豬流行性腹瀉的預(yù)防與控制

任玉鵬，王利娜，顏其貴*，郭萬柱，王小玉，韓國全

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，四川 雅安 625014；2.成都市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗院，四川 成都 610041；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所，四川 雅安 625014）

豬流行性腹瀉是由豬流行性腹瀉病毒（Porine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的豬腸道傳染性病毒病。目前PED 仍然以其與豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬輪狀病毒（PRV）腹瀉的病原特性和臨床癥狀相似度高難于診斷及相互混合感染加大發(fā)病情況的復(fù)雜程度，給疾病防控工作和實驗室研究帶來較大困難。此外，還有報道其能與諸如圓環(huán)病毒之類病毒混合感染[1]，使發(fā)病情況顯得更為復(fù)雜。本文主要從流行病學(xué)、臨床綜合診斷、實驗室診斷、疫苗研究等方面，淺談豬流行性腹瀉預(yù)防與控制。

1 流行病學(xué)

PED 僅發(fā)生于豬，各種年齡的豬只都能感染。本病多發(fā)生于寒冷季節(jié)，受氣溫驟變、天氣寒冷、氣候突變時易發(fā)生，尤其冬季多發(fā)，春、秋也有小規(guī)模流行發(fā)生，夏季亦有零星流行發(fā)病的報道。哺乳仔豬、架子豬、育肥豬的發(fā)病率高達100%，尤以哺乳仔豬的危害最為嚴重。成年母豬發(fā)病率10%～90%，且流行速度快，發(fā)病急。病豬是主要傳染源，病毒存在于其腸絨毛和腸系膜淋巴結(jié)中，隨糞便排出后，污染環(huán)境、飼料、飲水及用具等而感染，在發(fā)病規(guī)律上，其途徑主要經(jīng)消化道。常常是大豬舍首發(fā)，發(fā)病后病豬水樣腹瀉，糞便呈草綠色，有惡臭，隨后誘發(fā)全群腹瀉，繼而波及相鄰豬舍并引起全場或某一地區(qū)相繼感染發(fā)病。乳豬病程較長，危害最大，發(fā)病后處理不當，死亡率可達100%。

我國PED 發(fā)生流行依然普遍，并呈現(xiàn)逐年上升的趨勢。1992 年程慶華等[2]針對青海地區(qū)PED 流行情況的調(diào)查報告顯示，自1987 年到1990 年青海省多個地區(qū)均出現(xiàn)PED 流行，雖然3年間在老疫區(qū)發(fā)病率有所降低，但死亡率卻逐年增加，這也表明在20 世紀90年代，該病就對我國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展造成阻滯；而2004 年杜堅等[3]對廣西6 市6豬場進行采樣調(diào)查，經(jīng)統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)被調(diào)查豬場發(fā)病率多在42%以上，且有豬場還出現(xiàn)陽性帶毒情況；而在邢志強等對內(nèi)蒙古烏盟集寧市周邊地區(qū)豬場的傳染性腹瀉情況調(diào)查報告中顯示引起腹瀉的主要病原仍是PEDV 或TGEV，而在一些應(yīng)用了TGE-PED 二聯(lián)滅活苗豬場，該病得到有效控制；2007 年張世忠等對福建地區(qū)仔豬腹瀉病進行病因調(diào)查發(fā)現(xiàn)，病毒病是仔豬腹瀉的主要病因，而PEDV 在其中占到7.1%；近兩年文獻報告也相繼有該病發(fā)病且引起豬只死亡的報告，筆者在仔豬流行性腹瀉病例中，常檢測到PED 抗原陽性結(jié)果，目前已經(jīng)成為我國豬場腹瀉病中，較為重要的疾病之一。

2 臨床綜合診斷

本病在流行病學(xué)和臨床癥狀方面與豬傳染性胃腸炎（TGE）、輪狀病毒（RV）感染無明顯差異，都是有嘔吐、腹瀉和失水為特征，但流行性腹瀉更具明顯的季節(jié)性（多發(fā)生于寒冷季節(jié)）。臨床上多以混合感染形式出現(xiàn)。因此，在獸醫(yī)臨床綜合診斷方面，難度較大，常常需要排除癥狀比較接近的病原。

本病與輪狀病毒感染的區(qū)別在于：主要發(fā)生在哺乳期的仔豬，7 日齡以下不發(fā)病，多發(fā)生于13 日齡～39 日齡豬；出現(xiàn)下痢，糞色暗黑或黃白色，較腥臭，糞便呈酸性(細菌性腹瀉的糞便一般為堿性)，持續(xù)2～4 d。若無繼發(fā)感染，死亡率不會超過10%。病變主要表現(xiàn)為胃充滿乳凝塊和乳汁，大小腸黏膜呈條狀或彌漫性出血，腸壁黏膜易脫落，腸壁變薄。

本病與豬傳染性胃腸炎的區(qū)別在于：不同年齡的豬只都可暴發(fā)感染本病。臨床上以嘔吐、嚴重腹瀉、少食或不食、脫水、酸堿平衡失調(diào)以及仔豬的死亡率高為特征。哺乳仔豬典型癥狀是突然發(fā)生嘔吐，隨后迅速發(fā)生劇烈腹瀉，呈黃色、淡綠色或灰白色水樣糞便，內(nèi)含未消化的凝乳塊，氣味腥臭并迅速脫水，一般于腹瀉2～5 d 內(nèi)死亡，初生仔豬感染本病死亡率達90%，10 日齡以內(nèi)仔豬的平均死亡率高達50%～100%。

3 實驗室診斷

當前我國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展迅速，然而由于地區(qū)差異等原因，養(yǎng)豬業(yè)水平、規(guī)模參差不齊，疫病發(fā)生流行比較復(fù)雜，非典型癥狀嚴重干擾臨床綜合診斷的準確性。因此，對于PEDV 確診需要更加精確的實驗室診斷，國內(nèi)外針對于豬流行性腹瀉病毒的新型診斷技術(shù)主要包括免疫學(xué)和分子生物學(xué)方法，簡要綜述如下。

3.1 免疫學(xué)診斷

免疫學(xué)診斷技術(shù)即是利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理對病原進行檢測。而針對PEDV 診斷的現(xiàn)存方法，主要有免疫熒光法、病毒中和試驗、ELISA 法等。在早期主要應(yīng)用直接免疫熒光法和病毒中和試驗來對PEDV 進行研究和診斷：如Hofmann 等[4]就利用成熟的免疫熒光技術(shù)，對被PEDV 感染的Vero細胞進行染色觀察，并發(fā)現(xiàn)了其細胞質(zhì)內(nèi)特有的熒光性。我國學(xué)者林志雄等利用野毒自行培育細胞適應(yīng)株作微量中和試驗，并用本方法對5 個豬場進行血清學(xué)調(diào)查。該方法可準確地區(qū)別TGEV和PEDV，有助于指導(dǎo)生產(chǎn)單位采取相應(yīng)的防治措施，也可作為對進出境豬檢疫的診斷方法。而隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，ELISA 試劑盒的開發(fā)和針對于ELISA 技術(shù)的更有效的病毒抗原性基因的研究工作越來越受到重視。

早在1990 年Hofmann 等[5]就利用20%～40%的蔗糖作緩沖液，通過超速離心收集純化PEDV 細胞毒作抗原，研究出一種ELISA 診斷法。后將該方法同間接熒光免疫法對比應(yīng)用于1 024個豬血清樣本檢驗，顯示出ELISA 法高度特異和及其靈敏的優(yōu)勢，該方法成為當時較為便捷有效地針對PEDV的 檢 測 途 徑。1992 年Knuchel 等 嘗試性的對通過S 蛋白和N 蛋白分別建立的ELISA 方法進行比較探索，發(fā)現(xiàn)S-ELISA 法，比N-ELISA 法 在 免 疫測定中顯得更為有效，在被感染豬中病毒S 蛋白產(chǎn)生的抗體，在較長時間后依然能被監(jiān)測到，比N 蛋白更為敏感。并通過實際生產(chǎn)檢驗證實，應(yīng)用了該方法對豬場進行疾病監(jiān)測的瑞士豬場，只有一小部分發(fā)生了PEDV 感染。而近年來，對利用N 蛋白建立新的ELISA 法的研究工作也在不斷開展。如我國學(xué)者林厚新等將N 基因連入原核表達載體，在大腸桿菌中表達，并利用組氨酸標記進行純化收集重組質(zhì)粒表達的蛋白，包被抗原建立ELISA 診斷法，其特異性和敏感性分別達到98.7%、98%，為養(yǎng)殖場對PEDV 抗體檢測提供了又一便利的途徑；姜艷平等則用IPTG 誘導(dǎo)pPROHTa-N 表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的重組菌大腸桿菌BL21，產(chǎn)生的N 蛋白用鎳柱純化后，進行了Western blot、dot-ELISA、間接ELISA等免疫學(xué)實驗分析，發(fā)現(xiàn)N 蛋白做檢測抗原具有可行性，且與全病毒進行比較發(fā)現(xiàn),以PEDV全病毒作為抗原檢測陽性血清和以重組N 蛋白為抗原檢測陽性血清相比的OD 值較高，以重組N 蛋白為抗原的P/N 值達8.28。試驗證實了該方法重組的N 蛋白是代替全病毒作診斷抗原的良好選擇。

3.2 分子生物學(xué)診斷

通過分子生物學(xué)診斷，則主要是基于 RT-PCR（RNA 逆轉(zhuǎn)錄后的聚合酶鏈式反應(yīng)）技術(shù)，對該病毒中的一些保守性好，特異性高的基因設(shè)計引物，擴增相應(yīng)基因，從而達到鑒定目的。雖然單純的RT-PCR 技術(shù)建立的診斷方法，普遍具有快速、靈敏、高效等特點，但也存在不易對基因組相似度較大病毒進行區(qū)分以及存在一定假陽性的可能。通過研究工作者不斷探索，也出現(xiàn)了多重RT-PCR、熒光定量PCR 等準確性、特異性、靈敏性、效率更高的檢測方法，給實際生產(chǎn)中的PEDV 預(yù)防控制帶來了有效保障。

目前多研究中以N 基因作為RTPCR 的目的基因者相對較多。陳建飛等[6]通過對CH/S 株 PEDV 的N 基因設(shè)計引物，擴增條帶，并作生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，該基因與其他多個不同毒株的同源性均在95%以上，證實了該基因較強的保守性，為以該基因?qū)EDV 建立分子生物學(xué)診斷方法奠定了基礎(chǔ)。田小艷等[7]在針對PEDV N 基因設(shè)計引物的同時，對TGEV、PRV 設(shè)計引物作RT-PCR 擴增，用PEDV-TGEVPRV 三聯(lián)弱毒疫苗作為陽性對照，優(yōu)化條件，建立了多重RT-PCR 診斷方法；劉鄧等基于N 基因保守性良好的這一特點出發(fā)，對其設(shè)計引物和探針，并以克隆N 基因的質(zhì)粒作陽性標準品，建立了一種快速檢測豬流行性腹瀉病毒含量的TaqMan 熒光定量PCR 方法，該方法具有極高特異性，設(shè)計合成的探針中即使只有一個堿基發(fā)生突變也可阻斷熒光信號的激發(fā)。該方法在40 個循環(huán)內(nèi)即可檢測到10 copies/μL 的質(zhì)粒DNA，與常規(guī)RT-PCR 方法相比其敏感性提高了10 倍。研究者用該方法和瓊脂糖電泳檢測擴增產(chǎn)物對比，對采集樣品進行檢測，結(jié)果表明，前者陽性檢出率92%，后者僅80%且部分為假陽性。通過該研究證實了TaqMan 熒光定量RT-PCR 方法具有準確定量、靈敏度高特異性強等優(yōu)點，在對PED 診斷與防治的實際應(yīng)用上有很高的價值。

除N 基因外，PEDV 的E、M、S等基因或基因的部分保守區(qū)域也被用于建立分子生物學(xué)診斷方法。劉礦等[8]就以PEDV 的E 基因為目的基因，并同時對TGEV 設(shè)計引物，用TGE-PED 二聯(lián)苗作模板同時擴增2 種病毒目的基因，初步建立了針對PEDV、TGEV 的多重RT-PCR 診斷方法。該方法能檢測到的最小RNA 量為20 pg。應(yīng)用于臨床上便捷有效。Kim等[9]通過對 PEDV M基因，TGEV N 基因設(shè)計引物，建立了一種雙重PCR 檢測方法，對5 份臨床病料進行檢測，正確率達 100%；張坤等則在此基礎(chǔ)上根據(jù) PEDV M 基因、TGEV N 基因、GAR VP7 基因設(shè)計3 對引物，探索出了1 種能同時檢測 PEDV、TGEV和GAR 的多重RT-PCR 方法，并將這種方法和常規(guī)的RT-PCR 進行了比較。結(jié)果表明該方法檢測PEDV、TGEV、GAR 的 敏 感 性 分 別 為92%、100%、100%，特異性均為100%。由此為實際生產(chǎn)中，針對3 種病的防治檢測工作提供了又一高效、敏感的新方法。趙雯雯等針對PEDV 和TGEV 的S 基因部分保守區(qū)段分別設(shè)計特異性引物，也建立了基于2 種病毒的多重RT-PCR 診斷方法，為針對2 種病原的檢測、流行病學(xué)調(diào)查等奠定基礎(chǔ)。

3.3 PED 診斷技術(shù)方法的比較研究

綜上所述，國內(nèi)外研究人員基于免疫學(xué)或分子生物學(xué)原理，建立諸多的PEDV 新型診斷技術(shù)方法，給予臨床預(yù)防控制 PED 有效保障。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，早期建立的行之有效診斷技術(shù)顯示出不足之處。Kim 等[10]將針對PEDV 的RT-PCR 法、免疫組織化學(xué)法、原位雜交法進行了比較分析，發(fā)現(xiàn)通過對自然感染的腹瀉豬只分別利用上述3 種方法檢測，其中免疫組化法檢出69%～87%的樣品為 PEDV 陽性，72%～91%的樣品被原位雜交法檢為陽性，而 RT-PCR 法檢出了 73%～92%的陽性樣品；3 種方法的結(jié)果一致性達到83% ，證明上述3 種方法，均可獨立的對PEDV 感染做出最初較準確的判斷；研究結(jié)果顯示，免疫組織化學(xué)和原位雜交法更有利于福爾馬林固定的PEDV 感染的腸道組織的確診。關(guān)于高效、敏感的RT-PCR 診斷技術(shù)，早期研究人員認為檢測敏感性受腸道或糞便中抑制因子的影響比較大；筆者通過對本實驗室檢測結(jié)果深度分析顯示，以最佳試驗條件與合格的分子生物學(xué)試劑進行試驗操作，基本可以避免上述情況。RT-PCR 方法是目前最為便捷、靈敏、有效的實驗室快速檢測技術(shù)；除此外，ELISA 方法也以其快速、靈敏、特異的優(yōu)點受到青睞，在實際生產(chǎn)中，主要利用此法對豬場血清抗體水平進行監(jiān)測，從而輔助獸醫(yī)工作者制定更為可取的免疫途徑。

4 疫苗研究

在PED 發(fā)現(xiàn)早期的很長一段時間，人們采用被感染豬的糞便或帶PEDV 強毒的病料，感染妊娠母豬，從而在母豬體內(nèi)產(chǎn)生抗體，建立保護性免疫，并通過胎盤呈遞給仔豬的同時保護仔豬。盡管此法較為普及，但在當時，由于使用強毒，也增大了仔豬發(fā)病的危險性。20世紀90 年代，國內(nèi)外陸續(xù)開展了針對PEDV 和TGEV 的二聯(lián)滅活苗、弱毒苗，甚至同豬輪狀病毒結(jié)合的三聯(lián)苗等的研究，并取得了巨大的成就。我國哈爾濱獸醫(yī)研究所分別于1996 年和2004 年開發(fā)的TGE-PED 二聯(lián)滅活苗、TGEPED 二聯(lián)弱毒苗，都對我國當時乃至現(xiàn)在豬場在該病的防疫工作中提供了強有力的保障。與此同時，研究者對新的關(guān)于PEDV 的滅活苗和弱毒苗探索仍在不斷進行，如牛小迎等[11]、鄒勇等[12]都分別對PEDV、TGEV、PRV 三聯(lián)滅活苗進行了免疫學(xué)研究，并發(fā)現(xiàn)他們均能在被免豬體內(nèi)產(chǎn)生較強的保護性免疫。

此外，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，隨著基因工程疫苗概念的提出，國內(nèi)外諸多學(xué)者，也不斷地在分子水平上對PEDV 進行研究，主要針對于PEDV 的結(jié)構(gòu)蛋白基因展開。如余麗蕓等[13，14]就分別將PEDV 的E、M 等基因?qū)爰撞《据d體啟動子下游，并在其體外轉(zhuǎn)錄成5′末端含帽子結(jié)構(gòu)的重組RNA。然后轉(zhuǎn)染BHK21 細胞，收集病毒樣粒子用于感染BHK21 細胞。采用細胞免疫化學(xué)的方法對轉(zhuǎn)染和感染細胞的表達產(chǎn)物進行分析。研究發(fā)現(xiàn)pSFV-E RNA、pSFV-M RNA 轉(zhuǎn)染和病毒粒子感染哺乳動物細胞表達的蛋白，可與抗PEDV 多克隆抗體起特異反應(yīng)，證明體外轉(zhuǎn)錄的重組RNA 含有相應(yīng)的特異序列產(chǎn)物，從而為進一步探討以甲病毒載體為基礎(chǔ)的病毒特異基因及其編碼蛋白介導(dǎo)的抗病毒作用的研究奠定了基礎(chǔ)；國內(nèi)諸多學(xué)者也分別針對M、N 基因構(gòu)建原核表達載體，從而研究其表達蛋白的免疫原性從而為以二基因作為基因工程疫苗候選基因提供了依據(jù)。高慎陽[15]將豬流行性腹瀉病毒的 M 基因及編碼M 蛋白膜外區(qū)M 基因片斷（M′）分別亞克隆到原核表達載體pJLA605 和pGEX-6p-1 中，發(fā) 現(xiàn)只有N 端和C 端帶有GST 的pGEX-6p-M-GST 和只含有膜外區(qū)M′基因的重組質(zhì)粒pGEX-6p-M′獲得了高效表達，其表達產(chǎn)物分別以融合蛋白GST-M 和GST-M′形式存在，為利用載體表達M 蛋白，從而研發(fā)亞單位疫苗，或直接利用M 基因研究基因工程疫苗，提供了參考；且在該研究中還發(fā)現(xiàn)，M 蛋白對宿主菌有一定毒性，也由于其對大腸桿菌的細胞壁進行破壞，推斷出其與病毒的出芽功能有關(guān)。呂茂杰等則用pcD-NA3.1（＋）同N 基因構(gòu)建重組質(zhì)粒成功進行真核表達，結(jié)果表明N 蛋白具有免疫原性，且能在Vero 細胞中正確表達，為通過此基因研發(fā)PEDV 基因工程疫苗提供了參考。而目前在PEDV 的基因免疫原性中研究最多的是S 基因。如葛俊偉等[16]就利用PEDV S1 基因構(gòu)建了重組干酪乳桿菌分泌性表達載體，并在干酪乳酸桿菌中獲得表達，對蛋白免疫原性進行分析，結(jié)果表明該表達系統(tǒng)能刺激動物黏膜免疫應(yīng)答和系統(tǒng)免疫應(yīng)答，能誘導(dǎo)體液、細胞雙重免疫應(yīng)答，該研究為利用重組干酪乳桿菌表達系統(tǒng)作為口服疫苗奠定了基礎(chǔ)。

5 亟待解決的問題

目前在PED 預(yù)防控制中有下列幾個瓶頸問題，制約著防治工作。首先，缺失基層臨床實際現(xiàn)地應(yīng)用的商品化的快速、準確、方便的診斷方法。由于基層缺少可用的簡單快速的診斷方法，現(xiàn)地的診斷大都是依據(jù)流行病學(xué)資料、臨床癥狀、與解剖病理變化，由于非典型癥狀比較常見，常導(dǎo)致誤診。其二，中小型養(yǎng)殖戶對腹瀉病的重視程度不夠，因而對其預(yù)防工作疏于管理。中小型養(yǎng)殖戶當前眼里就那幾個重要疾病，如藍耳病、圓環(huán)病毒病、豬瘟、偽狂犬病等，很少對其他疫病進行免疫預(yù)防。其三，免疫接種密度不夠，而大部分豬群處于免疫空白狀態(tài)，遷居易感豬群的廣泛存在，為腹瀉病的流行提供了巨大潛在的因素。

6 預(yù)防與控制措施

目前PED 無有效藥物治療，需要加強飼養(yǎng)管理與預(yù)防控制，如加強對豬場的消毒綜合防治措施，平時經(jīng)常性的對圈舍衛(wèi)生進行維護，對飼喂中使用的料槽、鏟等器具及時消毒；加強對豬只的飼養(yǎng)管理，保持豬圈干燥、通風、保溫；制定合理的免疫程序，采用TGEPED 二聯(lián)滅活苗或二聯(lián)弱毒苗進行群體免疫，并定期采集血清，應(yīng)用ELISA法監(jiān)測群體抗體水平。對已發(fā)病豬只進行隔離。治療時以補液為主，飲水中加入黃芪多糖以提高免力，加入電解多維補充相應(yīng)維生素，還應(yīng)在飲水中加入一定濃度的鈉鹽和糖分。在治療或預(yù)防該病時也可采用飼料添加抗生素，以防止或減少豬只由于病毒病感染和腹瀉等消化系統(tǒng)癥狀造成的機體免疫水平下降，從而繼發(fā)其他細菌性感染的可能。

在對該病的治療中，有人提出采用“饑餓療法”即每天補充糖鹽水，但不給予飼料的方法。但也有學(xué)者認為該方法存在很大弊端，如在病重豬只消化道本來空虛的情況下，再不予以營養(yǎng)物質(zhì)補給，導(dǎo)致其過剩的胃酸刺激或破壞腸黏膜，造成機體更大的損傷；在豬只被感染情況下，再不予以相應(yīng)能量物質(zhì)的補充，導(dǎo)致豬只消耗自體營養(yǎng)儲備，加劇機體免疫水平下降[17]。故而當適量補充易消化、適口性好的飼料提供營養(yǎng)支持。

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