光學成像在腫瘤骨轉移實驗研究中的應用進展

王江濤，王捷

綜述

光學成像在腫瘤骨轉移實驗研究中的應用進展

王江濤，王捷

骨腫瘤；腫瘤轉移；體層攝影術，光學

目前對腫瘤骨轉移的影像學評估主要依靠SPECT、PET、X線和微CT等顯像技術，這些影像模式在空間分辨率、敏感性及信號定量方面都有自己的優(yōu)勢。然而，在腫瘤骨轉移過程中，不僅有骨組織結構的改變，還有血管再生、腫瘤間質的相互作用、宿主免疫反應等病理生理變化。近十幾年來，隨著光學成像探針及成像模式的不斷發(fā)展，光學成像技術已成為腫瘤臨床前實驗研究必不可少的一種分子影像評估手段，它能夠對腫瘤的生長、轉移、基因表達、血管再生、細菌感染、局部酶活性等進行實時檢測及定量分析[1-3]，從而為腫瘤骨轉移提供功能性信息，現(xiàn)綜述如下。

1 全身光學成像——技術和設備

所有的光學成像都是基于對活細胞組織或者動物發(fā)出的光子進行檢測?；铙w動物體內光學成像主要采用生物發(fā)光（bioluminescence imaging，BLI)和熒光發(fā)光（fluorescence imaging，F(xiàn)LI）兩種技術。二者在靈敏度、信噪比、組織來源的背景等方面各不相同。檢測時選用BLI還是FLI主要取決于細胞標記物；此外，BLI成像技術可以檢測細胞的新陳代謝，而FLI成像技術則可觀察體內外所有的組織細胞。

1.1 BLI成像技術

BLI成像具有背景低、信噪比高、無創(chuàng)、檢測時間短、可同時檢測多個動物的優(yōu)點，因此非常適合生命科學領域的實驗研究。

BLI成像中最常使用的熒光素酶是從螢火蟲中提取的。螢火蟲發(fā)光細胞中含有熒光素和熒光素酶兩種發(fā)光物質，它們與ATP、氧發(fā)生反應，在氧與熒光素結合時發(fā)生電子轉移，引起能量變化，釋放熒光光子而發(fā)光。由于需要活性氧的參與，因此只有在活細胞內才會出現(xiàn)熒光，光的強度與標記細胞的數(shù)目呈線性相關；發(fā)射光譜較寬，峰值在560 nm附近。其他可用的熒光素酶是從珊瑚、水母、紅色或綠色的叩頭蟲以及一些細菌物種中克隆出來的。這些綠色或紅色的熒光素酶被氧化后發(fā)射出綠光（544 nm）或紅光（611 nm）[4]。有學者最近在對螢火蟲和叩頭蟲提取的熒光素進行研究的基礎上制備出耐熱的熒光素酶，并證實其可分辨體內和體外的綠色和紅色熒光信號[5-6]。來自珊瑚蟲、海洋叩頭蟲的熒光素酶同腔腸素反應（不依賴ATP）可發(fā)出藍光，發(fā)射光最大峰值480 nm。盡管這些酶發(fā)射光波長較短，分布局限，腔腸素在小動物體內流動較快，但已有研究證實其在體內分子診斷方面非常有效[7]。

使用熒光素酶作為體內成像的工具，特別是對動物組織的深部進行成像時，組織穿透性、光散射及組織自發(fā)熒光都是影響成像的重要因素。波長越長則自發(fā)熒光就越低；同綠光相比，近紅外光幾乎不引起自發(fā)熒光；而且光滲透性、組織吸收及散光等現(xiàn)象都會減弱[8]。需要強調的是，由于細胞株不同，不管是表達螢火蟲熒光素酶還是Gaussia熒光素酶，它們都不會與所對應的底物熒光素和腔腸素發(fā)生交叉反應，因此可以利用這一屬性對所有荷瘤動物進行全血微量生化分析[9]。

1.2 FLI成像技術

FLI成像費用低廉、操作簡單，熒光信號遠強于BLI，而信噪比卻遠低于BLI。

與BLI不同，F(xiàn)LI不需要底物的參與，但需要外部激發(fā)光源，且自身熒光的強度隨著目標深度的增加呈指數(shù)級的遞減。FLI有多種發(fā)光方式，既可將熒光報告基團（GFP、RFP，Cyt及dyes等）或其突變體基因整合到細胞染色體上以表達熒光蛋白，在激發(fā)光源的作用下發(fā)光；也可利用一些熒光基團標記特定的物質，注入小動物體內而發(fā)光[10]。

活體FLI成像技術有3種標記方法：（1）熒光蛋白標記：適用于標記腫瘤細胞、病毒、基因等，通常使用的是GFP、EGFP、RFP（DsRed）等。目前已研發(fā)出發(fā)射光譜可達649 nm的熒光蛋白，具有背景低、組織穿透力高的特性，如從突變的蔬菜和奶嘴?？刑崛〉募t移蛋白[11]；而最新從哺乳動物體內提取的熒光蛋白——基于細菌的光敏色素，其激發(fā)光波長可達700 nm[12]。（2）熒光染料標記：與體外標記方法相同，常用的有Cy3、Cy5、Cy5.5及Cy7，可以標記抗體、多肽、小分子藥物等。（3）量子點標記：作為一種新的標記方法，量子點標記具有熒光發(fā)光光譜窄、量子產率高、不易漂移、激發(fā)光譜寬、顏色可調、光化學穩(wěn)定性高以及不易分解等諸多優(yōu)點。量子點是一種能發(fā)射熒光的半導體納米微晶體，尺寸在100 nm以下，外觀恰似一極小的點狀物，可經受反復多次激發(fā)，而不像有機熒光染料那樣易發(fā)生熒光淬滅。其發(fā)射光強度是有機熒光染料的20倍，穩(wěn)定性較有機熒光染料強100倍以上。已有研究證實，量子點成像的深度遠遠超過標準的熒光素，如果能與抗體結合配對，則可作為跟蹤組織細胞的探針或用以探測低濃度的抗體。而如能解決不同材料的量子點偶聯(lián)、功能化標記問題，就可以用量子點代替很多熒光染料分子[13-14]。

1.3 成像設備

小動物全身光學成像系統(tǒng)近幾年得到快速發(fā)展，但大多數(shù)BLI系統(tǒng)只能進行半定量檢測，空間分辨率也不高。最近研發(fā)的BLI斷層成像系統(tǒng)通過提高空間分辨率來實現(xiàn)三維成像，同時還能提供定量信息[15]，此外，3D BLI和3D FLI數(shù)據(jù)的采集及后續(xù)重建還可獲得解剖學、功能信息及分子信息。Nahrendorf等[16]將PET、微CT和3D生物發(fā)光組合，可同時檢測骨骼結構以及腫瘤的整合蛋白、組蛋白酶活性和巨噬細胞含量。而通過光譜分離技術建立的新型熒光發(fā)光系統(tǒng)則可捕獲每個圖像的光譜信息，去除背景熒光后還能區(qū)分多種熒光標記，反映同一張圖片不同的光譜信息[17]。

2 腫瘤骨轉移的光學成像檢查

在腫瘤骨轉移的過程中，腫瘤和周圍微環(huán)境的互相作用介導原發(fā)灶血管生成及自身免疫系統(tǒng)激活，從而獲得免疫抑制以利于腫瘤的生長；此外，骨轉移灶通常是破骨細胞和成骨細胞失衡之處，使腫瘤細胞易于在此生長。而光學成像系統(tǒng)的特點使其可以對骨骼、腫瘤、腫瘤和間質的反應、血管生成及生成前信號通路等的變化進行光學成像以實現(xiàn)對腫瘤骨轉移的評估和檢測[18-19]。以往腫瘤光學成像技術發(fā)展中遇到的問題是腫瘤細胞通常沒有特異的光學物質使之與正常組織區(qū)分開來，但近年來照相檢測系統(tǒng)的發(fā)展使全身光學成像技術同樣可以用于細胞株或轉基因動物模型的研究；同時，隨著熒光分子斷層成像（fluorescence molecular tomography，F(xiàn)MT）、3D FLI及3D BLI信息采集技術的發(fā)展，不僅可以針對腫瘤骨轉移病人收集3D光學數(shù)據(jù)，還可結合其他影像學工具（如微CT，PET，SPECT，MRI）進行后處理，從而使光學成像成為一種新型的腫瘤骨轉移成像平臺。

2.1 骨組織光學成像用特異性探針

目前有很多商品化的骨組織檢測特異探針，如VisEn公司研發(fā)的OsteoSense和LI-COR公司研發(fā)的BoneTag，其中OsteoSense-680的激發(fā)光波長為680 nm，發(fā)射光為700 nm；OsteoSense-750的激發(fā)光波長為 750 nm，發(fā)射光為 780 nm；BoneTag-680的激發(fā)光波長為680 nm，發(fā)射光為705 nm；BoneTag-800的激發(fā)光波長為774 nm，發(fā)射光為789 nm。探針可與骨基質結合數(shù)天或數(shù)周，沒有結合的探針將被洗脫，從而顯示激活區(qū)域特異的發(fā)射熒光信號動態(tài)。需要注意的是，由于探針的半衰期較長，結合到骨基質上將限制重復測量的結果。Kozloff等[20]注射不同濃度的OsteoSense-750以驗證其在體內吸收的線性關系，結果顯示，當注射劑量達到100 nmol/kg時，股骨遠端的平均熒光強度呈線性關系。

用于體內腫瘤細胞標記和檢測的靶向熒光探針主要有EGF-800CW和2DG-800CW，這兩種探針都可用于轉移到骨或其他組織的腫瘤的影像學檢測。EGF-800CW包含重組表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF），可連接到近紅外的熒光燃料IRDye?800CW上；2DG-800CW與2-脫氧葡萄糖結合，為細胞的葡萄糖轉運蛋白-1所識別。靶向熒光探針識別后既不參與細胞代謝也不穿過細胞膜，只是在細胞膜上與表達EGF受體的細胞選擇性結合，而EGF受體在很多不同類型的腫瘤細胞上呈過表達。此類探針的應用無需表達報告基因[21-22]。

2.2 骨腫瘤光學檢測的動物模型

骨組織是很多腫瘤（特別是乳腺癌和前列腺癌）的常見轉移部位。X線檢查可間接觀察骨轉移的溶骨和成骨現(xiàn)象，但無法進行微小轉移灶的檢測，因此需要更加靈敏的方法。Wetterwald等[23]對裸鼠心臟注射轉染熒光素酶基因的乳腺癌細胞MDA-MB-231，制備乳腺癌轉移模型，光學成像系統(tǒng)檢測發(fā)現(xiàn)，注射細胞3 min后癌細胞擴散至全身各個部位；15 min后癌細胞在特定的組織器官如肺、腦、長骨等部位大量聚集；24 h后未檢測到任何細胞，表明大部分注射的細胞已死亡；20 d后可在裸鼠長骨的骨髓中觀察到0.5 mm3的微小轉移灶，較X線影像檢查提前2周發(fā)現(xiàn)骨轉移。脛骨內注射腫瘤細胞是制備骨髓腔內腫瘤生長模型的最直接方法，可迅速了解腫瘤細胞在骨組織內侵襲生長的情況。在脛骨內注射帶有熒光標記的乳腺癌細胞MDA-MB231后1周即可通過BLI技術檢測到腫瘤細胞的生長情況，結合使用微CT進行3D重建可以清晰顯示脛骨的溶骨性病變，而放射影像檢測在2周后才發(fā)現(xiàn)轉移灶[24]。由此可見，光學成像系統(tǒng)可以較為快速、清楚地觀測到穩(wěn)定表達熒光素的腫瘤細胞在轉移部位的生長、侵襲及遠處的轉移。除移植轉染熒光酶基因的腫瘤細胞外，有學者建立帶有熒光素酶基因的自發(fā)腫瘤的轉基因動物模型，而隨著自發(fā)腫瘤的發(fā)展，腫瘤組織所表達的熒光素酶也隨之增加[25]。

3 骨轉移過程中相關因子的光學檢測

基質降解、滲透、血管生成在腫瘤的進展和轉移中起著關鍵作用，阻斷其中任一環(huán)節(jié)都能有效預防腫瘤的發(fā)生和轉移。而光學成像的最大優(yōu)勢即是對這些環(huán)節(jié)進行實時可視化檢測，因此在腫瘤骨轉移的臨床前研究中應用光學成像技術對了解腫瘤骨轉移作用機制、尋找預防腫瘤骨轉移方法等都具有非常重要的意義。

3.1 生物因子檢測

轉化生長因子（transforming growth factor，TGF）在腫瘤發(fā)展和轉移中發(fā)揮重要作用。在骨轉移過程中，TGF-β是激活腫瘤細胞表達溶骨因子的一個信號因子，可導致骨溶解的惡性循環(huán)[26]。通過使用表達熒光的細胞株來實時檢測TGF-β變化，并將PET、微CT與BLI、FLI技術相結合，可以對干擾TGF-β信號通路的新型治療方法進行有效評估[27]。

血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是調節(jié)血管生成的重要因子，而腫瘤血管生成是促進腫瘤轉移的重要外部因素。為實時檢測VEGF2在體內的表達，Zhang等[28]對標記熒光素酶的VEGFR2轉基因小鼠的研究結果顯示，熒光素與VEGFR2的表達水平呈正相關；Backer等[29]使用含有N末端半胱氨酸標簽的單鏈VEGF（scVEGF），可用于結合不同的特定位點；另有研究證實，基于scVEGF的家族可與腫瘤血管的VEGF受體結合，標記近紅外光染料Cy5.5的scVEGF可用于腫瘤脈管系統(tǒng)VEGF的光學成像[30]。

αvβ3整合素家族在新生腫瘤脈管系統(tǒng)的內皮細胞、破骨細胞和一些腫瘤細胞內呈高水平表達，而包含精氨酸-甘氨酸-天冬氨的酸（RGD）序列的玻璃黏連蛋白可選擇性結合到αvβ3和αvβ5的受體上，因此標記熒光的RGD探針可以檢測αvβ3的表達水平，將其用于腫瘤、腫瘤脈管系統(tǒng)及破骨細胞的研究則可檢測到腫瘤的骨轉移[31]。商業(yè)化的近紅外熒光探針I(yè)ntegriSense可高度特異性地結合到陽性內皮細胞和腫瘤細胞αvβ3的表面[32]。

3.2 局部酶活性檢測

測定局部酶活性是觀察基質降解和局部炎癥的另一種方法。ProSense是一種酶激活的熒光試劑，是包含多聚賴氨酸骨架、聚乙二醇和一些熒光團的大分子，熒光團上大分子之間的距離可使熒光信號淬滅。熒光團經酶消化后釋放，釋放的熒光團不被淬滅，可由活體成像系統(tǒng)檢測到。ProSence通常被組蛋白酶激活，而激活的破骨細胞表達組蛋白酶K，導致骨基質的降解。組蛋白酶K在溶骨性病變中呈高表達，Kozloff等[33]運用cy5.5標記組織蛋白酶K，實驗證實組蛋白酶的高表達加速骨溶解進程。基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）活性與腫瘤細胞的侵襲、遷移轉移、炎癥以及宿主反應密切相關。通過VisEn的專有熒光成像探針平臺開發(fā)的MMP Sense（TM）探針即是一種能夠反映腫瘤和活體中其他炎癥部位MMP活性的活體分子探針[34]。

4 展望

小動物的光學成像在檢測腫瘤骨轉移的發(fā)生發(fā)展過程及藥物干預療效方面是非常實用有效的手段之一，可以進行體內實時、無創(chuàng)的可視化檢測。其最終目的是將活體光學成像技術的應用范圍從臨床前實驗研究拓展到臨床檢測研究，從而提高腫瘤骨轉移診斷的特異性和敏感性，并進一步為其個體化治療及預防提供指導。光學成像技術與傳統(tǒng)影像學工具如X線、CT、SPECT、MRI以及病理學研究相結合，可以從結構、功能、分子及解剖水平全面評估腫瘤骨轉移的發(fā)生、發(fā)展、治療效果以及轉移灶骨骼、血管、腫瘤大小及分子的功能狀況。但目前光學成像還面臨一些關鍵技術問題需要解決，包括研發(fā)特異性光學探針、建立特異性轉基因動物模型以及開發(fā)研制更為靈敏的檢測設備等。

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R738，R445.9

A

1674-666X(2010)04-0302-05

2010-11-05；

2010-11-30）

（本文編輯 白朝暉）

10.3969/j.issn.1674-666X.2010.04.012

510010廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院醫(yī)學實驗科

王捷，E-mail：jiew@tom.com