Dex疫苗的研究現(xiàn)狀及其在自身免疫性疾病的應(yīng)用①

尹煒凡 綜述 楊 歡 審校 (中南大學(xué)湘雅醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,長沙 410011)

外泌體是由活細胞分泌的直徑為60～90 nm的囊狀小體,在電鏡下為脂質(zhì)雙層膜包圍的扁平球體,呈特征性的杯狀外型,存在于血清、尿液、唾液、乳汁等體液中[1]。作為一種亞細胞結(jié)構(gòu),它能代表其來源細胞行使一系列生物學(xué)功能,如腫瘤細胞來源的外泌體能介導(dǎo)免疫逃逸,腸上皮細胞來源的外泌體參與了口服耐受作用的發(fā)揮,胎盤絨毛膜上皮細胞來源的外泌體能介導(dǎo)母胎耐受等等。近年來,樹突狀細胞(DC)來源的外泌體(Dex)引起了人們廣泛的關(guān)注,因其即能誘導(dǎo)機體抗腫瘤,抗弓形蟲等病原體的強烈的適應(yīng)性免疫應(yīng)答,又能在一定條件下誘導(dǎo)抗原特異性的免疫耐受,在介導(dǎo)抗腫瘤免疫、移植免疫耐受方面顯示了巨大的應(yīng)用前景。近年來其在自身免疫性疾病治療中的應(yīng)用也逐漸引起關(guān)注,本文就Dex疫苗的研究現(xiàn)狀以及Dex在自身免疫性疾病的臨床應(yīng)用作一簡要綜述。

1 Dex疫苗的研究現(xiàn)狀

1.1 Dex疫苗的體內(nèi)作用機制 應(yīng)用熒光示蹤,可以發(fā)現(xiàn)Dex在體內(nèi)的遷移途徑。將髓源Dex真皮內(nèi)或皮下注射入小鼠體內(nèi),在注射部位Dex即能被位于皮膚的未成熟DC捕獲,其表面表達的分子被未成熟DC吸收,24小時后DC和Dex復(fù)合物則遷移至相應(yīng)的引流淋巴結(jié)區(qū),引起相應(yīng)的免疫應(yīng)答或者誘導(dǎo)抗原特異性的免疫耐受[2]。

目前Dex在體內(nèi)具體的作用機制尚不清楚,研究發(fā)現(xiàn),Dex疫苗在體內(nèi)產(chǎn)生的免疫效應(yīng)與Dex表面分子和機體的內(nèi)環(huán)境有關(guān)。成熟樹突狀細胞來源外泌體(mature dendritic cell derived exosome,mDex)表面高表達MHC Ⅱ 、CD40、CD80、CD86共刺激分子,在相應(yīng)的淋巴結(jié)引流區(qū),mDex能與DC和T細胞相互作用,使初始T細胞活化為抗原特異性T細胞,誘導(dǎo)強烈的適應(yīng)性免疫應(yīng)答。而非成熟樹突狀細胞來源的外泌體(immature dendritic cell derived exosome,imDex)表面低表達 MHC Ⅱ、CD40、CD80、CD86 共刺激分子,在與引流區(qū)淋巴結(jié)T細胞相互作用時不能活化T細胞,導(dǎo)致T細胞無能或低能反應(yīng),從而誘導(dǎo)免疫耐受。在小鼠心臟移植的實驗中發(fā)現(xiàn),預(yù)先用imDex處理受者,移植手術(shù)后受者體內(nèi)CD4+細胞顯著減少,且移植物中浸潤的白細胞減少,IFN-gama mRNA的表達明顯下降[3]。應(yīng)用基因工程技術(shù)使樹突狀細胞表面表達FasL、IL-4、IL-10等分子來源的外泌體(即 Dex-FasL、Dex-IL-4、Dex-IL-10)能啟動 T 細胞內(nèi)的免疫抑制信號,誘導(dǎo)T細胞凋亡,產(chǎn)生免疫耐受效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn),Dex-IL-4、Dex-IL-10和 Dex-FasL表面表達較高濃度的FasL,它們利用Fas/FasL途徑誘導(dǎo)T細胞凋亡,產(chǎn)生免疫耐受效應(yīng)[2,4,5]。機體的內(nèi)環(huán)境主要指的是DC的成熟狀態(tài),研究發(fā)現(xiàn)DC的成熟狀態(tài)對于Dex疫苗效應(yīng)的發(fā)揮起重要作用。在無DC或未成熟DC存在的條件下,mDex或imDex均不能有效激活T細胞,而應(yīng)用促DC成熟因子(LPS、TNF-α、CpG、CD40L)后,mDex或 imDex在體內(nèi)能不同程度的激活T細胞[6]。

1.2 Dex疫苗的應(yīng)用途徑 研究證明,通過真皮內(nèi)注射的Dex能刺激引流淋巴結(jié)區(qū)3.8%的淋巴細胞增殖,而皮下注射的Dex僅能引起 0.9%的淋巴細胞增殖,表明通過真皮內(nèi)注射的 Dex能夠影響的淋巴細胞數(shù)是皮下注射的4倍[7]。因此,我們不難推斷,要想在免疫增強或者免疫耐受中取得較大效果,應(yīng)該采用真皮內(nèi)注射,而非皮下注射的方式。然而,上述兩種途徑與靜脈注射的途徑相比,哪種更能影響淋巴細胞尚無報道,有待進一步研究。

1.3 Dex疫苗的特點 mDex疫苗已經(jīng)應(yīng)用于治療黑色素瘤和非小細胞肺癌的1期臨床試驗,顯示了巨大的應(yīng)用前景。與傳統(tǒng)的DC疫苗相比,Dex疫苗安全穩(wěn)定具有以下優(yōu)點:①非細胞性,可以冷凍儲藏,在冰凍狀態(tài)下儲存幾個月,活性不會受影響。②Dex疫苗注入體內(nèi)后其表面分子不會像DC那樣經(jīng)歷表型變化,而且其在體內(nèi)發(fā)揮作用不受CTL細胞的影響[8]。③Dex疫苗的副作用輕微且可耐受。在進展性非小細胞肺癌的臨床試驗中,9名Ⅲ～Ⅳ期非小細胞肺癌患者在實驗前接受了Dex介導(dǎo)的遲發(fā)型超敏反應(yīng)的觀察。研究發(fā)現(xiàn),3名患者48小時后的皮膚測驗結(jié)果顯示陽性。其中,2名患者有5 mm的硬結(jié)和紅斑,1名患者有6 mm的硬結(jié)和紅斑。整個實驗結(jié)束后的副反應(yīng)觀察發(fā)現(xiàn)8名患者有注射部位的紅斑、硬結(jié)和腫脹。1名患者有流感樣癥狀,1名患者有手臂的外周性水腫[9]。④Dex疫苗具有抗原特異性。利用exosome display技術(shù)將可溶性抗原負載至Dex上,可以產(chǎn)生抗原特異性 Dex[10]。該種Dex用于小鼠體內(nèi)能產(chǎn)生特異性的免疫應(yīng)答或免疫抑制效應(yīng)。

1.4 Dex疫苗在抗腫瘤治療的應(yīng)用 鑒于負載腫瘤抗原肽的Dex在體內(nèi)能引發(fā)CD4+或CD8+T細胞介導(dǎo)的抗原特異性的免疫應(yīng)答以及能夠按照GMP標準成功地制備人單核細胞源DC來源的Dex。目前Dex在抗腫瘤方面應(yīng)用的研究廣泛開展。在惡性程度極高的黑色素瘤的治療中,給15例表達MAGE2的黑色素瘤患者每周四次的皮下或者靜脈注射冰凍保存的負載MAGE2抗原肽的Dex,連續(xù)使用四周,劑量逐步增加,對于病情穩(wěn)定者和腫瘤消退者再每3周注射一次,結(jié)果發(fā)現(xiàn)間接負載處理的Dex使1例患者病情得到穩(wěn)定,并接受了后續(xù)的每3周注射1次,共8次的治療,患者病情得到了長期控制。間接負載處理的Dex使1例患者皮下腫瘤消退,但是發(fā)生了肺轉(zhuǎn)移[11]。在Ⅲ、Ⅳ期非小細胞肺癌即進展性非小細胞肺癌的臨床試驗中,入組的病人有9例,在為期兩年的隨訪觀察中2例病人的病情穩(wěn)定時間超過了12個月[9]。上述研究使我們看到了Dex在臨床抗腫瘤治療中的巨大應(yīng)用前景,然而要想讓Dex疫苗發(fā)揮更好的抗腫瘤效果,Dex的結(jié)構(gòu)、體內(nèi)應(yīng)用的方式方法以及最適劑量方面有待進一步研究。

1.5 Dex在移植免疫耐受方面的應(yīng)用 髓源imDex和調(diào)節(jié)樹突狀細胞來源外泌體(regulatory dendritic cell derived exosomes,rDex)均能夠誘導(dǎo)宿主的移植免疫耐受。Pêche等[12,13]先后證實了在小鼠心臟移植手術(shù)中,髓源imDex能調(diào)節(jié)受者的抗移植免疫反應(yīng),并能顯著延長同種異體心臟的存活時間。劉袁媛等[14]在小鼠皮膚移植試驗中觀察到 rDex比 imDex能產(chǎn)生更好的移植免疫耐受效應(yīng)。上述動物實驗預(yù)示著Dex將會是抗移植排斥反應(yīng)的新方法。

2 Dex在自身免疫性疾病治療中的應(yīng)用

目前,Dex在自身免疫性疾病治療方面的應(yīng)用主要是在對風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療的觀察上。風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎為特征的慢性全身性自身免疫性疾病。實驗觀察所應(yīng)用的研究模型為遲發(fā)型超敏反應(yīng)模型。研究發(fā)現(xiàn),imDex以及通過基因工程技術(shù)使髓源DC表面表達IL-4、IL-10、FasL來源的Dex均能產(chǎn)生抑制遲發(fā)型超敏反應(yīng)的作用。盡管其具體作用機制尚不十分明確,但是上述實驗研究能夠為將抑制性Dex用于其它自身免疫性疾病治療的研究奠定了基礎(chǔ)。

過表達吲哚胺2,3-雙加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)和細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原 4融合蛋白(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4 immunoglobulin,CTLA-4Ig)的髓源DC來源的外泌體(IDO/Dex和CTLA-4Ig/Dex),能夠抑制小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)的炎癥進展,阻止類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的病情進展。IDO是近來研究較多的一種免疫調(diào)節(jié)蛋白,能夠維持外周耐受,在妊娠、腫瘤、自身免疫性疾病和移植耐受方面起著重要作用。IDO能降低T細胞中色氨酸的含量,利用產(chǎn)生細胞毒性代謝產(chǎn)物,即犬尿氨酸,影響T細胞的活性。CTLA-4Ig是 IDO的誘導(dǎo)物,通過DC表面B7分子能誘導(dǎo)DC表達IDO。研究發(fā)現(xiàn),IDO/Dex本身并不含有 IDO蛋白,它們能產(chǎn)生免疫耐受的可能機制是傳遞功能性的IDO蛋白給DC或者T細胞[15]。

2.1 體外預(yù)實驗 首先,通過基因工程技術(shù)使表面表達細胞因子IL-10的髓源DC分泌外泌體,即重組IL-10(r-IL-10)處理過的或含IL-10重組腺病毒載體感染(v-IL-10)的骨髓來源的Dex(r-IL-10/Dex和v-IL-10/Dex),在將其應(yīng)用于于小鼠體內(nèi)試驗之前先檢驗了其是否具備抑制T細胞活性的功能。將vIL-10/Dex、未轉(zhuǎn)染 IL-10的普通髓源 Dex和 rIL-10/Dex分別加入混合淋巴細胞液中,5天后觀察其中的T細胞增殖情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),vIL-10/DC能完全抑制T細胞增殖,未轉(zhuǎn)染IL-10的普通髓源DC的抑制作用很少或者基本沒有,而rIL-10/Dex具有中等的抑制效果[4]。該實驗不僅證實了IL-10/Dex的免疫抑制效應(yīng),而且比較了三種Dex的免疫抑制效應(yīng),顯示了通過病毒轉(zhuǎn)染的IL-10/Dex的免疫抑制效應(yīng)更強,為IL-10/Dex及其他抑制性Dex的體內(nèi)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

2.2 體內(nèi)試驗的應(yīng)用 在小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)模型中,分別比較vIL-10/Dex、vIL-10/DC和生理鹽水抑制遲發(fā)型超敏反應(yīng)的能力。分別將vIL-10/Dex、vIL-10/DC和生理鹽水注入小鼠一側(cè)的后足墊真皮內(nèi),對側(cè)注入等劑量的生理鹽水,分別在24、48和72小時后觀察雙側(cè)足的腫脹情況,并用宏觀評分系統(tǒng)進行記錄。結(jié)果顯示和生理鹽水組相比vIL-10/DC組注射足的足墊腫脹情況減輕了大于50%,對側(cè)腫脹情況減輕了40%。vIL-10/Dex組雙側(cè)足墊腫脹情況減輕了65%。在膠原性關(guān)節(jié)炎的模型中,在小鼠被抗原免疫后的第28天,靜脈注射vIL-10/Dex和等劑量的生理鹽水對照,結(jié)果注射vIL-10/Dex組不僅膠原性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生日期推遲了,疾病的嚴重程度亦降低了。而生理鹽水組的膠原性關(guān)節(jié)炎則按往常一樣進展。同樣的,將通過基因工程技術(shù)使表面表達IL-4或FasL的髓源DC來源的Dex,即IL-4/Dex或FasL/Dex,真皮內(nèi)注入小鼠一側(cè)后足墊,亦能減輕小鼠足關(guān)節(jié)的遲發(fā)型超敏反應(yīng),當靜脈注射上述Dex時能夠推遲膠原性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生時間以及減弱其炎癥反應(yīng)的程度。盡管Dex誘導(dǎo)免疫耐受的具體作用機制尚不明確,但是Kim[2]對 Dex進行熒光標記示蹤發(fā)現(xiàn),在注入真皮內(nèi)的48小時后,在真皮中能檢測到Dex和CD11c+細胞的復(fù)合物,在同側(cè)窩的淋巴結(jié)引流區(qū)該復(fù)合物亦被檢測到,而在對側(cè)淋巴結(jié)引流區(qū)、肝臟和脾臟中則未被發(fā)現(xiàn)。這似乎不能解釋對側(cè)關(guān)節(jié)的免疫抑制現(xiàn)象。對于靜脈注射的Dex而言,24小時后檢測到Dex在肝臟中被F4/80-(大部分為CD11c+)細胞所捕獲,在脾臟中則被F4/80+脾巨噬細胞所捕獲。將用IL-4/Dex致耐受的小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)模型中的CD11c+分離出來,在將其注入同基因系的被抗原致敏的小鼠體內(nèi),亦能減輕遲發(fā)型超敏反應(yīng)的炎癥程度。這不禁使我們聯(lián)想到,Dex在真皮內(nèi)注入后,和同側(cè)淋巴結(jié)區(qū)的CD11c+細胞作用將自身所攜帶的致免疫耐受分子傳遞給CD11c+,由CD11C+行使抑制抗原特異性免疫耐受的作用。而靜脈注射的Dex則循環(huán)至肝脾區(qū),被F4/80+脾巨噬細胞和肝臟 F4/80-細胞捕獲,傳遞免疫抑制性分子后,由F4/80+脾巨噬細胞和肝臟F4/80-細胞行使免疫抑制功能。進一步的致免疫耐受機制尚不清楚,有待于進一步研究。

2.3 Dex免疫抑制效應(yīng)發(fā)揮的幾個關(guān)鍵問題 要想發(fā)揮Dex的免疫抑制功能,并將其成功地應(yīng)用于自身免疫性疾病的動物模型和臨床試驗,有幾個關(guān)鍵的問題不容忽視。

2.3.1 外泌體的完整性 外泌體膜是否完整對于其免疫抑制效應(yīng)的發(fā)揮起著至關(guān)重要的作用。Kim等[2]發(fā)現(xiàn)在小鼠的遲發(fā)型超敏反應(yīng)模型中,經(jīng)過四輪的冰凍-解凍處理后的髓源Dex/vIL-10或Dex/rIL-10不再具備抑制關(guān)節(jié)炎炎癥反應(yīng)的作用,電鏡觀察到經(jīng)過四輪的冰凍-解凍后,Dex表面雙層膜不再完整,并且在Dex碎片中Hsc70已經(jīng)檢測不到了,而已知的Hsc70是體內(nèi)誘導(dǎo)T細胞耐受的重要分子。同樣的,通過聲裂解處理的Dex表面膜裂解,亦不能發(fā)揮其免疫抑制效應(yīng)。

2.3.2 免疫抑制效應(yīng)的發(fā)揮所依耐的分子 Dex免疫抑制效應(yīng)的發(fā)揮與其表面分子相關(guān)。首先,供者Dex必須和受者來源于同一基因型,Dex免疫效應(yīng)的發(fā)揮具有MHC依賴性。其次,給Dex負載一定抗原肽產(chǎn)生的免疫耐受效應(yīng)是針對特定抗原,對其它抗原則不起作用。另外,根據(jù)前述,IL-4/Dex、IL-10/Dex和FasL/Dex能夠產(chǎn)生對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的炎癥抑制作用與其表面表達FasL有關(guān)。在IDO試驗中,IDO/Dex和CTLA-4Ig/Dex作為媒介傳遞功能性的IDO蛋白,其抑制效應(yīng)的發(fā)揮必須有B7分子的參與。

3 問題與展望

Dex在動物實驗和臨床試驗的應(yīng)用研究提示,Dex在抗腫瘤免疫和誘導(dǎo)移植耐受有巨大應(yīng)用前景。然而,對于Dex的具體體內(nèi)作用機制,以及作為亞細胞結(jié)構(gòu)的生物性疫苗,如何使其功能發(fā)揮最大的作用以及如何最大限度降低其副作用仍需要進一步研究。

近年來,Dex在治療自身免疫性疾病的研究陸續(xù)開展,在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型中,我們看到了IL-4/Dex、IL-10/Dex、FasL/Dex、IDO/Dex 和 CTLA-4Ig/Dex對風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎炎癥反應(yīng)的抑制作用,這為我們將抑制性Dex應(yīng)用于自身免疫性疾病奠定了基礎(chǔ)。然而各種Dex的具體作用機制尚未完全明了,需要進一步研究。為將Dex應(yīng)用于臨床,我們必須找到一種免疫抑制效應(yīng)最強的Dex,故我們尚須比較等劑量的上述四種Dex和imDex或者其它抑制性Dex免疫抑制效應(yīng)的程度、起效時間和作用持續(xù)時間等方面有無差異。另外,Dex的免疫效應(yīng)的發(fā)揮與其劑量是否有關(guān)、是呈何種關(guān)系以及如何調(diào)控其劑量以取得最大的免疫抑制效亦尚須進一步研究。

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