單純皰疹病毒性角膜炎的病原學檢測技術(shù)進展

張 穎綜述，吳欣怡審校

(山東大學齊魯醫(yī)院眼科，山東濟南250012)

單純皰疹病毒性角膜炎(herpes simplex keratitis，HSK)主要由 I型單純皰疹病毒(herpes simplex virus，HSV-1)引起，發(fā)病率及致盲率均占角膜病的首位。目前HSK的診斷主要依據(jù)病史、典型癥狀和角膜病變形態(tài)，但該病臨床表現(xiàn)復雜多樣，常不典型，與腺病毒、棘阿米巴原蟲等引起的角膜炎不易鑒別[1-2]，造成誤診或漏診，報道誤診率高達79.3%[3]。因此，HSK病原學診斷成為臨床確診的重要依據(jù)。病毒培養(yǎng)是HSV-1感染診斷的金標準，但費時費力、技術(shù)要求高，難以推廣。本文對目前各種檢測HSV-1的病原學診斷技術(shù)的最新進展綜述如下。

1 環(huán)媒恒溫擴增法(Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)

是一種新式的恒溫核酸擴增方法，由Notomi T[4]于2000年研發(fā)。原理為設計4種引物，特異性識別靶基因上6個不同的序列區(qū)域，利用鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)擴增靶基因(恒溫條件下一小時內(nèi)可擴增靶基因的109倍)，凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。

1.1 LAMP技術(shù)的改進和完善 2001年，Mori Y[5]建立了濁度法-LAMP，改進了檢測擴增產(chǎn)物的方法。該法利用擴增副產(chǎn)物-焦磷酸鎂白色沉淀的濁度判斷靶基因擴增與否，縮短了檢測時間，保證擴增與檢測同步進行，實現(xiàn)了實時檢測監(jiān)控。2004年，Mori Y[6]依據(jù)濁度法-LAMP設計了相應的檢測儀器，可在恒溫下實時檢測多個樣品的濁度變化，實現(xiàn)了對多個LAMP擴增產(chǎn)物的定量分析。2002年Nagamine K[7]發(fā)現(xiàn)，在LAMP反應體系中加入一種環(huán)狀引物(loop primer)可加速反應，使實驗總時間縮短至30 min內(nèi)。2007年，Kaneko H[8]評價了LAMP對臨床樣品中雜質(zhì)的耐受性，認為可直接檢測樣品，無需先提取樣品中DNA。

1.2 LAMP的優(yōu)點 ①條件簡易，對空間及環(huán)境要求較小，無需大型精密儀器和特殊試劑，可適用于各級醫(yī)院及小型診所。②過程簡單：該法不必進行模板熱變性、多個熱溫循環(huán)、繁瑣易污染的電泳、紫外觀察等PCR反應過程。③反應迅速：四個區(qū)域同時環(huán)狀擴增，形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，可在30 min內(nèi)擴增至靶基因的109倍。④操作簡便：雖然原理較復雜，但僅需將檢測樣品和試劑一起放入恒溫環(huán)境中30-60 min，即可肉眼判斷擴增與否，無需專業(yè)人員。⑤特異性高：4個引物特異性識別靶基因上6個不同的區(qū)域，且六個區(qū)域的順序也有規(guī)定，因而特異性高。⑥靈敏度高：模板1-10拷貝即可實現(xiàn)擴增。

1.3 LAMP對HSV-1的檢測效果 Sugiyama H[9]利用 LAMP和“金標準”病毒培養(yǎng)法檢測38例疑似HSV-1感染的生殖器皮損樣品。結(jié)果顯示：與病毒培養(yǎng)相比，LAMP擴增30分鐘、60分鐘的靈敏度分別為90%(9/10)、100%(10/10)，陽性預測值分別為100%(9/9)、100%(10/10)。提示：①LAMP靈敏度較高，可有效的篩檢病人；②陽性預測值高，LAMP結(jié)果陽性時患病的可能性較高。該研究樣本含量較小，不能顯示不同擴增時間下LAMP靈敏度之間的統(tǒng)計學差異，尚需進一步研究確證。

Yoshihiko Enomoto[10]將23例皮膚、口腔粘膜皰疹和生殖器皰疹樣品配對設計為是否提取DNA兩組，評價LAMP對兩組樣品中HSV-1的檢測效果。與檢測速度較快的PCR相比，濁度法LAMP檢測效果與PCR相同，樣品是否提取DNA對其檢測效果無明顯影響。Kaneko H[11]利用60例疑似眼部及生殖器皰疹樣品，評價LAMP、PCR檢測直接樣品的效果。結(jié)果表明，與“金標準”病毒培養(yǎng)相比，LAMP、PCR檢測直接樣品的靈敏度分別為 88%(15/17)、6%(1/17)，前者明顯高于后者(P＜0.001)。以上研究顯示，PCR受臨床樣品中抑制物(文獻報道眼表麻醉劑、熒光素[12])的影響較大；LAMP受臨床樣品中抑制物的影響較小，可直接檢測樣品，無需提取DNA，快速且靈敏。濁度法LAMP進一步省略凝膠電泳檢測過程，速度更快，達到了快速診斷的目的。

2 PCR技術(shù)的改進

2.1 過程的簡化 常規(guī)PCR需首先提取樣品DNA為擴增提供模板，通常認為該步必不可缺，約花費整個PCR檢測時間接免疫熒光法(Indirect Immunofluorescence Assay，IIF)因參加反應的因素較多，受干擾的可能性大等缺點，限制了其在臨床檢驗診斷中的應用。單克隆抗體(Monoclonal antibody，m-Ab)技術(shù)的發(fā)展，產(chǎn)生了敏感性高、特異性強的抗體，減少了與其它物質(zhì)的交叉反應，使試驗結(jié)果可信度增大，更易于菌種的型及亞型、病毒變異株等的鑒別。隨著該技術(shù)的商業(yè)化，出現(xiàn)了許多單抗試劑盒，進一步加快了檢測速度。單克間的一半。Pandori MW[13]用PCR直接檢測57個HSV樣品，發(fā)現(xiàn)無需提取樣品DNA，經(jīng)濟省時一半，敏感性下降2-5倍，但相對病毒分離法仍為一種較實用的方法。需強調(diào)的是，應用PCR直接檢測樣品，要求最大化減少樣品中的潛在抑制物。Pandori MW[13]發(fā)現(xiàn)用擦拭法收集樣品經(jīng)稀釋后置于95℃下10分鐘，通過稀釋組織碎片即可減少潛在抑制物，該條件能充分暴露核酸，提高檢測靈敏度。該研究提示，簡化后的常規(guī)PCR技術(shù)節(jié)省時間，污染小，值得在臨床中推廣。

2.2 實時熒光探針定量PCR 實時熒光探針定量PCR，即在PCR反應體系中加入特異性熒光探針(如TaqMan)和引物。該探針能與靶序列特異性結(jié)合，探針兩端各標記一個熒光報告基團(如FAM)和一個熒光淬滅基團(如TAMRA)。探針完整時，TAMR A淬滅FAM的熒光，致無熒光信號發(fā)出；PCR擴增時，具有外切酶活性的TaqMan酶將探針上的FAM切下，F(xiàn)AM與TAMR A分離，產(chǎn)生的熒光信號可被監(jiān)測。隨擴增循環(huán)的重復，酶切下的FAM數(shù)量增加，實現(xiàn)了熒光信號積累與PCR產(chǎn)物形成的同步進行。Kowalski RP[14]利用該法檢測122個角膜或結(jié)膜樣品中的HSV-1，與病毒培養(yǎng)相比，靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值分別為98%(63/64)、100%(58/58)、100%(58/58)、91%(58/64)，顯示了實時熒光探針PCR技術(shù)在減少誤診和漏診方面有優(yōu)勢。與常規(guī)PCR相比，該法優(yōu)點在于，特異度提高，假陽性率降低，更加快速準確，符合臨床需要，可成為檢測HSV-1的常規(guī)手段。

2.3 多重PCR(multiplex PCR) 是在常規(guī)PCR技術(shù)基礎上改進和發(fā)展起來的一種新型擴增技術(shù)，即在同一PCR反應體系內(nèi)加入兩對或多對特異性引物，一次擴增多個DNA片段，從而實現(xiàn)多種病原體DNA的同時快速鑒定。多重PCR同單引物PCR相比，優(yōu)點在于多對引物同時擴增，擴增結(jié)果的陽性及陰性條帶可互為對照，進一步排除了PCR假陽性、假陰性問題，且比多次單引物PCR擴增所用試劑少、時間短、通過一次擴增反應可得到多方面的信息[15]。皰疹類病毒引起的眼部疾病常具有相似的臨床表現(xiàn)，特別是發(fā)生混合感染，或同時出現(xiàn)多個疑似眼部皰疹病毒感染的患者時，可用該法進行快速診斷，具有臨床實際意義。Zhang Y[16]分別利用多重PCR和單引物PCR檢測33例疑似眼部皰疹病毒感染的患者，兩種方法檢出率相同(57.6%，19/33)，因前者可檢測出同一樣品中的多種病毒，優(yōu)于后者。 Anne J.J??skel?inen[17]將多重PCR與生物芯片技術(shù)相結(jié)合，用于同時檢測腦脊液中的八種皰疹病毒，并設計出新的HSV-PCR引物對和寡核苷酸探針，完善了兩種技術(shù)的結(jié)合，提高了檢測的敏感性和可靠性。

3 單克隆抗體引導的間接免疫熒光法

隆抗體引導的IIF法，克服了IIF的許多不足，目前得到了廣泛的應用。劉軍連[18]采用HSV型共同性單克隆抗體為夾心的IIF方法，檢測120例生殖器皰疹樣品中的HSV，并與病毒培養(yǎng)法進行比較，結(jié)果顯示：IIF法的靈敏度為96.5%(82/85)，特異性為40.0%(14/35)。IIF法較病毒培養(yǎng)法更適用于病程較長的病例，陽性檢出率為83.3%(75/90)，高于病毒培養(yǎng)法的陽性檢出率64.4%(58/90，P＜0.01)。作者推斷可能原因為：病程較長時，有活力的病毒明顯減少甚至消失，但HSV抗原仍存在且能被IIF法檢出，所以IIF法優(yōu)于病毒培養(yǎng)法。Pereira SR[19]分別應用FITC-mAb法、病毒培養(yǎng)法檢測感染鼠(BALB/c小鼠)角膜中的HSV抗原，兩種方法24小時靈敏度分別為100%(20/20)、45%(9/20)。FITC-mAb法靈敏度明顯高于病毒培養(yǎng)法(P＜0.001)。Pereira SR認為單克隆抗體引導的IIF法聯(lián)合角膜印跡取材法，可直接應用于患者，作為病毒培養(yǎng)確診前的篩檢實驗。單克隆抗體引導的IIF法具有較高的診斷價值，但特異性較低，今后仍需更多臨床實驗綜合評價該法，確定該法應用于診斷HSK的臨床實用價值。

4 IELIS法

新的HSV-1抗體的出現(xiàn)促使了IELIS技術(shù)檢測HSV-1的新進展。Idandi K[20]合成了包括全長gG蛋白的pTrc His2A-gG1質(zhì)粒，并利用該質(zhì)粒獲得了新的HSV-1抗體，聯(lián)合IELIS法研制出新的型特異性HSV-1診斷試劑盒，靈敏度為100%，特異度為89.5%。

5 小結(jié)

早期診斷治療HSK可降低復發(fā)率，診斷延誤有可能造成不可逆轉(zhuǎn)的視力損害，因而臨床醫(yī)生應選擇快速靈敏的檢測方法。目前研究表明，LAMP法、實時熒光探針PCR法能夠較快速有效的篩檢病人且可信性相對較高，值得普及推廣；單克隆抗體引導的IIF法靈敏度較高，但特異性較低，可用作疑似病人進行病毒培養(yǎng)確診前的篩檢實驗。目前存在的問題是，尚缺少對各種方法的靈敏度、特異度、陽性和陰性預測值等綜合性評價，以便為眼科臨床工作者在HSK的診斷和治療中提供決策證據(jù)。

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