冠心病中醫(yī)證候與基因相關(guān)性研究*

吳欣芳，王 階，潘菊華

(中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，北京 100053)

冠心病是一種多基因、多因素疾病，發(fā)病原因復(fù)雜，不僅涉及多個基因及其相互作用，還涉及一些環(huán)境因素及與基因的相互作用。隨著人類基因組計劃的實施，眾多的醫(yī)學(xué)家正致力于如何從分子、基因水平突破對冠心病的傳統(tǒng)認識，通過基因組技術(shù)確定致病基因，從而改變治療方式。2007年《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》報道了在WTCCC和 German MI Family Study研究中，發(fā)現(xiàn)了與冠心病密切相關(guān)的幾個基因位點，在這幾個基因位點單獨或者聯(lián)合作用下，冠心病發(fā)病風(fēng)險大為增加[1]。冠心病屬于中醫(yī)“胸痹心痛”范疇，中醫(yī)藥辨證論治在冠心病治療中發(fā)揮著重要作用，而如何實現(xiàn)冠心病中醫(yī)證候的客觀化、標準化又是最重要的。隨著對中醫(yī)證本質(zhì)認識的進一步深入，冠心病中醫(yī)證候的現(xiàn)代研究也從以癥狀、體征為主體，逐漸發(fā)展至神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)，目前已經(jīng)發(fā)展到分子基因水平。很多學(xué)者已經(jīng)認識到，證的本質(zhì)應(yīng)是基因表達產(chǎn)生的蛋白質(zhì)和多肽分子。將冠心病中醫(yī)證候與基因相結(jié)合，為冠心病中醫(yī)證候診斷提供了客觀標準，是冠心病中醫(yī)證候研究的趨勢。

1 冠心病中醫(yī)證候相關(guān)基因及其多態(tài)性研究

目前證候-基因研究的主要思路包括[2]:不同證候狀態(tài)下基因表達的比較研究;中醫(yī)證候與基因多態(tài)性的相關(guān)研究以及基因突變型與中醫(yī)證型的相關(guān)性研究等。冠心病證候的研究多集中于冠心病中醫(yī)證候與相關(guān)基因及其多態(tài)性等方面。大量臨床研究及實驗表明，冠心病患者臨床多表現(xiàn)為瘀血阻絡(luò)證、痰濁內(nèi)阻證和痰瘀互阻證，因此目前冠心病中醫(yī)證候相關(guān)基因及其多態(tài)性研究主要涉及冠心病血瘀證、痰濁證及痰瘀互阻證。

1.1 冠心病血瘀證相關(guān)基因及其多態(tài)性研究

血瘀證是冠心病臨床最常見的中醫(yī)證型，因此對冠心病血瘀證相關(guān)基因的研究較多。以往研究表明，冠心病血瘀證相關(guān)基因包括凝血因子Ⅶ(FⅦ)基因多態(tài)性、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)基因多態(tài)性、G蛋白β亞基(GNB3)基因825TT基因型[3]及膽固醇運輸?shù)鞍谆?ABCA1)基因多態(tài)性等[4]。

黃獻平等[5]通過檢測分析冠心病心血瘀阻證、非心血瘀阻證、非冠心病心血瘀阻證患者和健康對照組的FⅦ基因型(M1M1、M1M2、M2M2)和等位基因(M1、M2)及FⅦc。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，冠心病心血瘀阻證組在基因型M1M1和等位基因M1頻率分布均顯著高于健康對照組，F(xiàn)Ⅶ-M1M1基因型的受檢者FⅦc值在心血瘀阻證組最高，而FⅦ-M1M2基因型受檢者FⅦc值則相反，從而認為FⅦ基因M1 M1多態(tài)性及M1等位基因與冠心病心血瘀阻證相關(guān)。

毛以林等[6]通過檢測冠心病血瘀證和冠心病非血瘀證患者及健康人的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)基因型，探討ACE基因插入/缺失(insertion/deletion，I/D)多態(tài)性與冠心病血瘀證的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，冠心病血瘀證組ACE DD基因型及D等位基因頻率高于非血瘀證組和健康對照組。且AgⅡ各組DD型均高于II型和ID型，其中以冠心病血瘀證組DD型為最高，認為DD型ACE基因可能為冠心病血瘀證發(fā)病的易感基因。

1.2 冠心病痰濁證相關(guān)基因及其多態(tài)性研究

痰濁證也是冠心病最常見的證型之一?，F(xiàn)代研究[7、8]表明，中醫(yī)痰濁證與脂質(zhì)代謝密切關(guān)系。載脂蛋白E(ApoE)主要參與人體脂質(zhì)代謝，參與動員和重新分配脂類物質(zhì)的轉(zhuǎn)運。apoE是ApoE的編碼基因，有3個主要等位基因，即E2、E3及E4。目前研究已表明，apoE基因多態(tài)性與多種復(fù)雜性狀疾病的發(fā)病風(fēng)險具有相關(guān)性，其中包括脂類代謝紊亂、冠心病等。因此，冠心病痰濁證及apoE基因多態(tài)性的相關(guān)性是目前研究的重點。

歐陽濤等[9]通過檢測冠心病痰證、瘀證、痰瘀互阻證和非痰非瘀證患者及健康對照者的血脂水平，并提取全血DNA檢測apoE基因型，探討冠心病痰瘀證與apoE基因第4外顯子多態(tài)性的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，攜帶E4等位基因患者的血脂水平明顯高于非攜帶者;痰證特別是E3/4基因型患者中E3/4型和E4等位基因的頻率明顯高于血瘀證患者。從而認為，apoE E4等位基因是冠心病的危險因素，攜帶此基因的患者與痰證關(guān)系較為密切，推測其可能是冠心病痰證的主要易感基因之一。

莫鴻輝等[10]也通過研究發(fā)現(xiàn)，apoE第4外顯子的基因型及等位基因頻率在冠心病不同中醫(yī)證候中的分布有明顯差異，等位基因E4攜帶者更傾向于發(fā)生痰證，表明E4等位基因特別是E3/4基因型，可能是冠心病及中醫(yī)痰證的主要易感基因之一，考慮與E4等位基因表達的APoE有升高LDL-C的作用有關(guān)。

1.3 冠心病痰瘀證相關(guān)基因及基因多態(tài)性研究

痰和瘀是2種不同的病理產(chǎn)物和致病因素，在某種狀態(tài)下，兩者相互為患，形成新的病理因素，痰瘀互阻在冠心病的發(fā)病中起著重要作用。

有大量研究表明，冠心病與C-反應(yīng)蛋白(CRP)1059G/C基因多態(tài)性、E-選擇素G98T及5128R基因多態(tài)性有關(guān)[11～14]。因此有學(xué)者探討了C-反應(yīng)蛋白及E-選擇素基因多態(tài)性與冠心病中醫(yī)證型的關(guān)系。朱會英等[15]將冠心病患者分為痰瘀證、痰濁證、血瘀證3組，同時設(shè)立正常組，腦梗死痰瘀證對照組，通過檢測 CRP1059G/C、E-選擇素 G98T及5128R的基因多態(tài)性，從而探討冠心病痰瘀證與CRP、E-選擇素水平及其基因多態(tài)性關(guān)系，發(fā)現(xiàn)冠心病痰瘀證可能與CRP1059G/C的C等位基因、E-選擇素G98T的G等位基因、E-選擇素的S128R的R等位基因有關(guān)。

有報道，冠心病的形成與血小板衍化生長因子-A(PDGF-A)基因異常表達關(guān)系密切[16]。為了觀察冠心病痰瘀證與外周血單核細胞PDGF-A mRNA表達的內(nèi)在聯(lián)系，王東生[17]等通過檢測冠心病非痰非瘀證、痰凝心脈證、痰瘀痹阻證患者及健康對照者的外周血單核細胞PDGF-A mRNA的表達，發(fā)現(xiàn)健康人外周血單核細胞PDGF-A mRNA基因表達微弱，而冠心病患者在非痰非瘀證到痰凝心脈證到痰瘀痹阻證的變化中，基因表達逐漸增加，從而認為冠心病痰瘀證病理變化的分子機制與PDGF-A mRNA異常表達有關(guān)。

2 冠心病中醫(yī)證候相關(guān)基因差異表達譜研究

人類基因組計劃的完成和后基因組時代的到來，為中醫(yī)證候的研究帶來了新的機遇，特別是基因芯片技術(shù)的出現(xiàn)，為中醫(yī)復(fù)雜的證的研究提供了可能性。沈自尹院士倡導(dǎo)[18]“遵循中醫(yī)學(xué)研究本身的內(nèi)在規(guī)律，充分利用功能基因組學(xué)的研究成果，建立中醫(yī)證的表達譜，將是2l世紀中醫(yī)藥學(xué)的主要發(fā)展趨勢”。但限于技術(shù)、經(jīng)費等原因，目前冠心病中醫(yī)證候相關(guān)基因譜的研究較少。

王階等[19]通過對冠心病血瘀證、冠心病非血瘀證、非冠心病血瘀證患者和正常健康者外周血mRNA差異顯示，獲得差異條帶、反向Northern法陽性驗證、克隆測序并進行生物信息學(xué)分析和臨床驗證，得到28條真實差異基因片段序列，與 NCBI human genomic數(shù)據(jù)庫中比對分析，獲得3條(b13、49b、23b)與人類基因有100%同源性。其中，b13、23b在冠心病血瘀證組呈高表達，表明差異基因中b13、23b與冠心病血瘀證的病理改變密切相關(guān)。

李煒弘等[20]用基因芯片探討冠心病心陽虛證特征性基因表達譜，采集5例患者和正常人外周血，抽提RNA行基因芯片檢測，并對5例患者做溫陽通痹治療，其中1例顯效。提取這1例患者治療前后的外周血做基因芯片，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5例患者與正常人比較，差異表達基因231條，其與典型患者(1例)治療前后的基因芯片差異基因譜中有39條差異基因表達一致，2條差異基因表達相異，說明這39條基因的差異表達可能是冠心病心陽虛證發(fā)生的分子生物學(xué)基礎(chǔ)，部分闡釋了冠心病心陽虛證的病理機制。

3 展望

隨著后基因組時代的到來，從基因和分子層面剖析疾病的本質(zhì)正成為新的研究重點。眾多中醫(yī)藥工作者已經(jīng)認識到從基因?qū)用娼沂竟谛牟∽C候的本質(zhì)是冠心病中醫(yī)證候研究的必然趨勢，并開展了相應(yīng)的研究，但存在的問題也值得進一步思考與探討。

首先，目前冠心病中醫(yī)證候-基因的研究才剛剛起步，且多停留在證候與單一基因相關(guān)性的層面上，涉及的證候也限于血瘀證、痰濁證、痰瘀互阻證、心陽虛證，而冠心病其他證候如心陰虛證、寒凝證等研究還處于空白階段，證候分型的基因組數(shù)據(jù)更是缺乏。但冠心病發(fā)病機制復(fù)雜，不僅涉及多個基因及其相互作用，還涉及一些環(huán)境因素及其與基因的相互作用，研究單基因及其多態(tài)性與證候的相關(guān)性顯然不能把握證候的本質(zhì)。因此在以后的研究中，要注意對所篩選出的多基因及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進行分析，以期建立證候-基因表達譜，同時也應(yīng)該加強對冠心病其他中醫(yī)證候的研究，發(fā)掘其相關(guān)基因，才能更好地指導(dǎo)臨床。

其次，基因診斷技術(shù)復(fù)雜精細，所需試劑價格昂貴，對操作人員要求高，限制了其在中醫(yī)證候研究領(lǐng)域的應(yīng)用。盡管有學(xué)者已經(jīng)開始應(yīng)用基因組技術(shù)探討中醫(yī)證候的相關(guān)基因表達譜，但多為小樣本研究，說服力及可重復(fù)性不強，因此在以后的研究中應(yīng)增大其研究樣本量，使其研究結(jié)果更加準確與客觀。

從基因水平來揭示冠心病中醫(yī)證候的本質(zhì)還有一個漫長的過程，但我們應(yīng)該看到基因組學(xué)的發(fā)展為中醫(yī)學(xué)的研究帶來了新的思路和方法，我們應(yīng)該抓住這個契機，將冠心病的中醫(yī)證候研究與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)分子技術(shù)相結(jié)合，最終實現(xiàn)冠心病中醫(yī)證候診斷的客觀化和規(guī)范化。

[1]Samani NJ，Erdmann J，Hall AS，et al.Genomewide Association Analysis of Coronary Artery Disease[J].N Engl J Med，2007，357(5):443-453.

[2]蔣躍絨，殷惠軍.血瘀證基礎(chǔ)研究的若干思考[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2005，11(8):561-563.

[3]吳依芬，周迎春.冠心病中醫(yī)證型與GNB3基因C825T多態(tài)性的關(guān)聯(lián)性分析[J].四川中醫(yī)，2006，24(4):23-25.

[4]吳依芬，周迎春，張學(xué)森.中國漢族男性冠狀動脈粥樣硬化性心臟病患者中醫(yī)證型與ABCA1基因R219K多態(tài)性的關(guān)聯(lián)性[J].中國臨床康復(fù)，2006，10(7):7-9.

[5]黃獻平，袁肇凱.冠心病血瘀證凝血因子Ⅶ基因多態(tài)性的檢測分析[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2006，4(2):97-99.

[6]毛以林，袁肇凱.冠心病血瘀證與血管緊張素轉(zhuǎn)換酶基因多態(tài)性的相關(guān)性研究[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2004，24(9):776-780.

[7]徐濟民，蔡沛源.痰濁型冠心病與血脂水平關(guān)系的探討[J].中西醫(yī)結(jié)合雜志，1984，4(5):265-267.

[8]沈禮勇.冠心病痰濁型與血清載脂蛋白、脂蛋白組分的關(guān)系[J].中國醫(yī)藥學(xué)報，1991，6(1):36-38.

[9]歐陽濤，宋劍南，李林，等.冠心病痰瘀證候與載脂蛋白E第一內(nèi)含子增強子基因多態(tài)性關(guān)系的研究[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2005，11(6):414-417.

[10]莫鴻輝.IL-6、ICAM-1、ApoE血清水平及基因多態(tài)性與冠心病證侯關(guān)系研究[D].廣州:廣州中醫(yī)藥大學(xué)，2007.

[11]Pai J K，Mukamal KJ，et al.C-Reactive Protein(CRP)Gene Polymorphisms，CRP Levels，and Risk of Incident Coronary Heart Disease in Two Nested Case-Control Studies[J].PLoS ONE，2008，3(1):e1395.

[12]徐耕，金國棟，傅國勝，等.冠心病患者C反應(yīng)蛋白水平及其1059G/C基因多態(tài)性的研究[J].中華心血管病雜志，2003，31(4):247-277.

[13]姜紅，杜明，饒丹，等.E-選擇素基因A128C多態(tài)性對冠心病的影響[J].中國臨床醫(yī)學(xué)，2006，13(2):161-163.

[14]胡恒亮，程龍獻，蘇方成，等.E-選擇素基因S128R多態(tài)性與吸煙在冠心病發(fā)生中的作用[J].華中科技大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2006，35(1):115-118.

[15]朱會英.冠心病痰瘀證與C-反應(yīng)蛋白、E-選擇素水平及其基因多態(tài)性關(guān)系研究[D].廣州:廣州中醫(yī)藥大學(xué)，2007.

[16]Taubman MR， Rollins RJ， Poon M， et al.J E mRNA accumulates rapidly in aortic injury and in platelet-derived growth factor-stimulated vascular smooth muscle cells[J].Circulation，1992，70:314.

[17]王東生，袁肇凱.冠心病痰瘀辨證與外周血單核細胞PDGF-A mRNA表達的關(guān)系[J].安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2003，22(2):14-16.

[18]沈自尹.2l世紀-中西醫(yī)結(jié)合走向后基因組時代[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2000，20(11):808-810.

[19]王階，楊保林，姜燕.冠心病血瘀證相關(guān)基因研究[J].世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2005，7(1):16-19.

[20]李煒弘，王米渠，王剛，等.冠心病心陽虛證相關(guān)差異表達基因分析[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2004，13(24):3219-3222.