細胞移植治療腦卒中臨床進展

陳琳,黃紅云

近年來,骨髓基質細胞、神經(jīng)干/祖細胞、嗅鞘細胞、神經(jīng)元等已應用于腦卒中臨床治療研究,初步結果令人振奮,本文就這方面的研究進展簡述如下。

1 骨髓基質細胞(MSCs)

1.1 細胞制備、植入途徑及聯(lián)合其他療法 Bang等取5 ml骨髓,用Ficoll密度離心法分離骨髓單個核細胞,1×106/ml接種于底部面積為175 cm2燒瓶,在低葡萄糖Dulbecco modified eagles'培養(yǎng)基中培養(yǎng),其中含10%牛血清、1%青霉素/鏈霉素,孵育在恒濕37℃,5%CO2培養(yǎng)器內。5 d后更換培養(yǎng)液,去除非黏附細胞。黏附細胞在5～7 d內生長形成集落。當原代MSCs達到80%融合后,0.25%胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)。每例患者的標本在23～37(30.8±5.5)d培養(yǎng)擴增到 1×108個細胞(按照體重參照,每只大鼠1×105～3×106)。臨床使用前用胰蛋白酶消化,磷酸緩沖液洗滌,10 ml鹽水重懸,生理鹽水稀釋到50～80 ml,在15～20 min內靜脈輸注。細胞量每次 5×107,發(fā)病后4～5周首次植入,7～9周第2次植入[1]。

鄧志鋒等抽取自體骨髓細胞懸液,在體外經(jīng)過分離培養(yǎng)后,制成骨髓間充質干細胞懸液,通過靜脈輸注方式移植腦內:抽取自體骨髓懸液約80～100 ml,注入含肝素抗凝無菌玻璃瓶中,于無菌超凈臺離心,取自體血漿備用;骨髓細胞沉淀用等量的林格氏液稀釋后加至淋巴細胞分離液上離心分離,吸取中間毛玻璃樣的單核細胞層加至林格氏液離心洗滌3次,加約20 ml備用血漿和80 ml林格氏液稀釋細胞,用吸管輕輕吹打,制成單細胞懸液分離出單個核細胞(可定向分化的干細胞)懸液。用帶4號針頭的注射器抽取細胞懸液,注入無菌輸液袋中,將無菌輸液袋在熱合機下嚴密封口后,送至病房備移植用,同時取少許細胞懸液滴在血培養(yǎng)皿中做無菌實驗。另外預留部分自體骨髓干細胞進行培養(yǎng)擴增,制備成細胞懸液用于再次進行自體骨髓干細胞移植。細胞移植前30 min,給予20%甘露醇125 ml快速靜滴,增加血腦屏障通透性。細胞量為2×107～1.7×108,移植1～2次[2]。

1.2 療效 Bang等進行了一項對培養(yǎng)擴增的自體MSCs治療缺血性卒中患者前瞻性臨床試驗,試驗共納入30例伴有嚴重神經(jīng)功能缺損的大腦中動脈梗死患者,隨機分為2組。MSC治療組(n=5)在發(fā)病1個月之后接受1×108個自體MSCs靜脈輸注;對照組(n=25)不接受MSC治療。盡管MSC的數(shù)量巨大,而且這些細胞經(jīng)過了體外擴增,但并未出現(xiàn)任何急性或遲發(fā)性毒性反應。在發(fā)病后1年內對兩組患者的神經(jīng)功能缺損評分和功能改善方面進行比較,每組對5例患者進行連續(xù)影像學檢查。結果表明,與對照組相比,MSC治療組患者轉歸明顯較好,MSC組患者在隨訪期間的 Barthel指數(shù)(3、6和12個月時)和改良Rankin量表評分(3、6和12個月時)都有明顯改善。M RI檢查表明,MSC組包括梗死周圍區(qū)在內的全腦萎縮明顯減輕,這說明MSC能夠擴散至整個腦組織中。連續(xù)評價表明,MSC治療沒有細胞治療相關的、血清學或影像學上的不良反應[1]。

鄧志鋒等用自體骨髓基質細胞通過靜脈移植治療5例中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后神經(jīng)功能障礙患者(腦卒中患者3例,腦外傷術后患者2例,最早7天,最長6個月)。移植治療后所有患者均未見不良反應。出院0.5年后隨訪,最長隨訪時間達2年。5例患者神經(jīng)功能缺損癥狀較移植前均有很大程度改善,其中2例神志不清患者神志恢復,可按吩咐動作;4例患者肌力提高1～3級;失語癥狀均得到一定改善[2]。

2 神經(jīng)干/祖細胞

2.1 細胞制備、植入途徑及聯(lián)合其他療法 楊清成等收集6～8周流產(chǎn)胚胎,取腦室區(qū)和室下區(qū)細胞,2.5 g/L胰蛋白酶消化,500～800 r/min離心4 min,DMEM-F12∶B27=50∶1加入。細胞懸浮培養(yǎng)(密度5×108)在 bFGF(20 μ g/L)培養(yǎng)基。在 37℃,500 ml/L CO2濃度培養(yǎng)5～6代。每次使用4×106個細胞,采用鞘內注射將細胞懸液注入蛛網(wǎng)膜下腔,通過腦脊液循環(huán)至大腦表面,個別病例通過引流管將細胞懸液注射到腦損傷處[3]。

張儒有等取孕12～14周流產(chǎn)胎兒的腦組織,徹底剝離腦組織表面的軟腦膜和血管,將腦組織剪碎,120目銅網(wǎng)過濾后接種于75 cm 培養(yǎng)瓶,細 胞培養(yǎng)液為 含 30 μ g/L bFGF、20 μ g/L表皮生長因子、1%B27的DM EM/F12(1∶1)。細胞置于37℃、體積分數(shù)為0.05的CO2的培養(yǎng)箱中。體外連續(xù)培養(yǎng)和傳代增殖。移植前將神經(jīng)干細胞誘導成神經(jīng)前體細胞。移植1次/周,共3次,通過腰椎穿刺蛛網(wǎng)膜下腔植入[4]。

盧旺盛等[5]取孕8～10周自然流產(chǎn)的胎兒(原文技術細節(jié)記錄不詳),采用立體定向技術,選取病灶側腦軟化區(qū)作為移植靶點,先在靶區(qū)注入地塞米松3 mg,然后用微量泵將3×107細胞(共0.3 ml)緩慢注入靶點。

2.2 療效 楊清成等報道23例腦卒中患者,病程3個月～30年,以歐洲卒中量表評分標準(European stroke scale,ESS)提高1分以上為有效,結果中,19例有效,4例無效;移植后ESS評分、Barthel指數(shù)均提高[3]。隨后又報道59例患者治療結果,12例患者術后24 h內出現(xiàn)一過性發(fā)熱,體溫37.4℃～38.5℃,給予對癥處理后體溫漸降;6例患者術后感輕微頭痛。24個月后隨訪,患者頭顱CT、MRl、心電圖、肺片及血液生化學指標均未發(fā)現(xiàn)異常;51例有效,8例無效;移植后ESS平均提高(2.7±2.5)分[6]。

張儒有等報道50例患者,末次發(fā)病至接受神經(jīng)干細胞移植時間平均為3.4年,其中基底節(jié)病變39例,腦干病變3例,其他部位(丘腦、大腦半球)8例,累計多部位的病變6例。移植后6個月功能獨立性評分(FIM)顯著高于移植前[4]。

盧旺盛等[5]報道16例腦出血患者采用立體定向技術,選取病變側基底節(jié)區(qū)作為靶點進行神經(jīng)干細胞移植術,于治療前、治療后1個月、6個月進行神經(jīng)功能評分和FIM。結果接受神經(jīng)干細胞移植的腦出血患者無嚴重手術并發(fā)癥。手術后6個月內臨床癥狀改善有效率81.25%(13/16),FIM評分在6個月內持續(xù)升高。

3 嗅鞘細胞

3.1 細胞制備、植入途徑及聯(lián)合其他療法 黃紅云等取3～4個月流產(chǎn)胚胎嗅球,解剖鏡下仔細剝離嗅球表面的軟膜和血管組織,Hanks液沖洗2遍,剪成0.5～1 mm3大小,0.25%胰酶消化15 min,輕輕吹打使之形成細胞懸液;離心去除上清液(1200 r/min,5 min,室溫)。稀釋細胞濃度至106/ml,種植于無包被處理25 cm2培養(yǎng)瓶內,置CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)(37℃)。細胞純化采用Nash差速貼壁法結合阿糖胞苷抑制法,在培養(yǎng)24 h后輕輕吹打將細胞懸液吸出移入另一個無菌培養(yǎng)瓶,按106/ml接種到包被聚賴氨酸的24孔細胞培養(yǎng)板內培養(yǎng)。同時加入阿糖胞苷0.6 μ l/ml,48 h后80%換液。每 3 d換液 1次至14 d。每例定向微創(chuàng)手術移植2×106/100 μ l腦軟化區(qū)周邊或放射冠錐體束走行處(單靶點或2個靶點)[7-8]。

3.2 療效 黃紅云等報道7例患者,病程0.6～14.3年。缺血性卒中4例,出血性卒中3例。病變位于基底節(jié)和大腦半球6例,延髓1例。術后2周ADL評分增高,臨床神經(jīng)功能評分改善。癥狀改善主要包括語言、肢體肌力增加、高肌張力降低、平衡改善、疼痛減輕、呼吸改善。2例獲得2年以上隨訪,1例43歲意大利籍女性,左基底核及額葉腦梗死3年接受細胞治療。術后2年隨訪,患者言語較前流利,可說完整的句子;行走不再需要支具,步態(tài)基本正常;Barthel指數(shù)總分由70分增至90分,其中行走由0分增至15分,上下樓梯由 0分增至5分。另1例87歲中國籍女性患者,因腦梗死致記憶力下降1年,言語障礙、右側肢體運動障礙6個月接受手術,2年隨訪,行走功能、反應能力和言語繼續(xù)改善[9-10]。

4 人神經(jīng)元細胞

Kondziolka等對12例患者伴有運動功能障礙基底節(jié)區(qū)卒中行神經(jīng)元(human neuronal cells,hNT cells)腦內移植,年齡44～75歲,病史6個月～6年(至少功能穩(wěn)定2個月)。隨訪12～18個月,未發(fā)現(xiàn)與細胞移植有關神經(jīng)功能損害,6例患者ESS提高 3～10分,全部患者平均提高2.9分。6個月時,PET掃描有6例患者移植區(qū)糖代謝增加[11]。后他們又報道神經(jīng)元細胞注射到26例患者的基底節(jié)卒中區(qū)或周邊。手術當天早晨,細胞冷凍融化。使用專門設計的細胞植入套管,第1批患者植入2×106或6×106個細胞,通過 3或 9個點植入;第2批患者植入5×106或 1×107個細胞,通過25個點植入。植入時間2 h。除1例由于慢性硬膜下血腫行引流手術外,其他無手術并發(fā)癥。最長隨訪5年,無細胞相關血清學和CT/MRI影像學異常改變,細胞保持活力[12]。還報道了9例腦卒中后2年以上的患者,其中2例為對照。神經(jīng)細胞腦內移植6個月后評估,

4 例認知功能改善[13]。

Meltzer等對12例慢性基底節(jié)梗死并有運動障礙后遺癥的患者在細胞移植前1周、移植后6和12個月行18F-脫氧葡萄糖正電子發(fā)射計算機斷層掃描(FDG-PET)檢查。結果顯示,移植組卒中灶及其周圍糖代謝活性有運動改善相關的提高[14]。Nelson等報道1例腦卒中患者腦內移植畸胎瘤細胞系(hNT)神經(jīng)細胞,27個月后尸檢發(fā)現(xiàn)仍有大量存活細胞(神經(jīng)微絲免疫反應陽性神經(jīng)元),熒光原位雜交檢查顯示無腫瘤形成[15]。

5 其他細胞

Rabinovich等經(jīng)腰穿移植未成熟神經(jīng)系統(tǒng)和血液系統(tǒng)細胞懸液治療10例患者,手術后6個月所有治療患者都有不同程度的神經(jīng)功能改善,與對照組相比有顯著性差異[16]。Savitz等[17]為5例腦卒中患者移植豬胚胎細胞,手術前對細胞進行免疫處理,患者沒有服用免疫抑制劑,手術后1周,1例患者出現(xiàn)癲癇,1例患者出現(xiàn)運動障礙持續(xù)3周,其他患者沒有不良反應;2例患者運動和語言改善,并持續(xù)超過4年。

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