反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)氨氮產(chǎn)生的微生物機(jī)制與調(diào)控手段

浙江大學(xué)奶業(yè)科學(xué)研究所 林波 王迪銘

反芻動(dòng)物與單胃動(dòng)物氮代謝最大的不同在于其瘤胃內(nèi)微生物可將部分飼料蛋白質(zhì)或其他含氮物質(zhì)發(fā)酵成氨氮，而一部分飼料蛋白質(zhì)則被降解成氨基酸和多肽。微生物則利用分解產(chǎn)生的氨氮、氨基酸和多肽重新合成微生物蛋白質(zhì)，被動(dòng)物利用（馮仰廉，2004）。瘤胃氨氮為反芻動(dòng)物微生物提供無(wú)機(jī)氮源的同時(shí)，也因部分飼料優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)被降解，從而造成飼料蛋白質(zhì)的浪費(fèi) （Bach等，2005；盧德勛，2004），而蛋白質(zhì)原料是飼料中價(jià)格比重最大的部分。高蛋白質(zhì)會(huì)導(dǎo)致：（1）高尿氮排放引起的環(huán)境污染；（2）高血漿尿素氮引起的繁殖性能低下；（3）瘤胃鼓氣等。因此，在滿足瘤胃內(nèi)微生物對(duì)氨態(tài)氮需求的情況下盡可能避免飼料蛋白質(zhì)在瘤胃分解，是提高反芻動(dòng)物對(duì)飼料蛋白質(zhì)利用率的有效方法 （Bach等，2005；Morrison和Mackie，1996）。本文對(duì)參與蛋白質(zhì)降解和氨氮生成的瘤胃內(nèi)主要微生物作了簡(jiǎn)述，并對(duì)幾種通過(guò)微生物調(diào)控而抑制瘤胃蛋白質(zhì)降解的手段進(jìn)行總結(jié)。

1 瘤胃內(nèi)蛋白質(zhì)降解和氨生成

瘤胃內(nèi)蛋白質(zhì)的降解是許多不同的微生物分泌的酶共同參與的復(fù)雜過(guò)程，這些酶為胞聯(lián)酶，其作用有賴(lài)于微生物對(duì)飼料的附著。蛋白質(zhì)在瘤胃內(nèi)被水解成多肽、二肽或三肽后繼續(xù)被水解成氨基酸，最終被發(fā)酵成氨氮，氨氮作為微生物生長(zhǎng)和蛋白質(zhì)合成的重要氮源（Firkins等，2007）。瘤胃中細(xì)菌、原蟲(chóng)和真菌等均可參與蛋白質(zhì)水解成多肽反應(yīng)，由多肽到氨的反應(yīng)幾乎都是在細(xì)菌的參與 下 完 成 （Morrison 和 Mackie，1996；Wallace，1996），原蟲(chóng)雖具有較強(qiáng)的脫氨基活性，但由于其數(shù)量有限而作用不明顯。微生物是瘤胃內(nèi)飼料蛋白質(zhì)降解的主導(dǎo)性因素，研究瘤胃內(nèi)微生物對(duì)蛋白質(zhì)的降解機(jī)制有利于提高飼料蛋白質(zhì)的利用效率。

2 幾種關(guān)鍵微生物在瘤胃蛋白質(zhì)降解和氨氮生成中的作用

2.1 瘤胃真菌 瘤胃真菌在纖維降解和淀粉降解中起著重要的作用，但在瘤胃微生物中，其蛋白質(zhì)水解活性則相對(duì)較低。Michel等（1993）體外研究了7株瘤胃具有代表性真菌的蛋白質(zhì)水解能力，包括氨基肽酶、肽鏈內(nèi)切酶、羧肽酶的活性，其中只有一株真菌具有酪蛋白水解活性，這株菌屬于Piromyces屬、所有菌株均未發(fā)現(xiàn)羧肽酶活性，但均具有氨基肽酶活性，只有兩株具有肽鏈內(nèi)切酶活性?？梢?jiàn)，真菌在瘤胃內(nèi)也參與了蛋白質(zhì)降解過(guò)程，但由于瘤胃真菌的研究較晚，有關(guān)真菌對(duì)瘤胃蛋白質(zhì)降解的報(bào)道還相對(duì)較少。

2.2 瘤胃原蟲(chóng) 長(zhǎng)期以來(lái)，原蟲(chóng)都被認(rèn)為是瘤胃氮代謝低效率的主要原因（王夢(mèng)芝等，2008）。相比細(xì)菌只降解可溶性蛋白質(zhì)而言，原蟲(chóng)既可以降解可溶性蛋白質(zhì)，也可以降解不溶性蛋白質(zhì)，原蟲(chóng)在脫氨基作用中也占據(jù)了重要位置，瘤胃原蟲(chóng)脫氨酶的活性較細(xì)菌高3倍。同時(shí)，原蟲(chóng)不能利用瘤胃氨氮，但其分解不溶性蛋白質(zhì)的能力和脫氨基活性極大地促進(jìn)了氨氮產(chǎn)生（林波和陸燕，2009）。此外，原蟲(chóng)對(duì)瘤胃細(xì)菌的吞噬作用使微生物蛋白質(zhì)在瘤胃內(nèi)形成了大量無(wú)效的微循環(huán)，從而降低了飼料蛋白質(zhì)的利用效率（Jouany，1996）。 因此，原蟲(chóng)被認(rèn)為是瘤胃內(nèi)氨氮凈產(chǎn)生微生物。但近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌可通過(guò)水平基因轉(zhuǎn)移（HGT）使瘤胃原蟲(chóng)獲得氨氮利用的基因（Newbold等，2005），對(duì)瘤胃原蟲(chóng)400個(gè)表達(dá)序列標(biāo)簽測(cè)序表明，四種與氨氮利用有關(guān)的酶可能來(lái)自于瘤胃細(xì)菌，說(shuō)明原蟲(chóng)也可能利用部分氨氮，但量很少（Garcia-Vallve等，2000）?，F(xiàn)已經(jīng)研究證實(shí)，具有原蟲(chóng)的瘤胃內(nèi)氨氮濃度是驅(qū)除原蟲(chóng)的瘤胃內(nèi)氨氮濃度的2倍（Firkins等，2007）。雖然抑制原蟲(chóng)可以顯著降低瘤胃氨氮濃度，但目前關(guān)于驅(qū)原蟲(chóng)對(duì)瘤胃氮代謝的促進(jìn)作用尚有爭(zhēng)議，王夢(mèng)芝等（2008）和盧德勛等（1993）認(rèn)為，根據(jù)日糧種類(lèi)的不同，部分驅(qū)除原蟲(chóng)可提高蛋白質(zhì)過(guò)瘤胃率。

2.3 瘤胃細(xì)菌 瘤胃細(xì)菌對(duì)蛋白質(zhì)的降解是相互協(xié)同的關(guān)系，不同菌種分別參與了蛋白質(zhì)降解成氨氮的不同階段反應(yīng)，從而使得飼料蛋白質(zhì)的瘤胃降解順利進(jìn)行。研究發(fā)現(xiàn)，棲瘤胃普雷沃氏菌、瘤胃高效產(chǎn)氨菌及其他蛋白質(zhì)分解菌在蛋白質(zhì)到氨氮的降解過(guò)程中起到了重要作用。

2.3.1 棲瘤胃普雷沃氏菌 棲瘤胃普雷沃氏菌（Prevotella sp），不僅數(shù)量大，參與了蛋白質(zhì)降解級(jí)聯(lián)過(guò)程中的每一步，而且其還是唯一被發(fā)現(xiàn)具有二肽酶活性的瘤胃微生物。二肽酰肽酶活性是寡肽在瘤胃液中被降解的重要原因，擁有二肽酰肽酶活性的微生物并不多 （Morrison和Mackie，1996；Wallace等，1985）。常見(jiàn)的細(xì)菌寡肽酶是氨酰肽酶，其作用是從N端依次切下一個(gè)氨基酸，而二肽酰肽酶活性常見(jiàn)于哺乳動(dòng)物中，從N端依次切下一個(gè)二肽。瘤胃內(nèi)二肽酰肽酶活性使得瘤胃液中形成較多的二肽或三肽，然后進(jìn)一步被二肽酶或三肽酶分解成游離氨基酸 （Wallace等，1996）。根據(jù)16S rDNA序列分析，可將棲瘤胃普雷沃氏菌分為4類(lèi)，這4類(lèi)都能產(chǎn)生二肽基肽酶，其中一類(lèi)P.albensis，能產(chǎn)生至少4種不同的酶類(lèi)，且均為絲氨酸蛋白酶，這些酶對(duì)抑制劑的特異性和敏感度不盡相同（Avgustin等，1994）。研究表明，對(duì)體外瘤胃發(fā)酵系統(tǒng)添加可抑制棲瘤胃普雷沃氏菌二肽酰肽酶活性的物質(zhì)可降低瘤胃肽的降解，從而降低氨氮產(chǎn)量。

2.3.2 瘤胃高效產(chǎn)氨菌 氨氮主要由瘤胃細(xì)菌的脫氨基作用產(chǎn)生，瘤胃中大部分的細(xì)菌具有脫氨作用。瘤胃內(nèi)的脫氨基作用是由兩種不同的細(xì)菌主導(dǎo)的，其中一類(lèi)數(shù)量巨大，包括瘤胃內(nèi)的一些主要菌群，但每種細(xì)菌的脫氨基活性并不高；第二類(lèi)種群數(shù)量較少，但每種細(xì)菌均具有很高的脫氨基活性和特異性，統(tǒng)稱(chēng)為高效產(chǎn)氨菌（HAB）（Russell等，1991）。它們的生長(zhǎng)依賴(lài)于氨基酸作為碳源和氮源，該種群數(shù)量的減少將引起氨氮的降低，它們一個(gè)共有的特征是對(duì)莫能菌素敏感，因而莫能菌素添加可顯著降低瘤胃氨氮產(chǎn)量 （Attwood等，1998）。此外，該類(lèi)菌的活性對(duì)低pH值比較敏感，最近研究表明，來(lái)自飼喂高精料奶牛的混合瘤胃細(xì)菌產(chǎn)生氨氮的速度比飼喂高粗日糧的奶牛瘤胃細(xì)菌低50%，其原因可能是飼喂高精日糧的奶牛pH值低于高粗日糧。由于HAB需要依賴(lài)于水解蛋白和大的多肽片段來(lái)獲得生長(zhǎng)所需的小肽和氨基酸，因此，HAB有可能同蛋白降解菌緊密聯(lián)合在一起以獲取所需底物（Attwood等，1998）。雖然瘤胃HAB有共同特征，但很難從分類(lèi)學(xué)給予界定，研究表明，HAB有多種代謝類(lèi)型，并且基因型也有較大差異，其中某些屬于不發(fā)酵糖的類(lèi)型、某些是發(fā)酵糖或?qū)Ｐ岳玫鞍椎木N（Eschenlauer等，2002）。因此，由于HAB的多樣性，目前關(guān)于瘤胃HAB的研究還相對(duì)較少。

2.3.3 其他蛋白質(zhì)分解菌 瘤胃內(nèi)其他蛋白質(zhì)分解菌包括溶纖維丁酸弧菌 （Butyrivibri fibrisolvens）、 嗜淀粉瘤 胃桿菌 （Ruminobacter amy-lophilus）以及芽孢梭桿菌屬（Clostridium sp.）、反芻動(dòng)物真桿菌（Eubacterium ruminantium）、梭桿菌屬（Fusobacterium sp.）、反芻動(dòng)物新月單胞菌（Selenomonas ruminantium）和牛鏈球菌（Streptococcus boris） 的某些菌株 （馮仰廉，2004；Wallace 等1988）。各種細(xì)菌在蛋白質(zhì)降解的過(guò)程是協(xié)同和互補(bǔ)的關(guān)系，從而可有效降解飼料蛋白質(zhì)。例如，牛鏈球菌含有較高亮氨酸氨基肽酶活性，對(duì)于反芻動(dòng)物新月單胞菌較低的內(nèi)肽酶活性是一個(gè)互補(bǔ)。嗜淀粉瘤胃桿菌（R.amylophilus）、溶纖維丁酸弧菌（B.fibrisolvens）是目前研究較多的兩種蛋白質(zhì)降解菌。嗜淀粉瘤胃桿菌是已知的蛋白質(zhì)降解活性最高的菌株之一，同時(shí)它具有很強(qiáng)淀粉分解能力，所以在淀粉日糧的蛋白質(zhì)分解中起到了重要作用。溶纖維丁酸弧菌是從動(dòng)物中分離的最主要的蛋白質(zhì)分解菌，兼有纖維降解功能，當(dāng)日糧中存在許多不易被降解類(lèi)型的蛋白質(zhì)時(shí)，該菌會(huì)大量繁殖。目前，瘤胃內(nèi)嗜淀粉瘤胃桿菌和溶纖維丁酸弧菌的熒光定量PCR定量檢測(cè)方法已經(jīng)建立，這兩種細(xì)菌常作為評(píng)價(jià)不同日糧（精料和粗料）條件下，瘤胃內(nèi)蛋白質(zhì)降解菌變化情況的代表菌株（徐愛(ài)秋等，2010）。

3 瘤胃內(nèi)氨氮生成的微生物調(diào)控手段

影響瘤胃內(nèi)蛋白質(zhì)降解率的因素有很多，日糧組成是決定性因素，但日糧蛋白質(zhì)的降解則是通過(guò)瘤胃微生物來(lái)完成（Bach等，2005）。因此，調(diào)控瘤胃微生態(tài)區(qū)系是最終達(dá)到瘤胃蛋白質(zhì)降解有效調(diào)控的手段。

3.1 離子載體及其他添加劑對(duì)瘤胃產(chǎn)氨菌的抑制 莫能菌素、拉沙里菌素、泰樂(lè)菌素、海南霉素、維及尼霉素等離子載體可抑制瘤胃氨氮的生成（沈贊明，2004；Wallace 等，1992）。 莫能菌素可降低高效產(chǎn)氨菌產(chǎn)氨氮的作用。但有的產(chǎn)氨菌可通過(guò)在細(xì)胞外形成一層包膜來(lái)產(chǎn)生對(duì)莫能菌素的耐受性（Callaway 等，1999）。Flythe 等（2009）對(duì)波爾山羊瘤胃內(nèi)產(chǎn)氨菌的培養(yǎng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，P.indolicus相似性菌種對(duì)莫能菌素的抵抗能力較強(qiáng)。因此，雖然莫能菌素可作為抑制瘤胃產(chǎn)氨菌的手段之一，但應(yīng)與其他手段結(jié)合且不宜長(zhǎng)期使用。隨著綠色養(yǎng)殖觀念的深入，莫能菌素等抗生素的應(yīng)用已經(jīng)受到較大限制，而植物揮發(fā)油作為一種天然抗菌成分，近年來(lái)在瘤胃發(fā)酵調(diào)控領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注（林波和陸燕，2009）。研究表明，揮發(fā)油具有抑制瘤胃高效產(chǎn)氨菌，降低瘤胃氨氮濃度的作用（林波等，2010；Benchaar 等，2008；McIntosh 等，2003）。Calsamiglia等（2007）認(rèn)為，揮發(fā)油在瘤胃內(nèi)主要抑制高效產(chǎn)氨菌和原蟲(chóng)，而這兩種微生物均是瘤胃氨氮產(chǎn)生的主要微生物，因此，揮發(fā)油降低氨氮的作用機(jī)制與離子載體類(lèi)抗生素具有相似性。但揮發(fā)油種類(lèi)繁多、結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制各異，濃度是決定其作用效果的關(guān)鍵因素，高濃度揮發(fā)油會(huì)抑制瘤胃真菌等纖維降解微生物，從而導(dǎo)致瘤胃發(fā)酵的 全 面 抑 制 （Alexander 等 ，2008；Busquet 等 ，2006）。皂甙作為一種瘤胃發(fā)酵調(diào)控劑，也可抑制瘤胃氨氮產(chǎn)生。研究表明，在體外添加茶皂素可降低原蟲(chóng)數(shù)量，降低氨氮產(chǎn)量，且對(duì)瘤胃揮發(fā)性脂肪酸無(wú)明顯抑制（Guo 等，2008；Hu 等，2005），而體內(nèi)試驗(yàn)也表明，茶皂素抑制了瘤胃蛋白質(zhì)的降解（Mao 等，2010；Yuan 等，2007）。 酵母培養(yǎng)物是一種有效的瘤胃發(fā)酵調(diào)控劑，可促進(jìn)微生物生長(zhǎng)。大量研究表明，酵母培養(yǎng)物可顯著降低瘤胃內(nèi)NH3-N 濃度（Kumar等，1994；Williams等，1990），但也有研究表明，酵母或酵母培養(yǎng)物添加對(duì)瘤胃蛋白質(zhì)降解沒(méi)有影響（Jouany等，1998）。與揮發(fā)油和皂甙類(lèi)物質(zhì)相比，酵母培養(yǎng)物降低瘤胃氨氮的機(jī)制在于促進(jìn)微生物的瘤胃氨氮利用。

3.2 瘤胃細(xì)菌分泌的細(xì)菌素 細(xì)菌素是由細(xì)菌基因組編碼，在核糖體內(nèi)合成后分泌的一種蛋白質(zhì)或多肽內(nèi)抑菌物質(zhì)，其特點(diǎn)是對(duì)親緣關(guān)系較近的細(xì)菌有抗菌作用，產(chǎn)生菌對(duì)細(xì)菌素有自身免疫性，但某些細(xì)菌素的抗菌范圍不局限于同源的細(xì)菌。細(xì)菌素選擇抑制性較強(qiáng)，而敏感菌不產(chǎn)生耐藥性（Cleveland等，2001），在維持動(dòng)物消化道微生態(tài)平衡中發(fā)揮了重要作用。瘤胃細(xì)菌素在瘤胃內(nèi)廣泛存在，并已證明其是維持瘤胃微生態(tài)平衡的重要調(diào)控因子。通過(guò)直接或間接使用瘤胃細(xì)菌素調(diào)節(jié)瘤胃微生物區(qū)系的平衡和替代抗生素調(diào)控瘤胃發(fā)酵是一個(gè)具有潛力的研究領(lǐng)域。相比揮發(fā)油，莫能菌素等瘤胃發(fā)酵調(diào)控劑會(huì)顯著抑制真菌和原蟲(chóng)等纖維降解微生物，細(xì)菌素只針對(duì)細(xì)菌，對(duì)真菌和原蟲(chóng)等其他瘤胃菌群無(wú)影響。此外，細(xì)菌素極強(qiáng)的選擇抑制性為特異性抑制瘤胃產(chǎn)氨菌提供了前提保證。Callaway等（1999）報(bào)道，幾種嚴(yán)格發(fā)酵氨基酸的細(xì)菌可被nisin抑制，Rychlik和 Russell（2002）也報(bào)道，將發(fā)酵碳水化合物的細(xì)菌和以氨基酸為底物的細(xì)菌在瘤胃液中共培養(yǎng)時(shí)，碳水化合物發(fā)酵細(xì)菌分泌的細(xì)菌素會(huì)抑制產(chǎn)氨菌的活性。其他一些研究表明，飼喂高精料日糧的牛瘤胃內(nèi)產(chǎn)氨菌活性低于高粗日糧的牛，原因可能是飼喂高精日糧的牛瘤胃中溶纖維丁酸弧菌（B.fibrisolvens）可產(chǎn)生一種細(xì)菌素，從而顯著抑制了瘤胃高效產(chǎn)氨菌的發(fā)酵，體外試驗(yàn)表明，細(xì)菌素和乳酸鏈球菌素可降低瘤胃甲烷和氨氮產(chǎn)量（Mantovani和Russell，2002）。由于細(xì)菌素作為瘤胃微生態(tài)調(diào)控劑的諸多優(yōu)勢(shì)，采用分子生物技術(shù)克隆表達(dá)特異性抑制普雷沃氏菌等產(chǎn)氨微生物的細(xì)菌素，或應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)開(kāi)發(fā)表達(dá)特異性細(xì)菌素的基因工程菌，將是較有前景的研究領(lǐng)域。

3.3 化學(xué)修飾的多肽或蛋白質(zhì)添加劑 離子載體類(lèi)抗生素或植物揮發(fā)油可降低瘤胃氨氮的產(chǎn)量，但其抗菌活性范圍較廣，在瘤胃內(nèi)可能會(huì)抑制某些纖維降解微生物，從而產(chǎn)生不利影響。另一種可特異性調(diào)節(jié)瘤胃蛋白質(zhì)降解的方法是利用產(chǎn)氨微生物一般以多肽為底物的代謝特異性，在多肽引入具有微生物抑制性的化合物，從而選擇性抑制瘤胃蛋白質(zhì)降解微生物。Floret等（1999）報(bào)道，在羊日糧中添加一種氨基酸類(lèi)似物，顯著降低了瘤胃高效產(chǎn)氨菌的活性，體外試驗(yàn)也表明，其可降低以Trypticase和酪氨酸水解產(chǎn)物為底物發(fā)酵液氨氮產(chǎn)量，說(shuō)明該物質(zhì)具有選擇性抑制瘤胃高效產(chǎn)氨菌的活性。此外，采用幾種含多聚陽(yáng)離子的合成鮭精蛋白多肽對(duì)普雷沃氏菌的純培養(yǎng)進(jìn)行研究，結(jié)果表明，在鮭精蛋白多肽最小抑菌濃度下，該菌對(duì)細(xì)菌素novobiocin的敏感性增加4倍，對(duì)莫能菌素的敏感性增加10倍。由于兩種細(xì)菌抑制劑的作用機(jī)制完全不同，因此推測(cè)鮭精蛋白的作用可能在于使得該菌的膜對(duì)疏水性抗生素的親和性增加，從而增強(qiáng)細(xì)菌對(duì)抗生素的敏感性?？紤]到一些谷物含有多聚陽(yáng)離子蛋白質(zhì)，因此瘤胃谷物蛋白消化率的變化可能是由于各種谷物中多聚陽(yáng)離子蛋白的多寡對(duì)瘤胃產(chǎn)氨菌的抑制不同有關(guān) （Madeira和Morrison，1997）。關(guān)于含微生物抑制物質(zhì)的化學(xué)修飾性多肽和蛋白質(zhì)對(duì)瘤胃蛋白分解菌的抑制研究還較少，但其是一個(gè)較有發(fā)展前景的瘤胃蛋白質(zhì)降解調(diào)控手段，有待進(jìn)一步研究。

4 小結(jié)

蛋白質(zhì)的瘤胃消化是反芻動(dòng)物獨(dú)特的消化特點(diǎn)之一，其在反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)中占據(jù)了重要位置。微生物是瘤胃蛋白質(zhì)消化的主體，同時(shí)也是動(dòng)物可代謝蛋白質(zhì)的重要來(lái)源，因此，研究瘤胃內(nèi)微生物對(duì)飼料蛋白質(zhì)的降解和利用機(jī)制是調(diào)控反芻動(dòng)物氮代謝的基礎(chǔ)。由于瘤胃內(nèi)參與飼料蛋白質(zhì)降解和利用的微生物復(fù)雜多樣，因此實(shí)現(xiàn)瘤胃蛋白質(zhì)代謝調(diào)控的前提是闡明各種蛋白質(zhì)降解微生物的種類(lèi)和特點(diǎn)。近年來(lái)，隨著基因組學(xué)、純培養(yǎng)技術(shù)、微生物分子生物的研究進(jìn)展，瘤胃微生物對(duì)纖維、淀粉等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化機(jī)理逐漸被揭示，可以預(yù)見(jiàn)，微生物對(duì)飼料蛋白質(zhì)的降解和氨氮產(chǎn)生的機(jī)制將是今后研究的熱點(diǎn)。

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