細(xì)菌素在動(dòng)物疾病防治中的作用和機(jī)理研究進(jìn)展

劉寶生 尚雅靜 張日俊

隨著畜牧業(yè)的不斷發(fā)展，抗生素的超量使用給畜牧業(yè)帶來(lái)的種種弊端日漸成為普通百姓關(guān)注的活題。致病菌中能耐受幾乎所有抗生素的“超級(jí)細(xì)菌”的出現(xiàn)更成為桎梏畜牧業(yè)進(jìn)一步發(fā)展的關(guān)鍵。全面停止抗生索在動(dòng)物飼料中的添加，嚴(yán)格區(qū)分人、畜抗生素在疾病防治中的應(yīng)用便成了全球人們的共同呼聲。因而盡快尋找一種(類)能完全取代抗生素在畜牧業(yè)中作用的產(chǎn)品便成為廣大科學(xué)工作者不斷努力的方向。細(xì)菌素是一類由細(xì)菌分泌的通過(guò)在其他細(xì)菌的細(xì)胞膜上形成孔隙或影響細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)某些代謝過(guò)程的高效抗菌蛋白類物質(zhì)，其作為一種長(zhǎng)期存在于自然環(huán)境中的，具有天然抑(殺)菌能力的小分子蛋白類物質(zhì)，目前已成為廣大科學(xué)工作者研究和開(kāi)發(fā)的焦點(diǎn)。在國(guó)外，這方面的研究自20世紀(jì)七八十年代就已開(kāi)始，而國(guó)內(nèi)有關(guān)細(xì)菌素用于動(dòng)物疾病防治的研究報(bào)道尚未見(jiàn)公開(kāi)發(fā)表。筆者僅就細(xì)菌素在動(dòng)物疾病防治中的應(yīng)用研究作一綜述，為進(jìn)一步加速我國(guó)對(duì)細(xì)菌素在動(dòng)物疾病防治中的應(yīng)用和研究提供科學(xué)依據(jù)。

1.細(xì)菌素的性質(zhì)

細(xì)菌索是廣泛存在于生活細(xì)菌周?chē)囊活愑珊颂求w合成的蛋白或多肽類物質(zhì)，是細(xì)菌在生活中為了爭(zhēng)奪營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生存空間而分泌到周?chē)h(huán)境中的、對(duì)其他細(xì)菌(尤其是具有近緣關(guān)系的細(xì)菌或菌株)具有抑制或殺滅作用的蛋白類物質(zhì)，分泌菌自身對(duì)其具有免疫能力。細(xì)菌素與肽類抗生素的區(qū)別是前者是由基因編碼、核糖體合成的一類胞外分泌蛋白，而后者則是細(xì)菌在生活過(guò)程中由多種酶類共同參與合成的蛋白類次級(jí)代謝產(chǎn)物(它沒(méi)有自己的編碼基因，也不是在核糖體內(nèi)合成的)。細(xì)菌素與肽類抗生素的共同之處是兩者都是蛋白類抗菌活性物質(zhì)，都對(duì)各自的敏感菌具有強(qiáng)烈的抑制或殺滅作用。細(xì)菌素是細(xì)菌在生存競(jìng)爭(zhēng)中的一種重要武器，自然界中99%的細(xì)菌都具有分泌一種或多種細(xì)菌素的能力。細(xì)菌素如此大規(guī)模的天然儲(chǔ)備是細(xì)菌素全面取代抗生素的一個(gè)得天獨(dú)厚的有利條件。

2.細(xì)菌素的生產(chǎn)與制備

細(xì)菌素的生產(chǎn)通常有2種方式：利用高產(chǎn)細(xì)菌素的天然菌株進(jìn)行生產(chǎn)；利用工程菌株對(duì)細(xì)菌素的目的基因進(jìn)行高效表達(dá)。前者產(chǎn)量通常較低，但所得細(xì)菌素的抗菌活性卻非常穩(wěn)定可靠，常用于實(shí)驗(yàn)室階段的研究；后者利用成熟的基因工程表達(dá)系統(tǒng)將編碼細(xì)菌素的目的基因進(jìn)行高效表達(dá)，從而達(dá)到大規(guī)模生產(chǎn)細(xì)菌素的目的，是細(xì)菌素商品化的首選生產(chǎn)方式。但不管是天然菌還是工程菌發(fā)酵所生產(chǎn)的細(xì)菌素通常都是溶解在培養(yǎng)基中的混合物，還要經(jīng)過(guò)鹽析、超濾、層析等一系列的分離純化才能獲得相應(yīng)的純品或半純品，有的還要進(jìn)行干燥、包被或膠囊化后才能用于各種試驗(yàn)和生產(chǎn)實(shí)踐中。

3.細(xì)菌素在動(dòng)物疾病防治中的作用

3.1 細(xì)菌素抗動(dòng)物致病菌的體外試驗(yàn)效果

大量的體外試驗(yàn)表明，細(xì)菌素對(duì)動(dòng)物體內(nèi)的各種致病菌都具有強(qiáng)烈的抑殺作用。細(xì)菌素的特征之一就是大多只對(duì)與分泌菌有近緣關(guān)系的菌株具有抑殺作用，利用這一特點(diǎn)，Etcheverria等在牛的結(jié)腸中分離到了能通過(guò)分泌細(xì)菌素來(lái)抑制大腸桿菌O157：H7的非致病性大腸桿菌，這對(duì)畜牧業(yè)中有效控制致病性大腸桿菌0157：H7的感染具有重要意義，同時(shí)也為控制動(dòng)物的其他腸道致病菌提供了一個(gè)很好的思路。但最近越來(lái)越多的研究結(jié)果表明細(xì)菌素也具有廣譜抑(殺)菌的能力，而且在抑殺致病菌方面與相應(yīng)的抗生索具有同等效力。Xie等在長(zhǎng)期的細(xì)菌素研究中分離到多株具有高產(chǎn)、廣譜、高效抑(殺)菌能力的細(xì)菌素生產(chǎn)菌株。國(guó)外的研究也表明細(xì)菌素不僅對(duì)G+菌具有抑制作用，而且對(duì)G-菌也具有良好的抑制效果，在這些被抑殺的致病菌中既有好氧菌，也有厭氧菌。

體外試驗(yàn)結(jié)果還表明，細(xì)菌素不僅對(duì)普通的致病菌具有抑殺作用，更重要的是細(xì)菌素對(duì)那些已經(jīng)對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥性的致病菌依然表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑殺作用。Galvin等報(bào)道，廣譜抗菌的細(xì)菌素Lacticin 3147對(duì)抗二甲氧基芐青霉素的金黃色葡萄球菌、抗萬(wàn)古霉索的糞腸球菌、抗青霉素的肺炎球菌都具有抑殺作用。細(xì)菌素對(duì)抗生素耐藥性菌株的抑殺作用是基于其與抗生素完全不同的殺菌機(jī)理。事實(shí)上，細(xì)菌素最初之所以能被廣大科技工作者重視的一個(gè)主要原因就是Nisin能有效抑制在低溫環(huán)境下仍具有頑強(qiáng)生命力的致病性單胞李斯特氏菌。因此，細(xì)菌素對(duì)致病菌的抑殺作用一直以來(lái)都是對(duì)細(xì)菌素研究的一個(gè)核心。

3.2 細(xì)菌素在動(dòng)物疾病防治中體表給藥的試驗(yàn)效果

體外試驗(yàn)的絕佳效果推動(dòng)了細(xì)菌素作為一種新型獸藥用于動(dòng)物疾病防治的嘗試。對(duì)細(xì)菌素來(lái)說(shuō)，在動(dòng)物疾病防治中址直接的應(yīng)用方式就是在動(dòng)物的體表用藥，其中研究最多的是細(xì)菌素在乳牛乳腺炎防治中的應(yīng)用。Oliveira等的研究發(fā)現(xiàn)，分離自乳牛乳腺炎的65株致病菌全部都對(duì)由金黃色葡萄球菌質(zhì)粒pRJ9產(chǎn)生的細(xì)菌素敏感。細(xì)菌素Lacticin 3147和Nisin的在體試驗(yàn)均表明細(xì)菌素可有效預(yù)防乳牛乳腺炎的發(fā)生而不會(huì)產(chǎn)生任何副作用。在人醫(yī)上，利用細(xì)菌素來(lái)防治粉刺也取得了良好的試驗(yàn)效果。

3.3 口服細(xì)菌素對(duì)動(dòng)物疾病防治的試驗(yàn)效果

口服給藥是動(dòng)物疾病防治中最常用的一種給藥方式。但因?yàn)榧?xì)菌素自身的蛋白質(zhì)特性，細(xì)菌素的作用活性易受周?chē)h(huán)境因素的影響，而且易被動(dòng)物體內(nèi)的某些酶部分降解。消化道中的內(nèi)容物成分復(fù)雜，而且還含有大量能分解蛋白質(zhì)的蛋白酶類，這使細(xì)菌素的消化道給藥一直以來(lái)成為細(xì)菌素作為藥用的一個(gè)難點(diǎn)。Gardiner等給斷奶后5周的生長(zhǎng)豬空腹飼喂200 ml。含Lacticin 3147為5000AU／mL的復(fù)活液和200g的開(kāi)食料，飼喂后2h采集胃、空腸和回腸內(nèi)容物檢測(cè)Lacticin 3147的含量，結(jié)果表明，細(xì)菌素Lacticin 3147在動(dòng)物采食后第2h在消化道各段內(nèi)均無(wú)法檢測(cè)到其活性的存在，質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步表明胃腸道中并沒(méi)有細(xì)菌

素Lacticin 3147的殘存。同樣的結(jié)果來(lái)自Bernbom等的研究，飼喂Nisin的小鼠經(jīng)ELISA檢測(cè)，其小腸食糜和糞便中 Nisin含量分別是其生物活性的10倍和200倍，這說(shuō)明進(jìn)入小鼠腸道內(nèi)的Nisin很快就會(huì)在消化道內(nèi)分解成碎片。由此看來(lái)，細(xì)菌素在進(jìn)入動(dòng)物的消化道后確實(shí)會(huì)被消化道內(nèi)的消化酶部分或全部降解。此外，Gardiner等將Lacticin 3147與豬的糞便混合，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌素的活力在0.5h內(nèi)就下降了70%，到1h時(shí)只剩1.5%，這也說(shuō)明腸道內(nèi)的復(fù)雜環(huán)境(內(nèi)容物的吸附作用、酶、微生物、pH等的影響)對(duì)細(xì)菌素的活性的確有很大的影響。

盡管細(xì)菌素在動(dòng)物消化道內(nèi)的作用會(huì)受到大量不利因素的影響，但仍有不少細(xì)菌素通過(guò)口服給藥獲得了良好效果的試驗(yàn)報(bào)道。Stern等通過(guò)人工感染的方法，使剛孵出的小雞感染空腸彎曲菌，從第7d起，連續(xù)3d用經(jīng)PVP包被的細(xì)菌素OR-7進(jìn)行治療，結(jié)果表明口服經(jīng)微膠囊包被的細(xì)菌素可以極顯著地降低家禽腸道內(nèi)空腸彎曲菌的數(shù)量。Rea等通過(guò)模擬腸道環(huán)境，證明細(xì)菌素Lacticin 3147即使在18μg／ml。的低濃度下，仍然可以將動(dòng)物腸道內(nèi)高達(dá)1X106CFU／mL的頑固性痢疾梭菌完全清除。Corr等還通過(guò)試驗(yàn)證明了產(chǎn)細(xì)菌素的唾液乳桿菌進(jìn)入小鼠胃腸道后，能有效防止單胞李斯特氏菌感染的是它分泌的細(xì)菌素Abpll8而不是乳桿菌本身，這也從另一個(gè)側(cè)面證實(shí)了細(xì)菌素在動(dòng)物腸道內(nèi)仍可有效發(fā)揮其抗菌作用的功能。事實(shí)上細(xì)菌素對(duì)細(xì)菌的抑殺作用是非常迅速的，在一定條件下(如進(jìn)行物理包被、化學(xué)修飾等)，細(xì)菌素完全可以在它被消化道內(nèi)的酶降解之前完成其殺菌的作用。此外，最新的研究結(jié)果表明，細(xì)菌素還可以通過(guò)形成環(huán)狀或某些特殊的氨基酸來(lái)增強(qiáng)抗動(dòng)物胃腸道消化酶降解的能力。但細(xì)菌素作為一類分子質(zhì)量較小的活性肽是否能夠有效通過(guò)動(dòng)物胃腸道粘膜上皮細(xì)胞而進(jìn)入血液對(duì)動(dòng)物體的系統(tǒng)感染起到預(yù)防和治療作用至今尚未見(jiàn)報(bào)道。

3.4 高純度細(xì)菌素腹腔和靜脈注射的試驗(yàn)效果

Mota-Meira等的研究結(jié)果表明，腹腔注射的細(xì)菌素mutacin B-Ny266和萬(wàn)古霉素一樣可以有效地治療由金黃色葡萄球菌引起的小鼠腹腔感染，當(dāng)對(duì)照組的死亡率高達(dá)70%～100%時(shí)，試驗(yàn)組無(wú)1例出現(xiàn)死亡。Ingham等通過(guò)靜脈注射純化的細(xì)菌素Piscicolin 126(P126)來(lái)治療由靜脈注射單胞李斯特氏菌引發(fā)的小鼠全身性感染，結(jié)果表明：細(xì)菌素P126在注射到小鼠體內(nèi)后仍然保持抗單胞李斯特氏菌的活性，在李斯特氏菌感染的早期，靜脈注射細(xì)菌素P126能明顯減少李斯特氏菌在肝、脾的附著，減輕李斯特氏菌感染的臨床癥狀。這些結(jié)果表明，高純度的細(xì)菌素可以通過(guò)腹腔或靜脈注射的方式用來(lái)控制和治療動(dòng)物體全身性細(xì)菌感染性疾病。大多情況下，細(xì)菌素注射后引起的副作用或溶血性反應(yīng)主要是因?yàn)槠渲泻休^多雜質(zhì)的原因。研究表明，與真核抗菌肽magainin不同，高純度的細(xì)菌素Nisin并不會(huì)引起人的紅細(xì)胞產(chǎn)生溶血。此外，Reddy等的研究也表明，陰道內(nèi)使用Nisin后，Nisin可以迅速透過(guò)陰道的粘膜上皮而進(jìn)入血液中，進(jìn)入血液中的Nisin可以在血液循環(huán)中被迅速清除，對(duì)動(dòng)物自身的生長(zhǎng)和生殖不會(huì)產(chǎn)生任何明顯的影響。

3.5 細(xì)菌素的體外抗癌作用

體外試驗(yàn)表明，細(xì)菌素還具有抗癌的功效。在20世紀(jì)80年代，由于試驗(yàn)中所用的細(xì)菌素大多為粗提物，所以很少有關(guān)于細(xì)菌素具有抗癌性能的相關(guān)報(bào)道。隨著高度純化的細(xì)菌素的出現(xiàn)，越來(lái)越多的試驗(yàn)結(jié)果表明細(xì)菌素對(duì)多種癌細(xì)胞系具有拮抗作用?，F(xiàn)已證明具有抗癌作用的細(xì)菌素有Vibriocin、Pyocin、Colicin、Pediocin和Microcin等。早在1976年Farkas-Himsley和Cheung就對(duì)包括Colicin在內(nèi)的多種細(xì)菌素進(jìn)行了試驗(yàn)，他們發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞對(duì)細(xì)菌素的敏感性要比普通細(xì)胞強(qiáng)，而且還發(fā)現(xiàn)動(dòng)物的癌細(xì)胞要比人的癌細(xì)胞對(duì)細(xì)菌素更敏感。Abdi-Ali等的研究也表明細(xì)菌素PyocinS2只對(duì)癌細(xì)胞有抑制作用，而對(duì)正常的細(xì)胞不會(huì)產(chǎn)生抑制作用。雖然試驗(yàn)的結(jié)果顯示細(xì)菌素對(duì)動(dòng)物的癌細(xì)胞具有抑殺作用，但其作用的機(jī)理是否與抑殺細(xì)菌的作用機(jī)理一樣，目前還不得而知。但有報(bào)道稱Colicins E3和E5對(duì)癌細(xì)胞的抑制作用是引起癌細(xì)胞的壞死而不是引發(fā)細(xì)胞的凋亡，而對(duì)Microcin E492的研究表明，低濃度的Microcin E492即可引發(fā)Hela細(xì)胞的凋亡，而在高濃度時(shí)則可直接導(dǎo)致Hela細(xì)胞的壞死。

4.細(xì)菌素的抑(殺)菌機(jī)理

自從1925年比利時(shí)學(xué)者Gratia發(fā)現(xiàn)第一種細(xì)菌素——Colicin以來(lái)，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，截至2007年6月已有近300種細(xì)菌素被分離純化出來(lái)。這些細(xì)菌素中絕大部分都攜帶有一定量的凈正電荷，且多肽鏈中75%以上都含有5～20個(gè)不等的疏水性氨基酸。這些凈正電荷和由疏水性氨基酸構(gòu)成的雙親特性正是大多數(shù)細(xì)菌素對(duì)細(xì)菌具有抑殺作用的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

大量的研究表明，細(xì)菌素對(duì)細(xì)菌的拮抗作用不 僅僅是抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，同時(shí)也對(duì)細(xì)菌具有強(qiáng)烈的殺滅作用。當(dāng)細(xì)菌素作用于目標(biāo)菌株時(shí)，它可以由自身所帶的正電荷與細(xì)菌細(xì)胞膜上所帶的負(fù)電荷之間產(chǎn)生的靜電吸附或細(xì)菌素與細(xì)菌細(xì)胞膜之間產(chǎn)生的疏水相互作用而向細(xì)菌靠近，并最終吸附在細(xì)菌的細(xì)胞膜上。在低劑量時(shí)，細(xì)菌素可以利用自身的雙親特性在細(xì)菌的細(xì)胞膜上形成跨膜的微小孔道。這些微孔足以讓細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的各種小分子物質(zhì)(如H+、K+及各種有機(jī)小分子)滲漏到細(xì)胞膜外，從而使細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)外的質(zhì)子動(dòng)力勢(shì)(PMF)和電勢(shì)差消失。細(xì)菌為了恢復(fù)原有的細(xì)胞內(nèi)外的離子和電勢(shì)的平衡，就會(huì)不斷通過(guò)水解ATP的方式將泄漏到細(xì)胞外的離子和小分子物質(zhì)重新運(yùn)回細(xì)胞內(nèi)，這樣一來(lái)，細(xì)菌最終會(huì)因?yàn)锳TP的耗盡而又無(wú)法恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)外的離子和電勢(shì)的平衡而枯竭至死。當(dāng)細(xì)菌素的濃度較大時(shí)，大量吸附在菌體細(xì)胞膜上的細(xì)菌素可以影響菌體細(xì)胞膜的性狀，使細(xì)胞膜出現(xiàn)瞬時(shí)的缺口,吸附在菌體細(xì)胞膜上的細(xì)菌素即可通過(guò)這種瞬時(shí)的缺口進(jìn)入細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。這些進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的細(xì)菌素即可影響細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的多種代謝過(guò)程，如DNA的合成、RNA的轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞壁的合成等等，從而發(fā)揮抑(殺)菌作用。同時(shí)，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的細(xì)菌素還可以進(jìn)一步吸附在細(xì)菌細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)。細(xì)菌在細(xì)胞膜內(nèi)外的細(xì)菌素的共同影響下，細(xì)胞膜出現(xiàn)較大的裂口，細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)(包括大分子有機(jī)物如ATP、核酸、蛋白質(zhì)等)大量擴(kuò)散到細(xì)胞外，從而導(dǎo)致細(xì)菌死亡，有的甚至可以導(dǎo)致整個(gè)細(xì)菌細(xì)胞裂解，細(xì)胞不復(fù)存在。

5.細(xì)菌素在動(dòng)物疾病防治中的安全性評(píng)價(jià)

耐藥性是所有抗菌性藥物必然會(huì)遇到的一個(gè)問(wèn)題，細(xì)菌素與抗生素一樣也會(huì)有耐藥性菌株的出現(xiàn)。但其出現(xiàn)的概率在1×10-9～1×10-8之間，比抗生素的概率要低得多。其原因是細(xì)菌素的作用機(jī)理與大多抗生素不同，細(xì)菌素對(duì)致病菌的殺滅作用是基于細(xì)菌素和致病菌自身的一些物理特性完成的，因此發(fā)生突變而產(chǎn)生耐藥性的概率就變得非常低。但仍有不少研究結(jié)果表明，致病菌可以通過(guò)改變細(xì)胞膜的不飽和脂肪酸和(或)帶正電荷氨基酸殘基的含量及改變細(xì)胞膜磷脂的組成來(lái)改變細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，降低細(xì)胞表面負(fù)電荷的含量，對(duì)細(xì)菌素產(chǎn)生抗性。

藥理、毒理的研究是細(xì)菌素用于動(dòng)物疾病防治的必備資料，也是現(xiàn)今開(kāi)發(fā)各種細(xì)菌索在動(dòng)物疾病防治中的應(yīng)用的一個(gè)關(guān)鍵性任務(wù)，但直到目前，有關(guān)這方面的報(bào)道非常少。Drewa等通過(guò)在培養(yǎng)基中加入細(xì)菌索Staphylococcin T的方法研究了細(xì)菌素對(duì)哺乳動(dòng)物成纖維細(xì)胞的影響，結(jié)果表明，使用細(xì)菌索后成纖維細(xì)胞的形態(tài)沒(méi)有產(chǎn)生明顯的變化。為了進(jìn)一步開(kāi)發(fā)Nisi在婦女生殖健康及避孕上的應(yīng)用，Reddy等在家兔和小鼠上進(jìn)行了一系列急性毒性和慢性毒性試驗(yàn)，所有的結(jié)果都一致表明Nisin的使用不會(huì)對(duì)動(dòng)物本身及其后代產(chǎn)生任何不良影響。

總之，細(xì)菌素是細(xì)菌自身產(chǎn)生的對(duì)其他細(xì)菌或菌株具有抑殺作用的一類蛋白類物質(zhì)，它對(duì)對(duì)各種致病菌都具有很強(qiáng)的抑殺活性，在動(dòng)物體內(nèi)使用后通常很難產(chǎn)生耐藥性，也不會(huì)有任何的殘留，是目前各類抗菌物質(zhì)中有望完全取代抗生索并在畜牧業(yè)中應(yīng)用的一類理想替代品。隨著對(duì)細(xì)菌素在動(dòng)物疾病防治中應(yīng)用研究的不斷深入，有理由相信細(xì)菌素必將為今后畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展發(fā)揮巨大的作用。