根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)煙曲霉遺傳轉(zhuǎn)化的研究

張艷華,賀 丹,王 麗*

(1.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院,吉林 長春 130021;2.吉林大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院,吉林 長春 130062）

煙曲霉(Aspergillus fumigatus）是自然界普遍存在的絲狀真菌,也是重要的條件致病菌。近年來,隨著抗生素、抗腫瘤藥物、糖皮質(zhì)激素的廣泛應(yīng)用,器官、骨髓移植、介入治療等新型診治技術(shù)的開展,及惡性血液病和艾滋病等免疫受損人群的擴(kuò)大,由煙曲霉引起的系統(tǒng)性感染,即侵襲性曲霉病(invasive aspergillosis,IA）發(fā)病率不斷升高,僅次于假絲酵母(Candida）引起的感染,病死率達(dá)60%-100%,成為白血病和骨髓移植等重癥免疫受損患者死亡的主要原因[1,2]。

人們對煙曲霉的生物學(xué)特性,包括生長率、耐熱性、有性階段、代謝產(chǎn)物、致病性、耐藥性等還沒有深入了解。1998年英國曼徹斯特大學(xué)Dr.David Denning協(xié)調(diào)多國科學(xué)家,以臨床分離煙曲霉菌株Af293為對象,啟動了煙曲霉基因組測序項目,已于2005年完成[3],為研究煙曲霉生物學(xué)特征,探討致病、耐藥機(jī)制及尋找藥物靶標(biāo)提供了條件。

1 煙曲霉基因組概述

煙曲霉基因組序列信息表明,Af293包括8條大小從1.8-4.9Mb的染色體,共29.4 MB,G+C含量49.9%。預(yù)測有9926個基因編碼蛋白質(zhì),基因的平均長度為1 431 bp,大約有三分之一基因的功能是未知的。與構(gòu)巢曲霉和米曲霉基因組相比較,發(fā)現(xiàn)約500個煙曲霉獨(dú)特基因。另外發(fā)現(xiàn),煙曲霉含有一個用于異宗配合的完整補(bǔ)體,一個與酵母完全不同的細(xì)胞壁組裝過程,至少有28個基因簇編碼的蛋白質(zhì)參與次級代謝和產(chǎn)生毒素,至少有168個藥物、毒素和大分子的外排泵[4]。

雖然通過計算機(jī)分析對基因功能在理論上進(jìn)行了推測,但仍有大量未知功能基因需要確定。目前,結(jié)合全基因組序列信息,利用從位點到表型的反向遺傳學(xué)策略,構(gòu)建覆蓋全基因組的突變體庫,已廣泛用于功能基因組學(xué)研究。

2 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的真菌遺傳轉(zhuǎn)化

近年來發(fā)展的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化(Agrobacterium tumefaciens Mediated Transformation,ATMT）技術(shù),是獲得突變體的有利工具。根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens）是一種革蘭氏陰性土壤桿菌,含有腫瘤誘導(dǎo)(Tumor Inducing,Ti）質(zhì)粒。Ti質(zhì)粒上包括轉(zhuǎn)移DNA(T-DNA）區(qū)、毒性區(qū)(Vir區(qū)）以及冠癭堿代謝基因編碼區(qū)。T-DNA兩端是兩個長25 bp的同向重復(fù)序列,分別稱為左邊界(LB）和右邊界(RB）。當(dāng)植物受到傷害時,Ti質(zhì)粒在Vir基因和其它蛋白質(zhì)的協(xié)助下,將TDNA插入到植物染色體中。為使Ti質(zhì)粒適于生物技術(shù)的需要,現(xiàn)已對Ti質(zhì)粒進(jìn)行了改造,發(fā)展了雙元載體系統(tǒng),即由兩個分別含有T-DNA和Vir區(qū)的相容性質(zhì)粒組成[5]。目前,根癌農(nóng)桿菌已成功用于植物細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)化。

1995年Bundock等人[6]利用ATMT技術(shù)轉(zhuǎn)化釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae）,開創(chuàng)了農(nóng)桿菌介導(dǎo)真菌遺傳轉(zhuǎn)化的先河。隨后,該技術(shù)也被用于其它絲狀真菌的轉(zhuǎn)化,如粗糙脈孢霉(Neurospora crassa）、瑞氏木霉(Trichodema Reesei）、稻瘟病菌(Magnaporthe grisea）、尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysprum）、鐮形刺盤孢霉(Colletotrichum falcatum）、巴克斯霉(Backusella lamprospora）,等[7-10]。這些開創(chuàng)性的工作為絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化開辟了一條全新而有效的途徑。隨著ATMT技術(shù)的逐漸成熟,該方法也已用于黑曲霉(Aspergillus niger）,泡盛曲霉(Aspergillus awamori）和巨大曲霉(Aspergillus giganteus）等曲霉遺傳轉(zhuǎn)化的研究[11,12]。

ATMT豐富了絲狀真菌的轉(zhuǎn)化技術(shù),與傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)化方法(如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化法、電轉(zhuǎn)化法、PEG法等）相比,具有很多優(yōu)點[11,12,13]:(1）轉(zhuǎn)化受體類型多:傳統(tǒng)真菌轉(zhuǎn)化方法,如電轉(zhuǎn)化法,需制備原生質(zhì)體,不同真菌原生質(zhì)體制備方法差異很大。而ATMT轉(zhuǎn)化的受體材料類型多,既可用原生質(zhì)體、也可用萌發(fā)的孢子、分生孢子、菌絲體,甚至是真菌的子實體均可;(2）轉(zhuǎn)化效率高:對大多數(shù)絲狀真菌而言,ATMT法比其他轉(zhuǎn)化方法的效率高得多。利用ATMT轉(zhuǎn)化泡盛曲霉(A.awamori）的效率比PEG法高600倍,球毛殼菌(Chaetomium globosum）和哈茨木霉(Trichoderma harzianum）進(jìn)行轉(zhuǎn)化也得到了類似的結(jié)果;(3）單拷貝的T-DNA插入:實驗表明,80%的F.oxysporum的ATMT轉(zhuǎn)化子、60%的M.grisea的ATMT轉(zhuǎn)化子都是單拷貝插入,便于對突變體進(jìn)行遺傳分析;(4）轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定:ATMT轉(zhuǎn)化米根霉(Rhizopus oryzae）所獲得的轉(zhuǎn)化子,其有絲分裂的穩(wěn)定性是100%,而利用PEG法獲得的轉(zhuǎn)化子,其有絲分裂只有0.01-0.5%是穩(wěn)定的;(5）方法簡便:不需復(fù)雜的設(shè)備儀器,采用質(zhì)粒拯救(plasmid resuce）或TAIL-PCR即可克隆出T-DNA所標(biāo)簽的序列。

基于上述優(yōu)點,使ATMT方法在絲狀真菌轉(zhuǎn)化中得到越來越廣泛的應(yīng)用。一方面,構(gòu)建目標(biāo)基因的敲除載體,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化,T-DNA以同源重組的方式整合到宿主基因組,成為基因敲除或替換的有效手段;另一方面,當(dāng)根癌農(nóng)桿菌T-DNA中不存在與受體菌染色體同源序列時,TDNA隨機(jī)插入到宿主染色體基因組中,獲得插入突變,利用T-DNA標(biāo)簽快速分離標(biāo)記的基因,在絲狀真菌功能基因研究中非常有用。

目前,該技術(shù)已用于稻瘟病菌、木霉、鐮刀菌等多種重要絲狀真菌的T-DNA插入突變體庫的構(gòu)建,并克隆了一些與致病、生長相關(guān)的基因[8,9,14]。

3 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙曲霉遺傳轉(zhuǎn)化

在煙曲霉基因組序列完成之際,該技術(shù)成為煙曲霉功能基因組研究的重要手段。在隨機(jī)插入突變方面,Janyce等[15]將煙曲霉分生孢子(1×107個/ml）和攜帶有潮霉素抗性質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌(OD600=0.6）按一定比例混合,24℃誘導(dǎo)培養(yǎng)48小時,然后轉(zhuǎn)移至篩選培養(yǎng)基,篩選轉(zhuǎn)化子,其轉(zhuǎn)化效率可達(dá)100個轉(zhuǎn)化子/107個孢子。獲得的轉(zhuǎn)化子大多數(shù)以單拷貝T-DNA的形式隨機(jī)整合,且轉(zhuǎn)化子后代有絲分裂性狀穩(wěn)定。

在基因定向整合方面,Janyce等[15]利用雙元載體pDHt/sk,以煙曲霉alb1為靶基因(alb1基因編碼聚酮合成酶,該基因缺失將導(dǎo)致煙曲霉產(chǎn)生白化的分生孢子）,構(gòu)建了含有潮霉素抗性的alb1基因敲除載體,并導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105中。將農(nóng)桿菌EHA105與煙曲霉B-5233分生孢子共培養(yǎng),獲得大量轉(zhuǎn)化子。其中66%轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生白化的分生孢子,34%轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生藍(lán)綠分生孢子,遺傳轉(zhuǎn)化效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于原生質(zhì)體法。

李若瑜等[16]以 pyrG為篩選標(biāo)記,利用雙元載體pDHt/sk構(gòu)建煙曲霉fap1和sho1基因的打靶載體,利用根癌農(nóng)桿菌與煙曲霉分生孢子共培養(yǎng),篩選轉(zhuǎn)化子,fap1基因、sho1基因同源重組率分別為44%和35%。

4 結(jié)束語

在未來一段時期,真菌感染的發(fā)生仍然會呈上升趨勢,開展高危人群真菌感染的前瞻性研究,尤其是病原真菌的基因組學(xué)和蛋白組學(xué)研究,分析危險因素,闡明其生物學(xué)特性,發(fā)掘致病基因和耐藥基因,開發(fā)強(qiáng)有力的抗真菌藥物,將對真菌感染的防治發(fā)揮重要作用。

上述研究表明,ATMT技術(shù)是煙曲霉隨機(jī)插入突變和基因定向整合的有力工具。由此,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA插入突變,快速構(gòu)建覆蓋煙曲霉基因組的突變體庫,結(jié)合全基因組序列信息,是進(jìn)行煙曲霉功能基因組學(xué)研究的有效方法。隨著越來越多的絲狀真菌全基因組序列分析完成,ATMT必將成為絲狀真菌遺傳的有效手段,特別是在病原真菌的基因克隆和功能鑒定方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

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