán)局授權(quán)。

此外，寵物疫苗市場也存在疫苗質(zhì)量良莠不齊的現(xiàn)象，部分廠家生產(chǎn)的狂犬疫苗批次之間效價不穩(wěn)定，產(chǎn)品檢驗把關(guān)不嚴(yán)，甚至生產(chǎn)銷售劣質(zhì)狂犬疫苗或者沒有在低溫（2～8）℃條件下保存、運(yùn)輸狂犬疫苗，影響了疫苗質(zhì)量。例如，國家食品藥品監(jiān)督管理局在對人用狂犬病疫苗進(jìn)行監(jiān)督檢查中發(fā)現(xiàn)，江蘇延申生物科技股份有限公司和河北福爾生物制品有限公司2008年7～10月期間生產(chǎn)的7個批次人用狂犬病疫苗質(zhì)量存在問題，遼寧大連金港安迪生物制品有限公司2008年生產(chǎn)的部分人用狂犬病疫苗中含有違法添加的核酸物質(zhì)。疫苗質(zhì)量監(jiān)控體系和機(jī)制的缺失是導(dǎo)致問題疫苗頻出的主要原因，因此建議系統(tǒng)開展疫苗質(zhì)量監(jiān)測技術(shù)研究，建立以抗原檢測試紙等快速檢測技術(shù)為基礎(chǔ)的疫苗質(zhì)量監(jiān)控體系，有力保障寵物疫苗在生產(chǎn)和流通過程中的質(zhì)量安全。

2.2 疫苗免疫與監(jiān)測

疫苗免疫在動物疫病預(yù)防與控制中發(fā)揮著極其重要的作用，提高寵物疫苗的接種率是控制寵物疫病的有效手段。據(jù)WHO推薦，一個地區(qū)的犬接種狂犬疫苗的免疫率達(dá)到80％，就可以切斷狂犬病的傳染源，防止狂犬病在該地區(qū)流行。2010年世界狂犬病日（9.28）的主題也因此確定為：“免疫是預(yù)防動物狂犬病最有效措施”。我國飼養(yǎng)的犬、貓種類多，數(shù)量大、分布廣，狂犬病疫情持續(xù)高發(fā)的主要原因就在于傳染源數(shù)量龐大，接種率低。近年來，農(nóng)村地區(qū)飼養(yǎng)犬只看家護(hù)院更為普遍，犬只數(shù)量大大增加。調(diào)查表明，我國南方農(nóng)村地區(qū)犬密度可高達(dá)15至20只/100人，貓密度可高達(dá)5至10只/100人，平均每戶至少養(yǎng)有1只以上犬或貓。隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展，城市寵物飼養(yǎng)逐漸增多，犬、貓等密度也迅速增加，抽樣調(diào)查結(jié)果約5只/100人。據(jù)統(tǒng)計，全國約有犬只7 500萬。犬、貓散養(yǎng)現(xiàn)象非常普遍，農(nóng)村地區(qū)幾乎都是散養(yǎng)（90％～95％），極易發(fā)生動物間傳播及動物致傷情況。此外，調(diào)查表明，我國大部分地區(qū)的犬、貓免疫率低，農(nóng)村地區(qū)犬只免疫率僅為10％至20％，貓則幾乎沒有進(jìn)行過免疫，形成不了有效的免疫屏障。

在檢測試劑知識產(chǎn)權(quán)方面，近10年國內(nèi)科研院所或企業(yè)申報寵物疫苗相關(guān)國家發(fā)明專利9項，主要涉及狂犬病膠體金檢測試紙和酶聯(lián)免疫試劑盒；禽流感病毒ELISA檢測試劑盒、禽流感病毒乳膠凝集試驗檢測試劑盒、豬旋毛蟲抗體快速檢測試紙條、禽流感病毒檢測試紙條和鸚鵡熱衣原體抗體膠體金檢測試紙條等5種檢測試劑獲新獸藥證書。WHO推薦的狂犬病抗體檢測標(biāo)準(zhǔn)方法為小鼠中和法和快速免疫熒光灶抑制試驗（RFFIT），上述2種方法能有效反應(yīng)免疫動物的中和抗體水平，對疫苗免疫效果進(jìn)行評價，但需要具備相當(dāng)?shù)膶嶒灄l件和技術(shù)水平，不能適應(yīng)獸醫(yī)臨床的客觀實際，目前市場上尚無合法注冊的狂犬病抗體免疫檢測試劑，無法對狂犬疫苗免疫抗體水平進(jìn)行實時檢測和監(jiān)測，導(dǎo)致臨床獸醫(yī)和相關(guān)人員只能按程序進(jìn)行接種和免疫，而無法明確疫苗免疫效果。因此，建議系統(tǒng)開展免疫抗體檢測技術(shù)研究，建立以抗體檢測試紙等快速檢測技術(shù)為基礎(chǔ)的免疫抗體監(jiān)測體系。

3 免疫試紙快速檢測技術(shù)

免疫試紙快速檢測技術(shù)是在單克隆抗體技術(shù)、膠體金免疫層析技術(shù)和新材料技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型體外檢測技術(shù)，最早用于人早孕的便捷檢測，是理想的即時檢測（point-of-care test，POCT）和現(xiàn)場檢測技術(shù)。該檢測技術(shù)不需要專業(yè)技能和儀器，自1980年代末建立以來發(fā)展迅速，廣泛應(yīng)用于各種分析物的定性和半定量快速檢測，包括抗原、半抗原、抗體和核酸，已成為當(dāng)今最快速敏感的免疫學(xué)檢測技術(shù)之一。農(nóng)業(yè)部動物免疫學(xué)重點(diǎn)開放實驗室從1995年開始系統(tǒng)開展免疫試紙快速檢測技術(shù)研究，率先將該技術(shù)引入動物疫病快速診斷領(lǐng)域，建立了抗原、抗體和半抗原3類靶標(biāo)物的免疫試紙快速檢測技術(shù)體系，研制成功動物疫病及人獸共患病快速檢測試紙和動物源食品安全快速檢測試紙系列產(chǎn)品，檢測時間僅需要數(shù)分鐘，無需任何附加試劑和設(shè)備，人人均可操作，解決了傳統(tǒng)檢測方法費(fèi)時（數(shù)小時至數(shù)天）、成本高（需貴重儀器或試劑）、操作復(fù)雜等問題，真正實現(xiàn)了長期以來人們在檢測技術(shù)領(lǐng)域所追求的“快速、簡便、特異、敏感”的目標(biāo)，提高了我國在該領(lǐng)域的研發(fā)水平。

3.1 抗原免疫試紙快速檢測技術(shù)

農(nóng)業(yè)部動物免疫學(xué)重點(diǎn)開放實驗室系統(tǒng)開展了雞傳染性法氏囊?。↖BD）、雞新城疫（ND）、禽流感（AI）、豬瘟（CSF）等重大動物疫病快速檢測技術(shù)研究，制備和鑒定了多種動物病毒的高特異性、高親和力配對單克隆抗體，解決了試紙研制中動物病毒抗原變異大、抗體親和力低、識別譜窄等關(guān)鍵技術(shù)難題，以雙抗體夾心模式建立了抗原免疫試紙快速檢測技術(shù)體系，研制成功動物疫病抗原快速檢測試紙系列產(chǎn)品，獲得了國家發(fā)明專利（ZL99101537.1），開辟了動物疫病快速診斷新領(lǐng)域，為重大動物疫病的快速檢測提供了新的技術(shù)支撐，也使我國在此研究領(lǐng)域居國際前沿?？乖瓩z測試紙產(chǎn)品代表產(chǎn)品包括雞傳染性法氏囊病毒檢測試紙、雞新城疫病毒檢測試紙和旋毛蟲抗原檢測試紙等，雞傳染性法氏囊病毒檢測試紙是國內(nèi)外第一個動物疫病快速檢測試紙產(chǎn)品，2003年獲國家二類新獸藥證書［（2003）新獸藥證字第39號］，2004年獲國家技術(shù)發(fā)明二等獎。旋毛蟲抗原檢測試紙以自主研制的高特異性、高親和力、配對的抗旋毛蟲分泌（ES）抗原單克隆抗體為基礎(chǔ)，特異識別旋毛蟲分泌抗原，且與弓形體蟲、囊蟲、住肉孢子蟲和細(xì)頸囊尾蚴等其它主要常發(fā)寄生蟲無交叉反應(yīng)，敏感性與酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）相當(dāng)；對臨床樣品的檢測表明，試紙與ELISA的符合率為97.22％，可用于寵物旋毛蟲病的快速診斷與免疫監(jiān)測，2008年獲河南省科技進(jìn)步一等獎。

3.2 抗體免疫試紙快速檢測技術(shù)

農(nóng)業(yè)部動物免疫學(xué)重點(diǎn)開放實驗室系統(tǒng)開展了動物疫病抗體快速檢測技術(shù)研究，建立了口蹄疫病毒（FMDV）、豬瘟病毒（CSFV）、雞新城疫病毒（NDV）、旋毛蟲等多種病原的檢測抗原制備方法，解決了免疫檢測抗原活性低、非特異性反應(yīng)高、提取制備難等突出問題，建立了抗體免疫試紙快速檢測技術(shù)體系，研制出動物疫病及人獸共患病抗體快速檢測試紙系列產(chǎn)品，實現(xiàn)了動物疫病抗體水平的實時監(jiān)測，為疫苗免疫效果評價和動物疫病監(jiān)測提供了先進(jìn)的技術(shù)手段?？贵w檢測試紙產(chǎn)品代表產(chǎn)品包括旋毛蟲病抗體檢測試紙、口蹄疫O型抗體檢測試紙、傳染性法氏囊抗體檢測試紙、新城疫抗體檢測試紙和犬狂犬病抗體檢測試紙等，旋毛蟲病抗體檢測試紙是國內(nèi)外第一個動物寄生蟲病快速檢測試紙產(chǎn)品，2007年獲國家二類新獸藥證書［（2007）新獸藥證字36號］，成為了國內(nèi)第一個獲得國家新獸藥證書的人獸共患寄生蟲病抗體檢測試紙，2008年獲河南省科技進(jìn)步一等獎。犬狂犬病抗體檢測試紙是與軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所夏咸柱院士聯(lián)合研發(fā)的抗體快速檢測試紙產(chǎn)品，該試紙以高度純化的狂犬病病毒為檢測抗原，特異性強(qiáng)、敏感性高，與犬瘟熱、犬細(xì)小病毒、犬腺病毒、犬副流感病毒和犬冠狀病毒與犬其它主要疫病血清無交叉反應(yīng)，對狂犬病病毒抗體的檢測限為0.001IU/mL；對臨床血清樣品的檢測表明，試紙與快速熒光灶抑制試驗（RFFIT）的符合率為98.9％，可用于犬狂犬病疫苗免疫效果評價和抗體水平監(jiān)測。

免疫試紙快速檢測技術(shù)特別適合于獸醫(yī)臨床對寵物疫病的快速診斷和免疫監(jiān)測，顯示巨大的發(fā)展?jié)摿蛻?yīng)用前景，被認(rèn)為是微生物和傳染病及寄生蟲病檢測技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化最有前途的新技術(shù)之一，已成為動物疫病快速檢測的主要發(fā)展趨勢和熱點(diǎn)。鑒于農(nóng)業(yè)部動物免疫學(xué)重點(diǎn)開放實驗室在免疫試紙快速檢測技術(shù)研究的突出貢獻(xiàn)，美國Humana出版集團(tuán)特邀張改平為“Biosensors and Biodetection”（生物傳感器和生物檢測）一書撰寫了“Immunochromatographic Lateral Flow Strip Tests”（免疫試紙快速檢測技術(shù)），這是該技術(shù)首次被正式列入科研和教學(xué)工具書，將對該技術(shù)的廣泛應(yīng)用和相關(guān)領(lǐng)域的科技進(jìn)步產(chǎn)生較為深遠(yuǎn)的影響。

略。