10種中草藥抗氧化活性的比較研究

魏東偉，周亞萍，朱世杰，任園宇，劉 藝

（河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450002）

我國是中草藥的發(fā)源地，也是中藥材生產(chǎn)和使用大國。大部分中草藥來源于天然藥物及其后處理產(chǎn)品，主要由植物的根、莖、葉、果，動物的皮、骨、器官、內(nèi)臟和礦物質(zhì)構(gòu)成。許多學(xué)者認為，大多數(shù)中草藥的功效與自身的抗氧化作用密切相關(guān)，抗氧化活性越強，中草藥相關(guān)功效體現(xiàn)地越為顯著［1］。已有研究表明，中草藥的抗氧化活性與總酚含量密切相關(guān)，總酚含量越高抗氧化活性越強［2-3］。酚類物質(zhì)是植物體內(nèi)存在的一大類次生代謝產(chǎn)物，酚類化合物分子結(jié)構(gòu)中含有多個酚羥基，是非常好的氫或電子供體，在植物體內(nèi)由磷酸戊糖途徑、莽草酸合成途徑和苯基丙酸類合成途徑生成。酚羥基特別是鄰位酚羥基容易被氧化為醌類結(jié)構(gòu)，消耗組織中的氧，阻止或減緩自動氧化鏈式反應(yīng)，從而實現(xiàn)其抗氧化功能［4-6］。

基于此，本研究以市售虎杖、黃芩、夏枯草、女貞子、黃花蒿、續(xù)斷、苦參、白芍、莪術(shù)和姜黃為研究對象，蒸餾水為提取溶劑，比較研究10種中草藥的抗氧化活性。其中，黃芩（唇形科）、虎杖（蓼科）、續(xù)斷（川續(xù)斷科）、白芍（毛茛科）、莪術(shù)（姜科）、姜黃（姜科）、苦參（豆科）均來自于植物的根莖部分；夏枯草來自于唇形科夏枯草的果穗；女貞子采用木犀科植物女貞的果實；黃花蒿則是菊科植物黃花蒿的地上干燥部分。藥典記載，虎杖藥性微寒，具有清熱解毒、散瘀止痛的功效，用于跌打損傷、肺熱咳嗽。黃芩藥性寒，具有清熱燥濕、瀉火解毒功效，用于濕溫、暑濕，肺熱咳嗽。夏枯草藥性寒，能夠清肝瀉火，可用于目赤腫痛、目珠夜痛。女貞子藥性涼，能夠滋補肝腎，明目烏發(fā)，用于肝腎陰虛、眩暈耳鳴、內(nèi)熱消渴。續(xù)斷藥性微溫，能夠補肝腎，強筋骨，多用于肝腎不足、腰膝酸軟。黃花蒿藥性寒，可清虛熱，解暑熱，用于夜熱早涼、陰虛發(fā)熱、暑邪發(fā)熱?？鄥⑺幮院?，能夠清熱燥濕，用于便血黃疸、濕疹、濕瘡。白芍藥性寒，能夠養(yǎng)血調(diào)經(jīng)，平抑肝陽，用于月經(jīng)不調(diào)、頭痛眩暈。莪術(shù)藥性溫，能夠行氣破血，消積止痛，用于淤血經(jīng)閉、食積脹痛。姜黃藥性溫，能夠破血行氣，通經(jīng)止痛，用于胸搏心痛、痛經(jīng)經(jīng)閉、風(fēng)濕肩臂疼痛［7］。由于不同測定方法所依據(jù)的原理不同，為了更準確地測定所選中草藥的抗氧化能力，本試驗采用DPPH自由基清除法、FRAP鐵離子還原法及FC福林酚比色法，測定其水提物清除自由基能力、總的抗氧化能力以及總多酚含量，綜合研究10種中草藥的抗氧化活性，為進一步研究和開發(fā)中草藥等天然抗氧化劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的中草藥為虎杖（Polygonum Cuspidatum Sieb）、 黃芩（Scutellaria baicalensis Georgi）、夏枯草（Prunella vulgarisL）、女貞子（Ligustrum lucidum Ait）、 黃花蒿（Artemisia annua L）、續(xù)斷（Dipsacus asper Wall）、 苦參（Sophora flavescens Ait）、白芍（Paeonia lactif l ora Pall）、莪術(shù)（Curcuma phaeocaulis Val）和姜黃（Curcuma longa），于2017年7月購自張仲景大藥房。經(jīng)65℃烘干，粉碎后過孔徑為0.45 mm分樣篩，置于干燥箱中備用［7］。

試劑：2,2-二苯基-1-古肼基自由基（DPPH）、福林酚（Folin-Ciocalteu）、沒食子酸（C7H6O5）、七水合硫酸亞鐵（FeSO4·7H2O）、無水乙醇（C2H6O）、無水醋酸鈉（CH3COONa）、無水碳酸鈉（Na2CO3）、冰醋酸（CH3COOH）、濃鹽酸（HCl）、三吡啶三吖嗪（TPTZ）、六水合氯化鐵（FeCl3·6H2O）均為分析純級試劑。

1.2 儀器設(shè)備

UV-2550紫外-可見光分光光度計，日本SHIMADZU公司；D-78532臺式高速冷凍離心機，德國HETTICH 公司；電子天平BS124S，賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司；電熱恒溫水浴鍋DKS22，上海精宏實驗儀器設(shè)備有限公司；組織搗碎機MODEL800S，上海凌初環(huán)保儀器有限公司；烘箱HPX-9082 MBE，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 樣品液的制備

精確稱取0.05 g中草藥試樣于10 mL離心管，加8 mL蒸餾水，90℃恒溫加熱15 min，冷卻至室溫后5 000 r/min離心10 min，取上清液至10 mL離心管備用，得濃度6.25 g/L的中草藥提取液。

1.4 抗氧化活性的測定

1.4.1 DPPH自由基清除法 自由基清除反應(yīng)體系：稱取0.00528 g DPPH，加入無水乙醇溶解并定容至100 mL容量瓶，得0.1339 mmol/L DPPH乙醇溶液，4℃保存?zhèn)溆?。移取各中草藥上清?.2 mL于10 mL離心管，分別加入0.1339 mmol/L DPPH乙醇溶液4 mL，混合均勻，于37℃恒溫反應(yīng)20 min，用分光光度計測定其510 nm處的吸光值［8-11］。以4 mL DPPH與0.2 mL去離子水的混合溶液為空白對照，加樣方法見表1。

式中，A0為樣品空白時溶液吸光值；AX為含有樣品提取物時溶液吸光值；A0’為樣品提取物本底吸光值。

表1 DPPH 自由基反應(yīng)體系（mL）

1.4.2 總多酚含量的測定 標準曲線的建立：稱取2 mg沒食子酸，蒸餾水定容至10 mL得0.2 mg/mL沒食子酸溶液，使用時稀釋為20 μg/mL的標準溶液。分別取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL沒食子酸標準溶液于25 mL容量瓶，加入0.413 g/mL福林酚試劑0.4 mL，振蕩混勻后加入0.8 mL 12%碳酸鈉溶液并定容至25 mL，于55℃恒溫反應(yīng)10 min，用分光光度計測定其765 nm處的吸光度。以沒食子酸濃度（μg/mL）為橫坐標，吸光度值為縱坐標，得沒食子酸的標準曲線。

樣品檢測：按照1.3配制方法制備各中草藥水提液，各取1 mL于25 mL容量瓶中，依據(jù)上述標準曲線測定方法測定樣品總多酚含量?？偡雍堪凑諞]食子酸標準曲線換算成沒食子酸當(dāng)量表示。

1.4.3 總抗氧化能力的測定 FRAP工作液的制備：將pH3.6的300 mmol/L NaAC-HAc緩沖液、20 mmol/L FeCl3溶液和10 mmol/L TPTZ鹽酸溶液，按10∶1∶1體積比配制成FRAP工作液，備用。標準曲線的建立：分別取濃度0、0.8、1.6、2.4、3.2、4.0 mmol/L FeSO4各 100 μL，加入到3 mL FRAP工作液的離心管，充分混勻后37℃恒溫反應(yīng)10 min，用分光光度計測定其在593 nm處吸光值，制作標準曲線［12］。

樣品檢測：按照1.3配制方法制備各中草藥水提液，按照上述標準曲線測定方法測定中草藥的FRAP值?？偪寡趸芰Π凑誇eSO4標準曲線換算成FeSO4當(dāng)量（mmol/L）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 DPPH自由基清除能力

DPPH法因其操作簡便、靈敏、穩(wěn)定性好的特點，已被廣泛應(yīng)用于定量測定自由基的清除能力，通常以抑制率IR或半抑制濃度IC50（清除率為50%時所需抗氧化劑的濃度）為衡量指標來表示一種物質(zhì)的抗氧化活性。本實驗采用抑制率來表示，抑制率IR值越大，表明測定對象的抗氧化活性越強，反之，則抗氧化活性較弱［8-10］。

各中草藥試樣自身紫外-可見吸光光譜如圖1所示，200～400 nm處有明顯的吸收峰，說明中草藥水提液含有酚類等次生代謝物質(zhì)［13］。而510 nm后均沒有出現(xiàn)任何吸收峰，說明中草藥水提液自身不會對所選定的DPPH法（510 nm）、FC福林酚法（765 nm）、FRAP法（593 nm）產(chǎn)生干擾。以波長為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制各中草藥試樣的DPPH反應(yīng)體系曲線，由圖2可知，在510 nm處中草藥試樣DPPH反應(yīng)體系具有最大吸收峰，不同試樣峰值越低，自由基清除率越高。

圖1 10種中草藥水提液（0.3 g/L）的紫外-可見吸收光譜

圖2 10中草藥水提液DPPH反應(yīng)體系的紫外-可見吸收光譜

圖3 沒食子酸在FC體系的紫外-可見吸收光譜（A）及相應(yīng)的標準曲線（B）

2.2 總多酚含量

經(jīng)多次試驗得出，當(dāng)福林酚試劑與12%的碳酸鈉溶液體積比為1∶2、反應(yīng)溫度55℃、反應(yīng)時間10 min時，酚類化合物的濃度與吸光度呈現(xiàn)良好的相關(guān)性，線性關(guān)系較好。以波長為橫坐標，沒食子酸溶液吸光度為縱坐標作標準曲線，結(jié)果（圖3）顯示，在765 nm處沒食子酸具有最大吸收峰。線性關(guān)系為Y=0.02223X+0.06775，R=0.99315（n=7），在濃度0～12 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。式中，Y為反應(yīng)液的吸光度，X為沒食子酸標準液濃度（μg/mL）。

2.3 總抗氧化能力FRAP值

FRAP法易于操作、反應(yīng)快速、重復(fù)性好，是目前食品和醫(yī)藥領(lǐng)域測定樣品抗氧化能力的常用方法之一，通常以FRAP值即FeSO4當(dāng)量來表示樣品溶液總抗氧化活性的大小。以波長為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制FeSO4標準曲線如圖4所示，得標準曲線回歸方程：Y=0.0668+0.70875X，R=0.99889（n=5），在0～4 mmol/L范圍內(nèi)與吸光值線性良好。從各中草藥試樣的FRAP反應(yīng)體系紫外-可見吸收光譜（圖5），可知，在593 nm處具有最大吸收峰，試樣峰值越高，抗氧化能力越強。

采用DPPH自由基清除法，F(xiàn)C福林酚法和FRAP法測定10種中草藥水提液的抗氧化活性結(jié)果見表2。從表2可以看出，10種中草藥水提液對DPPH自由基均有一定的清除力，其中虎杖、黃芩、夏枯草、女貞子的自由基清除率均超過70%，抗氧化活性較強；而姜黃、莪術(shù)、白芍、苦參、續(xù)斷、黃花蒿的自由基清除力在50%以下，抗氧化活性相對較弱。10種中草藥的自由基清除力依次為：虎杖＞黃芩＞夏枯草＞女貞子＞黃花蒿＞續(xù)斷＞苦參＞白芍＞莪術(shù)＞姜黃。

圖4 不同濃度FeSO4在FRAP體系的紫外-可見吸收光譜（A）及相應(yīng)標準曲線（B）

FC法檢測結(jié)果通過回歸方程計算可知，虎杖、女貞子、夏枯草、黃芩的沒食子酸當(dāng)量超過2.8 μg/mL，表現(xiàn)出較強的抗氧化能力，說明4種中藥的總多酚含量較高。所選中草藥總多酚含量由高到低依次為：虎杖＞女貞子＞夏枯草＞黃芩＞黃花蒿＞莪術(shù)＞續(xù)斷＞白芍＞姜黃＞苦參。

圖5 10種中草藥FRAP反應(yīng)體系的紫外-可見吸收光譜

FRAP鐵離子還原法檢測結(jié)果顯示，黃芩、夏枯草、女貞子、虎杖的FRAP值都大于1.8 mmol/L，表現(xiàn)出較強的抗氧化能力，其他中草藥的FRAP值均小于1.2 mmol/L，抗氧化能力較弱。10種中草藥總抗氧化能力依次為：黃芩＞夏枯草＞女貞子＞虎杖＞黃花蒿＞續(xù)斷＞莪術(shù)＞白芍＞姜黃＞苦參。

表2 10種中草藥抗氧化活性的測定結(jié)果

2.4 相關(guān)性分析

為進一步了解中草藥水提液抗氧化活性測定方法間的關(guān)聯(lián)，對所選DPPH自由基清除法、FC福林酚比色法與FRAP鐵離子還原法間進行相關(guān)性分析。以FRAP鐵離子還原法與DPPH自由基清除法相關(guān)性分析為例說明：以中草藥水提液的硫酸亞鐵當(dāng)量（X）為自變量，自由基清除率（Y）為因變量進行相關(guān)性分析，得回歸方程的相關(guān)系數(shù)R。同樣的方法可獲得FRAP與FC福林酚比色法、FC與DPPH自由基清除法間的相關(guān)性。

由圖6可知，3種方法間均呈顯著正相關(guān)，其中中草藥水提液的硫酸亞鐵當(dāng)量與DPPH自由基清除率相關(guān)系數(shù)為0.926，與沒食子酸當(dāng)量的相關(guān)系數(shù)為0.688；中草藥水提液的沒食子酸當(dāng)量與DPPH自由基清除能力的相關(guān)系數(shù)為0.822。FC福林酚比色法與FRAP鐵離子還原法、DPPH自由基清除法間的相關(guān)系數(shù)R＞0.688，具有較高的相關(guān)性，說明可以用福林酚比色法粗略地衡量中草藥水提液的總抗氧化能力和自由基清除能力。FRAP法、DPPH法和FC3種方法檢測結(jié)果間均呈顯著正相關(guān)，進一步證實多酚類次生代謝產(chǎn)物是所選中草藥自由基清除能力及抗氧化能力的重要作用因素［14-15］。

圖6 中草藥水提液抗氧化活性DPPH、FRAP與FC法間的相關(guān)性分析

3 結(jié)論與討論

本試驗以常見的10種中草藥為研究對象，水為提取溶劑，比較研究其總抗氧化能力、自由基清除能力及總多酚的含量。結(jié)果顯示，虎杖、黃芩、夏枯草和女貞子的總抗氧化能力FeSO4當(dāng)量均大于1.8 mmol/L，自由基清除率超過70%，總酚量均大于2.8 μg/mL，抗氧化能力相對較強；黃花蒿、續(xù)斷、苦參、白芍、莪術(shù)和姜黃的總抗氧化能力FeSO4當(dāng)量小于1.2 mmol/L，自由基清除率低于50%，總酚含量低于2.3 μg/mL，具有一定的抗氧化能力，但作用較弱。

黃芩、虎杖、夏枯草、女貞在3種方法中均顯示出較強的抗氧化活性，4種中藥均屬藥性寒涼的清熱解毒類中藥，有清熱燥濕兼清熱瀉火等功效，按“熱者寒之”的中醫(yī)治法，主要用于熱證，治療外感或內(nèi)傷的濕熱火毒，可推斷中藥的抗氧化性可能與其清熱功效有關(guān)，與前人關(guān)于清熱解毒類中藥抗氧化活性的研究結(jié)果一致［16］，而發(fā)揮藥性的具體活性成分有待進一步研究，其藥用價值和保健功能值得關(guān)注。

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，F(xiàn)RAP法、DPPH法和FC3種方法測定結(jié)果雖大致相同，但總體抗氧化順序并不完全一致，可能與不同中草藥提取液成分與各種反應(yīng)體系間復(fù)雜的協(xié)同作用有關(guān)［7］。同時，3種方法抗氧化能力結(jié)果間均呈顯著正相關(guān)，可能是由于各種評價方法機理不同導(dǎo)致同一樣品在不同評價體系里可能表現(xiàn)出不同的抗氧化活性，因而在進行抗氧化劑篩選時采用多種方法并進行綜合評價是非常必要的。