Gamma 射線在骨科植入材料消毒滅菌中的應(yīng)用進(jìn)展

丁宇，阮狄克

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Gamma 射線在骨科植入材料消毒滅菌中的應(yīng)用進(jìn)展

丁宇，阮狄克

100048 北京，解放軍海軍總醫(yī)院骨科

近年來，骨科移植材料廣泛應(yīng)用于脊柱四肢骨折或缺損、人工關(guān)節(jié)返修、骨質(zhì)疏松（可注射骨移植材料）乃至運(yùn)動(dòng)傷等方面的治療。移植材料的應(yīng)用避免了與自體組織移植相關(guān)的一系列缺陷，如供區(qū)的疼痛及可能的并發(fā)癥、移植組織質(zhì)量或數(shù)量的不確定性、形狀或大小的限制等。然而，由于檢測手段的局限，異體組織移植仍存在傳播細(xì)菌、病毒或朊病毒致潛在危險(xiǎn)疾病的可能，從而促使人們采取各種措施以盡可能多地殺滅病原微生物[1]。

目前大多采用的滅活病原菌方法均有一定的缺陷，如有機(jī)溶劑/表面活性劑消毒法只對表面病原菌有效，且操作復(fù)雜；熱力消毒法對組織生物學(xué)活性影響較大；環(huán)氧乙烷作為廣譜、高效的氣體消毒劑，對消毒對象的穿透力強(qiáng)，可達(dá)到組織深部，但對組織的毒性作用及致癌性不可忽視。電離輻射是一種良好的冷滅菌方法，在國外已常規(guī)作為體內(nèi)移植物植入前的處理手段，其優(yōu)點(diǎn)為射線穿透力強(qiáng)、殺菌譜廣、作用均勻、基本無害。60Co γ 射線照射是最為常用、便捷的滅菌方法之一，其消毒效果與輻射劑量有關(guān)，輻射劑量越大，滅菌效果越好，但會(huì)影響到組織的生物活性[2]。

1 γ射線照射消毒方法的應(yīng)用及其劑量的選擇

1949 年第一家全方位服務(wù)的組織庫在美國成立，此后各組織庫通過網(wǎng)絡(luò)建立了國際間的交流合作，以滿足迅速發(fā)展的組織器官移植的需要。這些組織庫提供了大量骨科移植材料（如異體肌腱、大塊異體骨及骨碎片等），在重建骨關(guān)節(jié)功能、填充骨缺損方面起到了重要作用。在標(biāo)本采集過程中，雖然對供體有非常嚴(yán)格的篩選制度以及無菌操作措施，異體材料的污染仍不能完全避免。據(jù)統(tǒng)計(jì)，活體供應(yīng)組織的污染率約為 2.7% ~ 22%，而尸體供應(yīng)組織的污染率約為 6.6% ~ 53%[3-4]。目前針對包括異體骨在內(nèi)的醫(yī)療產(chǎn)品的終末消毒，多采用高能量γ 射線照射的方法，可在常溫下對不耐熱物品滅菌，故又稱“冷滅菌”。為提高γ 射線消毒滅菌的安全性及有效性，實(shí)際操作中傾向于減小輻射劑量，同時(shí)注重控制輻射條件，如周圍填充惰性氣體、降低滅菌環(huán)境溫度、冷凍消毒產(chǎn)品、應(yīng)用輻射保護(hù)劑及增敏劑等。

在選擇γ 射線輻射劑量時(shí)，除考慮到移植材料中的細(xì)菌污染機(jī)率外，還應(yīng)包括檢測到的病原微生物數(shù)量、類型以及照射處理的組織等綜合因素。通常認(rèn)為，γ 射線輻射的劑量為國際原子能機(jī)構(gòu)（International Atomic Energy Agency，IAEA）所建議的 25 kGy[4]，但針對該標(biāo)準(zhǔn)劑量一直存在爭論。一些學(xué)者認(rèn)為 25 kGy 的輻射劑量不足以殺滅骨移植物所攜帶的病原微生物，需要 30 kGy 或者更高劑量的射線輻射[5]；而另有證據(jù)顯示超過 20 kGy 的電離輻射會(huì)對骨基質(zhì)蛋白及骨生物力學(xué)強(qiáng)度造成破壞，故而有些組織庫趨于選擇較小的射線輻射劑量（15 ~ 20 kGy）。近來隨著組織采集、保存及運(yùn)輸?shù)拳h(huán)節(jié)的技術(shù)改進(jìn)，移植物被致病微生物污染的可能性大為減小，適當(dāng)降低輻射劑量可在保證消毒滅菌效果（sterility assurance level，SAL）的同時(shí)，最大限度地減少射線對組織的損害。一些學(xué)者參照 ISO 標(biāo)準(zhǔn)對骨科材料的射線消毒劑量做了修訂，并證實(shí)理想的射線消毒劑量可以遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于 25 kGy，而仍可保證 SAL 達(dá)到 10-6級別[2, 4, 6]。

在易污染骨移植材料的微生物中，除非致病菌外，也存在高致病性、強(qiáng)抗輻射性的細(xì)菌。最常見的污染骨組織的細(xì)菌株為葡萄球菌，包括表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、瓦氏葡萄球菌及相關(guān)類似菌株。在培養(yǎng)樣本、股骨頭細(xì)菌培養(yǎng)陽性及自尸體采集的異體骨中，致病葡萄球菌污染機(jī)率分別占 25/55（45%）、19/24（79%）及 12/34（35%）[7]。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌的毒性與它們的抗輻射能力并不是一致的，多數(shù)骨材料的致病菌對γ 射線較為敏感，而非致病性耐輻射奇球菌卻可以耐受 15 kGy 的 γ 射線急性照射而不致死亡或誘導(dǎo)突變。細(xì)菌抗電離輻射的能力通常以 D10值（即殺滅 90% 菌株所需射線的劑量）表示，在 0 和–20 ℃時(shí)，金黃色葡萄球菌 D10值分別為（0.51 ± 0.02）及（0.88 ± 0.05） kGy，而大腸桿菌 D10值分別為（0.39 ± 0.04）及（0.98 ± 0.23）kGy[8]。致病菌中抗輻射能力最強(qiáng)的當(dāng)屬芽孢桿菌，其中短小芽孢桿菌的 D10值為 1.75 kGy，故而常以該類細(xì)菌的殺滅率作為設(shè)定射線輻射劑量的參考指標(biāo)[4]。

人體組織庫發(fā)展的起始階段，主要依靠終末消毒來保證骨科植入材料的安全性，往往忽略了組織采集及處理的整個(gè)過程；繼而，人們認(rèn)識到電離輻射不能作為異體材料滅菌消毒的唯一手段，而應(yīng)考慮到供體的廣泛篩選及處理過程。隨著組織庫網(wǎng)絡(luò)的發(fā)展，實(shí)際供需與材料采集運(yùn)輸?shù)燃夹g(shù)手段進(jìn)一步提高，質(zhì)量控制系統(tǒng)已大為改善，這其中包括供體選擇、組織回收、處理、儲存和運(yùn)輸?shù)戎T多方面，移植材料必須通過每一階段的標(biāo)準(zhǔn)測試才能被下一階段所接受。特別是近年來國際原子能機(jī)構(gòu)及美國食品與藥品管理局頒布了一系列規(guī)章及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，要求組織庫制定各自的操作流程，詳細(xì)說明所有的生產(chǎn)細(xì)節(jié)。對于應(yīng)用特殊輻射劑量的個(gè)案，其安全性事先必須經(jīng)由相關(guān)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。這樣，最終的成品材料也就更為安全有效。如在過去的幾年內(nèi)，羊膜材料上的菌株由 1400 個(gè)菌落單位（cfu）下降到 120 個(gè)，而自 1996年以來骨移植材料上的菌落數(shù)幾乎為零。取材前通過對供體進(jìn)行醫(yī)療及社區(qū)范圍內(nèi)的篩選、HIV 抗體檢測、淋巴結(jié)活檢或尸檢，HIV 病毒污染骨移植物的機(jī)率可以降到0.00006%[9]。IAEA 指出，如果移植物本身檢測菌株數(shù)量小于 1000 個(gè)菌落單位，則用于終末消毒的射線輻射劑量可大大低于 25 kGy[10]。

總之，利用γ 射線對骨科植入材料進(jìn)行終末消毒是普遍應(yīng)用的有效方法，但考慮到醫(yī)用產(chǎn)品的生物學(xué)特性，單純將工業(yè)產(chǎn)品的處理標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用于醫(yī)療產(chǎn)品是不合適的。對于正規(guī)組織庫來說，在認(rèn)可 25 kGy 輻射劑量的安全性及有效性的前提下，多傾向于選擇更低等級的輻射劑量，以 15 ~20 kGy 的電離輻射消毒更為實(shí)用。

2 γ射線照射處理后骨科植入材料的生物學(xué)特性

目前普遍認(rèn)為接受γ 射線照射的骨及軟組織的生物學(xué)特性均具有“劑量依賴性”，即較高劑量的電離輻射會(huì)造成較大的組織生物學(xué)損害，反之亦然。γ 射線照射致組織損害的機(jī)制主要有兩個(gè)方面：在干燥狀態(tài)下，射線可直接損傷組織、造成肽鏈斷裂；另外，射線還可作用于水分子釋放自由基，進(jìn)而引起膠原蛋白的變性[3, 6]。

骨基質(zhì)中的膠原蛋白對于骨的抗壓性是至關(guān)重要的，在骨的加載應(yīng)力區(qū)，完整的膠原纖維可以為骨基質(zhì)提供橋接及強(qiáng)化作用。射線輻射改變了膠原蛋白的結(jié)構(gòu)，從而大大降低了骨的塑形適應(yīng)性能（如骨的強(qiáng)度及韌性）。超顯微結(jié)構(gòu)的研究表明，經(jīng)照射處理的移植骨骨折區(qū)域未發(fā)現(xiàn)膠原纖維的橋接現(xiàn)象，即崩解的膠原纖維無法將加載應(yīng)力傳遞到整個(gè)骨基質(zhì)[6, 11]。在異體骨的處理及消毒過程中，γ 射線照射被認(rèn)為是最具破壞性的因素之一，如冷凍的小牛皮質(zhì)骨（8 cm × 0.5 cm × 0.5 cm 大?。┙?jīng)（30 ± 3）kGy 照射后，其生物力學(xué)強(qiáng)度比對照組下降了 25% ~ 50%；而兔脛骨照射處理后，其最大扭力矩及抗壓強(qiáng)度分別下降了 23% 和 25%[6]。Currey 等[12]報(bào)道 25 kGy γ 射線照射可明顯降低骨強(qiáng)度，雖然 25 ~ 30 kGy 的電離輻射對骨的楊氏彈性模量沒有太大影響，但其塑形適應(yīng)性能會(huì)逐漸降低。雖然骨的硬度沒有明顯改變，但其脆性增加，骨吸收創(chuàng)傷能量的性能會(huì)明顯降低，對抗骨折的能力可降至正常骨的 20% ~ 30%。

目前普遍認(rèn)為異體骨強(qiáng)度與射線照射劑量密切相關(guān)，如當(dāng)射線輻射劑量為 17 kGy（低等級劑量）、29.5 kGy（標(biāo)準(zhǔn)劑量）及 94.7 kGy（高等級劑量）時(shí)，測試骨抗彎強(qiáng)度分別下降了 10%、20% 及 50%，而其對抗骨折強(qiáng)度分別下降了30% ~ 40%、40% ~ 50% 及 90% 以上[12]。Hamer 等[13]分別應(yīng)用 0、6.8、9.5、16、23 及 60 kGy 劑量的γ 射線照射處理異體骨，顯示在 23 kGy 劑量內(nèi)處理的骨強(qiáng)度降低幅度較小，而經(jīng) 60 kGy 照射后，骨強(qiáng)度顯著降低。當(dāng)射線照射劑量在 25 kGy 以下時(shí)，異體骨強(qiáng)度與射線劑量間未證實(shí)存在有明顯相關(guān)性，但與較高劑量的射線輻射成明顯負(fù)相關(guān)。而另一方面，適當(dāng)γ 射線照射處理的異體骨在活體內(nèi)的誘導(dǎo)成骨作用不會(huì)受到太大影響。早期的研究顯示，較高劑量的電離輻射（30 ~ 50 kGy）還可在一定程度上增加脫鈣骨基質(zhì)的誘導(dǎo)成骨活性[14]，但隨后的研究結(jié)果卻大相徑庭。Munting 等[15]發(fā)現(xiàn)經(jīng) 20 ~ 40 kGy 輻射處理后，異體骨的誘導(dǎo)成骨作用明顯減弱，植入骨幾乎全部被吸收而未觀察到新生骨，其骨膠原亦易溶解吸收；Kluger 等[16]發(fā)現(xiàn)經(jīng) 25 kGy 照射處理的脫鈣骨置入活體后，其對骨缺損部位的修復(fù)能力為對照組的 57%；而 Glowacki[17]報(bào)道經(jīng) 20 ~ 40 kGy 照射處理后的脫鈣骨仍可保持 80% 的生物學(xué)活性。

雖然諸多體外實(shí)驗(yàn)表明經(jīng)輻射處理后移植物本身的生物學(xué)性能會(huì)有不同程度的下降，但這并不意味著臨床實(shí)際療效較差。研究顯示經(jīng) 25 kGy γ 射線輻射后，移植骨骨不連發(fā)生率及再骨折率并無明顯增加，其在移植骨材料及脫鈣骨基質(zhì)中的誘導(dǎo)成骨作用均維持在正常水平。Hernigou 等[18]對 127 例經(jīng) 25 kGy 照射的大塊異體骨植入病例進(jìn)行了3 年的隨訪，出現(xiàn)骨折或不愈合等并發(fā)癥的發(fā)生率為 5.5% ~ 6%，接近于未經(jīng)照射處理對照組。與之相反，Lietman 等[19]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)照射處理的異體骨植入后骨折率為38%，是非照射組的 2 倍。因?yàn)樯鲜鰞山M臨床研究的設(shè)定條件有較大差別，除照射本身的因素以外，諸如供受體年齡、疾病及植骨類型、內(nèi)固定技術(shù)、輔助治療手段、術(shù)后負(fù)重時(shí)間等多方面因素都會(huì)影響到臨床療效，故對該類研究的結(jié)果很難作出確切評判。另外，目前股骨遠(yuǎn)近端及脛骨近端應(yīng)用異體骨移植病例趨于增多，在重建髖、膝等大關(guān)節(jié)時(shí)同時(shí)需要皮質(zhì)骨及松質(zhì)骨，其中松質(zhì)骨主要受到壓應(yīng)力的作用，故電離輻射對松質(zhì)骨生物力學(xué)性能的影響也受到人們的關(guān)注。研究表明松質(zhì)骨比皮質(zhì)骨更能對抗電離輻射，可以耐受 10、31 甚至 50 kGy 的γ射線照射而保持其生物力學(xué)強(qiáng)度；但當(dāng)輻射劑量超過 60 kGy 時(shí)，松質(zhì)骨表現(xiàn)為驟然的強(qiáng)度下降，僅為對照組的 23.9%[20]。

Balsly 等[2]將組織冷凍后接受低等級輻射劑量（18.3 ~ 21.8 kGy）或中等級輻射劑量（24.0 ~ 28.5 kGy）的γ 射線照射，顯示骨組織可以耐受兩種劑量的輻射，仍可保持較為理想的機(jī)械強(qiáng)度及彈性模量，而軟組織（髕韌帶、半腱肌、脛前肌、筋膜）可以在低等輻射條件下保持良好的生物力學(xué)特性。針對骨-肌腱-骨復(fù)合體的研究顯示[21]，經(jīng) 20 ~ 30 kGy γ射線照射處理后，其最大拉力強(qiáng)度下降了 11% ~ 27%，而經(jīng) 40、60 及 80 kGy 照射處理后，復(fù)合物強(qiáng)度分別下降了 37%、68% 及 76%。肌腱組織抗拉力強(qiáng)度與射線照射劑量呈現(xiàn)非線性關(guān)系，27、37 kGy 的輻射劑量可致肌腱強(qiáng)度分別下降 20%、65%。Haut 等[22]認(rèn)為如處理異體肌腱的射線輻射劑量為 20 kGy，組織的生物學(xué)性能即發(fā)生改變，尤其易致骨-肌腱結(jié)合部位撕脫；當(dāng)γ射線輻射劑量大于30 kGy，則整個(gè)肌腱組織的生物學(xué)性能會(huì)發(fā)生明顯改變。國內(nèi)孫康等[23]進(jìn)行了 25 kGy γ 射線照射與非照射同種異體骨-髕腱-骨重建前交叉韌帶的臨床前瞻性研究，發(fā)現(xiàn)前者關(guān)節(jié)穩(wěn)定性較差，建議慎用。Goertzen 等[24]研究表明，在低溫冷凍及氬氣體環(huán)境中，肌腱組織可以耐受 25 kGy 的電離輻射，植入動(dòng)物體內(nèi)一年后，移植肌腱仍能保持較為理想的機(jī)械強(qiáng)度及神經(jīng)生物學(xué)特性。但 Fideler 等[25]發(fā)現(xiàn) 20 ~ 25 kGy 的電離輻射并不能有效殺滅肌腱組織內(nèi)的 HIV 病毒，建議選擇 30 ~ 40 kGy 的輻射劑量。在盡量保證組織生物學(xué)完整性的前提下，Grieb 等[3]研究了優(yōu)化處理異體肌腱的可能性，首先使用輻射保護(hù)劑對半腱肌進(jìn)行預(yù)處理，然后在低溫條件下進(jìn)行高劑量（50 kGy）輻射滅菌消毒，結(jié)果顯示肌腱尚能保持較為理想的生物力學(xué)特性，但仍需體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

3 γ射線照射效果的相關(guān)影響因素

γ 射線以其強(qiáng)穿透力有效殺滅細(xì)菌、病毒等病原微生物，但同時(shí)會(huì)對組織造成損害，其程度不但與輻射劑量有關(guān)，還易受周圍環(huán)境的影響。人們目前多采取將標(biāo)本干燥、冷凍或應(yīng)用輻射保護(hù)劑、敏感劑等輔助方法，以盡量減少自由基的產(chǎn)生，維持組織的生物學(xué)性能。

理論上講，干燥或冷凍后組織中水分子的流動(dòng)性降低，射線輻射所產(chǎn)生的氧自由基會(huì)相應(yīng)減少，因而對組織的損傷程度亦會(huì)降低。研究顯示[26]，與室溫條件下相比，–78 ℃環(huán)境中電離輻射對骨組織的損害明顯減輕，表現(xiàn)為骨的脆性下降及較少的膠原成分破壞。相對于室溫環(huán)境，在低溫條件下經(jīng)電離輻射的骨組織基質(zhì)成分的破壞程度減輕，故能保持較理想的誘導(dǎo)成骨作用。然而，針對異體肌腱組織的研究與異體骨并不完全一致[27]，研究顯示γ 射線輻射可致異體肌腱組織中的膠原蛋白含量減少，而其中干燥狀態(tài)比新鮮狀態(tài)下膠原蛋白的破壞更為嚴(yán)重，肌腱組織中羥脯氨酸的測定與其中水分含量并沒有直接相關(guān)性。經(jīng)電離輻射后，冷凍干燥或新鮮冷凍的肌腱組織植入體內(nèi)早期可增加新型膠原的生成，從而促使異體肌腱的重塑，但隨著時(shí)間延長，移植肌腱的機(jī)械強(qiáng)度會(huì)逐漸降低。此外，有人在照射組織周圍充填惰性氣體，以消除空氣中的氧分子電離所產(chǎn)生的氧自由基，亦有利于保持肌腱組織的生物學(xué)性能[24]。

輻射保護(hù)劑的應(yīng)用有利于消除或減輕自由基對組織的損傷，目前較多選擇L-半胱氨酸的衍生物，它們的分子式中均含有–SH 結(jié)構(gòu)，可以用來中和–OH；同時(shí)，作為一種天然氨基酸及人體必需營養(yǎng)素，半胱氨酸具有無毒性、易溶于水、生物相容性好及分子量小、較易穿透組織結(jié)構(gòu)等特點(diǎn)，其衍生物亦多為無毒性或低毒性[28-29]。應(yīng)用輻射保護(hù)劑后，γ 射線照射處理的異體骨在對抗屈曲外力、防止骨折及疲勞損傷等性能方面均有明顯改善，分別為單純照射組的 1.9、3.3 及4.7 倍，但仍未達(dá)到未經(jīng)照射組水平[30]。在應(yīng)用輻射保護(hù)劑組，可以檢測到較多完整的ɑ- 鏈，提示膠原蛋白破壞程度明顯減輕，有利于維持組織的機(jī)械強(qiáng)度。另一方面，輻射保護(hù)劑在保護(hù)組織生物學(xué)活性的同時(shí)，也可能為病毒或細(xì)菌提供了屏障作用，輻射增敏劑卻可在一定程度上提高 γ 射線的消毒滅菌效果。溴化銨是常用的輻射增敏劑之一，水溶性，室溫下穩(wěn)定，可以特異性地綁定病原微生物的 DNA 而增加其對射線的敏感性[29]。但目前對于輻射保護(hù)劑及增敏劑聯(lián)合應(yīng)用的效果尚沒有明確結(jié)論，還需進(jìn)一步研究。

4 展望

γ 射線對骨科植入材料的終末消毒具有安全可靠、簡便易行的特點(diǎn)，已傾向于作為國際通用方法及必需的處理過程。隨著相關(guān)技術(shù)手段的進(jìn)步及操作流程的規(guī)范，移植物質(zhì)量及消毒滅菌效果得到進(jìn)一步提高，所需射線輻射劑量相應(yīng)降低，有效保持了照射組織的生物學(xué)活性。近年來骨科植入材料的種類日趨增加，除常見的骨與肌腱外，γ射線已逐漸或必將用于異體半月板、椎間盤等組織的終末消毒。另外，γ 射線還可用于組織工程支架的改造及塑形，如有助于調(diào)整水凝膠的物理及生物學(xué)性能（機(jī)械強(qiáng)度、孔徑大小、表面形狀、親水性等），但仍需進(jìn)一步優(yōu)化相關(guān)技術(shù)參數(shù)[31]。

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丁宇，Email：cosmos.ding@yahoo.com.cn

2009-12-21

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2010.02.011