豬瘟病毒及疫苗應(yīng)用研究概況

衣翠玲

1.豬瘟流行特點

從20世紀(jì)70年代末開始，各養(yǎng)豬國家豬瘟流行的特點以溫和型豬瘟為主，為周期性，波浪型的地區(qū)散發(fā)流行。其特點是無名高熱，癥狀不典型，持續(xù)性感染。在我國豬瘟流行呈典型和非典型豬瘟共存；持續(xù)感染與隱性感染共存。本病呈世界性流行，為高度接觸性傳染病。

程喜萊報道，2001年1～3月湖北某種豬場免疫豬群暴發(fā)了一種以高熱，高死亡率為特征的傳染病，經(jīng)檢查確診為豬瘟。郭麥芳報道，2008年初陜西某區(qū)養(yǎng)豬場免疫注射過的200余頭后備豬發(fā)病，經(jīng)實驗室檢查確診為豬瘟和附紅細(xì)胞體混合感染。一些發(fā)達(dá)國家采取嚴(yán)格衛(wèi)生防疫措施和凈化豬群來控制和消滅了豬瘟。如美國，加拿大，澳大利亞，日本，巴西等。造成豬瘟流行原因還有：①疫苗的質(zhì)量存在問題，免疫后，抗體水平不能防止亞臨床感染水平，可使強(qiáng)毒在豬體內(nèi)復(fù)制和散毒；②聯(lián)苗效果不確實，據(jù)有關(guān)資料報道應(yīng)用三聯(lián)苗免疫的豬群不斷出現(xiàn)免疫失敗的病例，使養(yǎng)豬業(yè)造成較大的損失。

2.病原

豬瘟病毒（CSFV）是黃病毒科(Flaviviridae)瘟病毒屬(pcstivirus)中的一個成員，屬于有囊膜的RNA病毒，基因組為單股正鏈，相對分子質(zhì)量約為12300，含有一個大的開放性閱讀框(openreading frame，ORF)，其兩側(cè)分別為5’-非翻譯區(qū)(5’-UTR)和3’-非翻譯區(qū)(3’-URT)CSFV的所有結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白均由ORF所編碼，翻譯成1～3898個氨基酸的多聚前體蛋白，其結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白在病毒RNA上的編碼順序為5’-Nprv、C、E0、E1、E2、P7、Ns2、Ns3、Ns4A、Ns4B、Ns5-3’。其中C為核衣殼蛋白，E0、E1、E2為結(jié)構(gòu)糖蛋白，其余均為非結(jié)構(gòu)蛋白。在結(jié)構(gòu)蛋白中最具有免疫防制研究價值的是E0和E2。E0由227個氨基酸殘基構(gòu)成，相對分子質(zhì)量為44000～48000，可誘導(dǎo)產(chǎn)生中和譜很窄的中和抗體。E0不僅是一種結(jié)構(gòu)蛋白，而且也是一種功能蛋白，它與CSFV對宿主細(xì)胞的嗜性以及致病力有密切關(guān)系，可降解病毒和細(xì)胞的RNA，可導(dǎo)致免疫抑制，引起動物和淋巴細(xì)胞凋亡。E2的相對分子質(zhì)量約為了53000～55000，E2參與病毒對細(xì)胞的感染過程，攜帶有能刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫的抗原決定簇，其編碼的gp55蛋白是豬瘟的主要保護(hù)性抗原。E2囊膜蛋白共包含371個氨基酸殘基，是主要的抗原表位集中區(qū)。A／D區(qū)中69011～766aa區(qū)域是一段高抗原性的表位集中區(qū)。劉珂等以E2基因陽性質(zhì)粒為模板。PCR擴(kuò)增出E2囊膜糖蛋白上A／D抗原區(qū)B細(xì)胞表位8788aa～938aa，構(gòu)建出表達(dá)質(zhì)粒PEFAD，轉(zhuǎn)化到BL21大腸埃希菌原核表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。豬瘟病毒的分離一般采取病死豬的脾或淋巴結(jié)等含毒量高的組織，研磨過濾，將濾液接種于原代細(xì)胞或細(xì)胞系進(jìn)行病毒分離。CSFV能在豬腎細(xì)胞和其他一些哺乳動物細(xì)胞內(nèi)增殖。

3.豬瘟診斷方法

3.1 病毒分離

豬瘟病毒的分離一般采取病死豬的脾或淋巴結(jié)等含毒量高的組織，研磨過濾，將濾液接種于原代細(xì)胞或細(xì)胞系進(jìn)行病毒分離。CSFV能在豬腎細(xì)胞和其他一些哺乳動物細(xì)胞內(nèi)增殖。

此法具有準(zhǔn)確診斷的優(yōu)點，但不利于對病毒核酸序列的分析。

3.2 熒光抗體試驗

Robertson等首次將熒光抗體(Fluorescentantibody，F(xiàn)A)運(yùn)用于豬瘟病料和組織培養(yǎng)物的檢測，利用高效價的特異性免疫血清，提取IgG，進(jìn)行熒光標(biāo)記。FA法簡單、快捷、可靠。許多國家將它作為豬瘟消滅計劃的法定診斷試驗。

3.3 血清中和試驗

該實驗可檢出動物體內(nèi)的抗體。按不同稀釋度血清抑制病毒產(chǎn)生細(xì)胞病變的瓶數(shù)，計算被檢血清的中和效價。

3.4 間接血凝實驗

用該方法檢測豬瘟抗體消長動態(tài)。此方法操作簡單，無需特殊儀器設(shè)備，特異性強(qiáng)而不與其他傳染病陽性血清發(fā)生交叉凝聚，快速(2h內(nèi)可判定結(jié)果)和重復(fù)性好等特點。

3.5 免疫酶測定技術(shù)

saunder等報道應(yīng)用快速酶標(biāo)記抗體微量技術(shù)檢測豬瘟抗體的方法。通過對640份血清進(jìn)行檢測表明，酶標(biāo)記抗體法和血清中和試驗的符合率在99%以上，而且僅需2h就可獲得試驗結(jié)果。

3.6 斑點ELISA

此方法簡便、快捷。谷均相等利用此法對丹東種豬場2718頭豬進(jìn)行了檢測，并根據(jù)抗體效價情況對其豬進(jìn)行了免疫接種。

3.7 RT-PCR

是以病毒RNA為模版進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后，再以PCR進(jìn)行核酸擴(kuò)增來檢測CSFV的方法。具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、檢測時間短等特點，適合臨床應(yīng)用。

3.8 鑒別PCR

此方法簡化了檢測步驟，縮短了檢測時間，提高了病毒的檢出率，可用于疾病的診斷和流行病學(xué)調(diào)查。

4.豬瘟疫苗的應(yīng)用

20世紀(jì)40年代人們開始了對豬瘟病毒進(jìn)行兔體適應(yīng)的試驗研究。1903年DeSchweinitz和Dorset首次證明CSFV是一種濾過性病毒。人們采用各種免疫方法預(yù)防和控制豬瘟。其中應(yīng)用最廣泛的有中國的兔化弱毒疫苗株，又稱中國株或C株。日本的細(xì)胞弱毒疫苗株GPE及法國的Thivervat株。它們在豬瘟的控制中都發(fā)揮了重要作用。大多數(shù)弱毒活疫苗是在C株的基礎(chǔ)上開發(fā)形成的。孫偉等對不同日齡的豬用不同劑量豬瘟兔化弱毒疫苗進(jìn)行免疫，通過正向間接血凝試驗進(jìn)行豬抗體監(jiān)測。結(jié)果表明：仔豬在吃乳前和60日齡進(jìn)行免疫效果較好，其抗體使仔豬在整個飼養(yǎng)期內(nèi)可以得到保護(hù)。所以豬瘟疫苗的三大品系疫苗(中國的C株，日本的CPE株和法國的Thiverval株)的廣泛應(yīng)用，對于控制豬瘟的流行起到了關(guān)鍵作用。

隨著分子病毒學(xué)技術(shù)的不斷提高，豬瘟疫苗的研究也取得了新的進(jìn)展。如對豬瘟病理基因組織結(jié)構(gòu)和功能，尤其是主要抗原基因結(jié)構(gòu)和功能的研究不斷深入，為豬瘟疫苗，尤其是各種標(biāo)記疫苗的研究提供了理論依據(jù)。因此，各種CSFV基因高效表達(dá)系統(tǒng)的建立和完善，為標(biāo)記疫苗的開發(fā)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

4.1 豬瘟亞單位標(biāo)記疫苗的研究應(yīng)用

所謂亞單位疫苗(subunitvaccine)是指它含有病原體的一種或幾種抗原，而不含有病原體的其它遺傳信息。亞單位疫苗是不含有感染性組分的，因而無需滅活，而且也無致病性。豬瘟亞單位疫苗主要是殿囊膜糖蛋白的單位標(biāo)記疫苗，但這種疫苗免疫原性差。產(chǎn)生保護(hù)性抗體的時間較長，不適用于緊急接種。Dwulf等研究了E2亞單位標(biāo)記疫苗。在對試驗條件下，疫苗對豬群進(jìn)行了2次免疫能提供臨床保護(hù)，但不能阻止CSFV間接觸感染，而且免疫以后需2周才能達(dá)到完全保護(hù)，證明不適用于緊急接種。一種成功的疫苗必須對受體有良好的免疫保護(hù)作用。首先要明確編碼具有免疫活性的特定抗原的基因。

4.1.1 表達(dá)系統(tǒng)

應(yīng)用重組DNA技術(shù)研制亞單位疫苗。表達(dá)系統(tǒng)主要有原核生物，酵母細(xì)胞和桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)等。

4.1.2 豬瘟E2亞單位疫苗

CSFV分子抗原性研究的主要成果之一就是確定了E0、E2在誘導(dǎo)抗豬瘟保護(hù)性免疫中的重要地位。Wensvoort等用13株CSFV單抗系統(tǒng)研究了CSFVBrescin株表面的抗原決定簇，提出了CSFV表面抗原結(jié)構(gòu)域空間分布和功能關(guān)系的一個抽象模型，其研究表明，CSFV表面的單抗決定簇主要分布在四個抗原結(jié)構(gòu)域即ABCD內(nèi)。13株單抗檢測93株CSFV的結(jié)果表明，不同的CSFV分離株分型的結(jié)果不能預(yù)測分離毒株的毒力，他認(rèn)為CSFV的這4個抗原域位于CSFV的同一結(jié)構(gòu)蛋白上。WeUand等用體外試驗結(jié)果說明這個結(jié)構(gòu)蛋白就是CSFV的e2糖蛋白。Hammond等還報道了有關(guān)CSFVE2重組豬腺病毒(rpAVgP55)活載體疫苗的DNA質(zhì)粒(核酸疫苗)聯(lián)合免疫的研究，可100%保護(hù)斷奶仔豬，75%保護(hù)斷奶前仔豬。Yu等、Hummand等和Andrew等分別構(gòu)建了CSFVE2基因的重組表達(dá)質(zhì)粒，并且證明它對豬有較好保護(hù)作用。2000年desmit等利用中國C-株的基因組DNA拷貝構(gòu)建了2個重組CSFV(F1C2、T1C3)，試驗表明，重組病毒在兔和豬中保留了父代C-株的生物學(xué)特性和免疫原性。C株全長CDNA可作為基質(zhì)以開發(fā)活的重組CSFV株標(biāo)記疫苗。它是建立快速，準(zhǔn)確的CSFV診斷試劑盒的基礎(chǔ)。

4.1.3 豬瘟核酸疫苗

用豬瘟病毒E2蛋白基因的表達(dá)載體直接作為免疫動物的DNA疫苗是近年來豬瘟病毒免疫研究的熱點領(lǐng)域，DNA疫苗可以誘導(dǎo)體液免疫，又可誘導(dǎo)細(xì)胞免疫。

4.2 免疫預(yù)防

在免疫監(jiān)測的基礎(chǔ)上，確定免疫時間，免疫次數(shù)，劑量，制定出一個既能抵抗豬瘟臨床感染又能防止亞臨床感染和阻止強(qiáng)毒在體內(nèi)復(fù)制和散毒的一種有效措施，是控制本病傳染的關(guān)鍵。

總之，隨著獸醫(yī)學(xué)、免疫學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，豬瘟的防制措施和診斷方法更精確，為豬瘟最終控制和消滅奠定—定的基礎(chǔ)。