Lewis肺癌細(xì)胞通過TLR9對(duì)CD4+CD25+Treg細(xì)胞影響的研究

李 欣 付海英 張佳倫 李 一 （吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室,長(zhǎng)春 130021）

Lewis肺癌細(xì)胞通過TLR9對(duì)CD4+CD25+Treg細(xì)胞影響的研究

李 欣①付海英 張佳倫 李 一 （吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室,長(zhǎng)春 130021）

①長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)微生物與免疫學(xué)教研室,長(zhǎng)春130021

目的:本研究以Lewis肺癌細(xì)胞為研究對(duì)象,探討腫瘤細(xì)胞通過TLRs對(duì)CD4+CD25+Treg細(xì)胞的影響。方法:我們采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了Lewis肺癌細(xì)胞與脾淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)中CD4+CD25+Treg細(xì)胞數(shù)量變化;通過RT-PCR方法檢測(cè)了共培養(yǎng)對(duì)Foxp3和TLR1-9mRNA表達(dá)的影響;采用TLR9受體阻斷劑氯喹阻斷Lewis肺癌TLR9的表達(dá)。結(jié)果:與對(duì)照組相比,共培養(yǎng)組CD4+CD25+Treg細(xì)胞數(shù)量及Foxp3mRNA表達(dá)均明顯增高（P＜0.05）;Lewis肺癌細(xì)胞與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)后可影響多種TLRs表達(dá),其中TLR9mRNA表達(dá)與對(duì)照組相比明顯增高（P＜0.05）,阻斷Lewis肺癌細(xì)胞TLR9可明顯降低CD4+CD25+Treg細(xì)胞數(shù)量及Foxp3mRNA表達(dá)（P＜0.05）。結(jié)論:Lewis肺癌細(xì)胞可通過TLR9促進(jìn)CD4+CD25+Treg細(xì)胞產(chǎn)生及功能增強(qiáng),參與誘導(dǎo)腫瘤的免疫耐受,從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。

CD4+CD25+Treg細(xì)胞;Foxp3;TLRs;腫瘤免疫

免疫系統(tǒng)的功能之一免疫監(jiān)視在清除腫瘤細(xì)胞方面發(fā)揮著重要作用,但不斷上升的臨床腫瘤發(fā)生率使人們對(duì)免疫監(jiān)視功能的存在、效應(yīng)及影響因素開始重新審視。腫瘤細(xì)胞可通過某些機(jī)制誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的耐受,逃避免疫監(jiān)視而在機(jī)體內(nèi)生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移。其中CD4+CD25+Treg細(xì)胞在腫瘤免疫中作用尤為引人關(guān)注[1,2],是影響體內(nèi)抗腫瘤效果的主要因素,對(duì)其深入研究有助于揭開人體腫瘤免疫之謎。CD4+CD25+Treg細(xì)胞可通過細(xì)胞接觸依賴機(jī)制或抑制性細(xì)胞因子依賴機(jī)制主動(dòng)抑制自身反應(yīng)性T細(xì)胞的活化,由CD4+CD25+Treg細(xì)胞介導(dǎo)的對(duì)自身反應(yīng)性細(xì)胞的調(diào)節(jié)是自身免疫耐受建立的重要機(jī)制之一。由于腫瘤抗原是自身抗原量或質(zhì)的改變,因此,推測(cè)CD4+CD25+Treg細(xì)胞在維持自身耐受的同時(shí),也可能在腫瘤耐受中發(fā)揮作用。

Toll樣受體（Toll-like receptors,TLRs）是一種重要的模式識(shí)別受體,作為天然免疫的重要組成部分及連接獲得性免疫與天然免疫的“橋梁”,主要通過識(shí)別病原相關(guān)分子模式來啟動(dòng)免疫應(yīng)答。目前研究發(fā)現(xiàn)抗原提呈細(xì)胞（Antigen present cell,APC）上TLR9表達(dá)增強(qiáng),可誘導(dǎo)CD4+CD25+Treg細(xì)胞的產(chǎn)生及功能增強(qiáng)。有研究報(bào)道腫瘤細(xì)胞也可以表達(dá)多種TLRs[3],在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用。我們推測(cè)表達(dá)在腫瘤細(xì)胞表面的TLRs是否與APC上TLRs作用相似,可通過影響CD4+CD25+Treg細(xì)胞功能,在腫瘤耐受、逃避免疫監(jiān)視中發(fā)揮作用。因此,本研究以Lewis肺癌細(xì)胞為研究對(duì)象,探討腫瘤細(xì)胞通過TLRs對(duì)CD4+CD25+Treg細(xì)胞的影響,為腫瘤免疫逃逸機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 近交系C57BL/6小鼠,體重18～22克,4～6周齡,由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 細(xì)胞 小鼠Lewis肺癌細(xì)胞株,由教研室傳代保存。

1.1.3 試劑 IMDM干粉培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司;新生小牛血清購(gòu)自杭州四季清公司;小鼠PE-anti-CD25+及FITC-anti-CD4+抗體購(gòu)于BD公司;PE-anti-TLR9抗體購(gòu)于Imagnix公司;Trizol試劑購(gòu)自Gibco公司;AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNasin與Ex Tag DNA聚合酶均購(gòu)自TaKaRa公司;氯喹（CQ）購(gòu)自上海中西制藥有限公司。

1.2 方法

1.2.1 Lewis肺癌細(xì)胞與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)體系的建立 將5×105個(gè)Lewis肺癌細(xì)胞與1×106個(gè)小鼠脾淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)于6孔板,共培養(yǎng)48小時(shí)后用于檢測(cè),脾淋巴細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)作為對(duì)照。

1.2.2 共培養(yǎng)后CD4+CD25+Treg細(xì)胞含量的測(cè)定

取共培養(yǎng)及阻斷TLR9后共培養(yǎng)上清1×106個(gè)細(xì)胞（100μl體積）,加入 PE-anti-CD4+和 FITC-anti-CD25+抗體,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)脾臟CD4+CD25+Treg細(xì)胞數(shù)量,以CD4+CD25+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞百分比反映CD4+CD25+Treg細(xì)胞含量。

1.2.3 TLR9受體阻斷劑氯喹（CQ）阻斷后TLR9含量的測(cè)定 Lewis肺癌細(xì)胞貼壁4小時(shí)后加100μg/m lCQ,每孔 1 ml,繼續(xù)培養(yǎng)1小時(shí);將上清吸棄,Hanks液洗兩遍,將CQ除去;流式檢測(cè)阻斷 1、2、24小時(shí)后TLR9含量。

1.2.4 共培養(yǎng)后Foxp3和TLRsmRNA表達(dá)的檢測(cè)

用Trizol試劑提取共培養(yǎng)后淋巴細(xì)胞總RNA,并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。cDNA的逆轉(zhuǎn)錄采用TaKaRa的AMV RTase,按說明書進(jìn)行操作。通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定PCR反應(yīng)條件和最適循環(huán)數(shù),以保證PCR產(chǎn)物量與起始cDNA量呈線性相關(guān),引物序列見表1。選取βactin為內(nèi)參照,取5μl PCR產(chǎn)物用1.5%的普通瓊脂糖凝膠電泳后,凝膠電泳成像系統(tǒng)觀測(cè)成像情況。

2 結(jié)果

2.1 Lewis肺癌細(xì)胞與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)對(duì)CD4+CD25+Treg細(xì)胞數(shù)量和功能影響 為了探討腫瘤免疫微環(huán)境中腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞相互作用對(duì)CD4+CD25+Treg細(xì)胞數(shù)量和功能的影響,我們采用FACS檢測(cè)了Lewis肺癌細(xì)胞與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)后CD4+CD25+Treg細(xì)胞數(shù)量變化;轉(zhuǎn)錄因子Foxp3特異性高表達(dá)于CD4+CD25+Treg細(xì)胞,可作為CD4+CD25+Treg細(xì)胞較特異的標(biāo)志,而且還與CD4+CD25+Treg細(xì)胞分化及功能密切相關(guān),因此常作為CD4+CD25+Treg細(xì)胞功能指標(biāo)之一,為進(jìn)一步研究腫瘤細(xì)胞對(duì)CD4+CD25+Treg細(xì)胞功能影響,我們采用RT-PCR方法檢測(cè)了共培養(yǎng)后收集的淋巴細(xì)胞的Foxp3 mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示:Lewis肺癌細(xì)胞與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)后,可明顯提高CD4+CD25+Treg細(xì)胞數(shù)量,共培養(yǎng)組與對(duì)照組CD4+CD25+Treg細(xì)胞含量分別為10.8±1.45、3.8±1.69,差異具有顯著性P＜0.05,見圖1;共培養(yǎng)后Foxp3 mRNA表達(dá)水平明顯提高,共培養(yǎng)組與對(duì)照組Foxp3 mRNA表達(dá)水平分別為0.35±0.10、0.23±0.15,差異具有顯著性P＜0.05,見圖2。結(jié)果提示腫瘤細(xì)胞可能通過某種機(jī)制影響CD4+CD25+Treg細(xì)胞。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2.2 Lewis肺癌細(xì)胞與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)后TLRs表達(dá)變化 已有研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞可表達(dá)TLRs,可能參與腫瘤的免疫逃逸,為探討TLRs在腫瘤免疫中的作用,我們采用RT-PCR方法檢測(cè)了Lewis肺癌細(xì)胞與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng),TLRs表達(dá)變化。結(jié)果顯示Lewis肺癌細(xì)胞與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)48小時(shí)后,TLR4、TLR5有所增高,TLR9增高明顯,TLR7、8不表達(dá),其他TLRs變化不明顯,見圖3。結(jié)果表明TLRs在腫瘤細(xì)胞與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)后表達(dá)不同,推測(cè)其可能在CD4+CD25+Treg細(xì)胞的誘導(dǎo)中發(fā)揮作用。

2.3 Lewis肺癌細(xì)胞表達(dá)的TLR9對(duì)CD4+CD25+Treg數(shù)量和功能影響

2.3.1 TLR9受體阻斷劑氯喹（CQ）阻斷效果檢測(cè)為了研究Lewis肺癌細(xì)胞TLR9功能,我們選擇氯喹（CQ）作為其阻斷劑,首先驗(yàn)證CQ阻斷效果,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CQ阻斷后TLR9表達(dá)變化,結(jié)果顯示100μg/ml CQ阻斷后可明顯降低TLR9蛋白表達(dá),并隨時(shí)間延長(zhǎng)阻斷效果越明顯,見圖4。結(jié)果提示100 μg/ml CQ可作為TLR9阻斷劑進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

圖1 Lewis肺癌細(xì)胞與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)后Treg細(xì)胞數(shù)量變化Fig.1 The changes of CD4+CD25+T cells number after Lewis lung cancer cells co-cu lture with lymphocyte

圖2 Lewis肺癌細(xì)胞與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)后Foxp3m RNA變化Fig.2 The expressionsof Foxp3mRNA after Lewis lung cancer cells co-culture with lymphocyte

圖3 Lewis肺癌細(xì)胞與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)后TLRsmRNA變化Fig.3 The expressions of TLRsmRNA after Lewis lung cancer cells co-culture with lymphocyte

圖4 CQ阻斷后TLR9表達(dá)Fig.4 The expressions of TLR9 after CQ blocking

圖5 CQ阻斷后TLR9后 CD4+CD25+Treg細(xì)胞數(shù)量變化Fig.5 The comparison the CD4+CD25+Treg cells frequency after CQ b locking

圖6 CQ阻斷后TLR9后Foxp3 mRNA變化Fig.6 The expressions of Foxp3mRNA after CQ blocking

2.3.2 氯喹（CQ）阻斷TLR9后Lewis肺癌細(xì)胞對(duì)CD4+CD25+Treg數(shù)量和功能的影響 為了進(jìn)一步探討Lewis肺癌細(xì)胞TLR9對(duì)CD4+CD25+Treg細(xì)胞的影響,我們采用 FACS檢測(cè)CQ阻斷 TLR9后,CD4+CD25+Treg細(xì)胞數(shù)量變化,采用RT-PCR方法檢測(cè)CQ阻斷TLR9后Foxp3mRNA的變化,間接反映CD4+CD25+Treg細(xì)胞功能變化。結(jié)果顯示CQ阻斷TLR9后可降低CD4+CD25+Treg細(xì)胞數(shù)量,共培養(yǎng)組、CQ阻斷組及對(duì)照組CD4+CD25+Treg細(xì)胞數(shù)量分別為 15%±0.78%、12%±1.46%、5.1%±1.41%,差異具有顯著性（P＜0.05）,見圖5;CQ阻斷TLR9后可明顯降低Foxp3mRNA表達(dá),共培養(yǎng)組、CQ阻斷組及對(duì)照組Foxp3 mRNA表達(dá)分別為0.247±0.158、0.084±0.008、0.103 ±0.029,差異具有顯著性（P＜0.05）,見圖6。結(jié)果提示腫瘤細(xì)胞可能通過TLR9誘導(dǎo)CD4+CD25+Treg細(xì)胞,參與維持腫瘤免疫耐受,從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。

3 討論

自1995年Sakaguchi等人首先提出CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Regulatory T cells,Treg）之后,引起了免疫學(xué)界越來越多的關(guān)注,先后對(duì)其進(jìn)行了廣泛的研究[4]。CD4+CD25+Treg細(xì)胞主要在機(jī)體免疫系統(tǒng)中發(fā)揮負(fù)向調(diào)節(jié)作用,既能抑制不恰當(dāng)?shù)拿庖邞?yīng)答,又能限定免疫應(yīng)答的范圍、程度及作用時(shí)間,對(duì)效應(yīng)細(xì)胞的增殖、免疫活性的發(fā)揮起抑制作用。由于腫瘤抗原是自身抗原量或質(zhì)的改變,因此,CD4+CD25+Treg細(xì)胞在維持自身耐受的同時(shí),也可能抑制腫瘤免疫應(yīng)答的發(fā)生。有研究報(bào)道卵巢癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤患者的外周血及腫瘤局部Treg細(xì)胞比例增加[5-7],在腫瘤動(dòng)物模型中亦發(fā)現(xiàn)在腫瘤外周及腫瘤局部Treg細(xì)胞比例增加,功能增強(qiáng)[8],因此,由腫瘤細(xì)胞所引起的CD4+CD25+Treg細(xì)胞產(chǎn)生及功能增強(qiáng)可能是腫瘤逃避免疫監(jiān)視機(jī)制之一。

腫瘤局部免疫微環(huán)境中,可見大量的免疫細(xì)胞聚集,這些聚集在腫瘤局部的免疫細(xì)胞一方面在腫瘤清除的免疫監(jiān)視中發(fā)揮重要作用;另一方面,有些免疫細(xì)胞如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞很可能在腫瘤的免疫逃逸中發(fā)揮作用,但其具體機(jī)制還不清楚。因此,本文我們以Lewis肺癌細(xì)胞與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)為研究對(duì)象,探討了腫瘤細(xì)胞對(duì)CD4+CD25+Treg細(xì)胞的影響及其可能機(jī)制。結(jié)果顯示,雖然Lewis肺癌細(xì)胞與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)體系中,脾淋巴細(xì)胞可對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞有自然殺傷作用,但本研究發(fā)現(xiàn)Lewis肺癌細(xì)胞可促進(jìn)CD4+CD25+Treg數(shù)量增加,功能增強(qiáng),提示腫瘤細(xì)胞可能通過某種機(jī)制影響CD4+CD25+Treg細(xì)胞,參與誘導(dǎo)腫瘤免疫耐受,從而逃避免疫系統(tǒng)的攻擊。

Toll樣受體（Toll-like receptors,TLRs）作為一類重要模式識(shí)別受體（Pattern recognition receptor,PRR）,主要表達(dá)于免疫細(xì)胞尤其是巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞上。其功能主要是識(shí)別存在于細(xì)菌、真菌、病毒和原蟲等病原微生物中的病原相關(guān)分子模式（Pathogen associated molecular patterns,PAMPs）,在免疫系統(tǒng)對(duì)病原微生物的識(shí)別和啟動(dòng)免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮了重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)抗原提呈細(xì)胞（Antigen presenting cells,APC）上TLR9表達(dá)增強(qiáng),可誘導(dǎo)CD4+CD25+Treg細(xì)胞的產(chǎn)生及功能增強(qiáng)[3,9]。因此,TLRs不但參與免疫應(yīng)答的啟動(dòng),還可以通過影響CD4+CD25+Treg細(xì)胞參與免疫應(yīng)答的負(fù)調(diào)節(jié)。

近年來,在人們對(duì)免疫系統(tǒng)中的TLRs研究的過程中,還發(fā)現(xiàn)了腫瘤細(xì)胞也可以表達(dá)多種TLRs,在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用。有研究報(bào)道人乳腺癌Cama-1[10]和黑色素瘤Me260[11]表達(dá)的TLR3可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡,小鼠結(jié)腸癌MC26[12]表達(dá)的TLR4可以促進(jìn)腫瘤的耐受,鼠乳腺癌D2F2表達(dá)的TLR5在早期促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng),而晚期抑制腫瘤生長(zhǎng)。所以,腫瘤細(xì)胞的TLRs的表達(dá)可能在一定程度上參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。因此,我們首先研究了Lewis肺癌細(xì)胞與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)后TLRs表達(dá)變化。研究發(fā)現(xiàn)Lewis肺癌細(xì)胞與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)后TLR9表達(dá)升高明顯。腫瘤細(xì)胞表達(dá)TLR9是否與APC表達(dá)TLR9具有相同影響CD4+CD25+Treg細(xì)胞的功能呢?為此,我們利用氯喹（CQ）阻斷 Lewis肺癌細(xì)胞 TLR9后,觀察 CD4+CD25+Treg細(xì)胞的數(shù)量和功能。結(jié)果顯示阻斷Lewis肺癌細(xì)胞TLR9,可降低CD4+CD25+Treg細(xì)胞數(shù)量和功能,提示腫瘤細(xì)胞可能通過TLR9直接或間接誘導(dǎo)CD4+CD25+Treg細(xì)胞的產(chǎn)生和功能增強(qiáng),參與腫瘤免疫耐受的誘導(dǎo)與維持。

綜上,我們研究發(fā)現(xiàn)在體外Lewis肺癌細(xì)胞可促進(jìn)CD4+CD25+Treg細(xì)胞數(shù)量增加,功能增強(qiáng);Lewis肺癌細(xì)胞可表達(dá)多種TLRs,并參與促進(jìn)CD4+CD25+Treg細(xì)胞的產(chǎn)生及功能增強(qiáng),從而在腫瘤免疫耐受中發(fā)揮重要作用。本研究初步探討了TLRs在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用,為以通過TLRs調(diào)控CD4+CD25+Treg細(xì)胞為靶點(diǎn)的腫瘤免疫治療提供了新的思路。

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[收稿2009-07-18 修回2009-09-09]

（編輯 張曉舟）

Lew is lung cancer cells affect CD4+CD25+Treg cells via TLR9

LIXin,FUHai-Ying,ZHANGJia-Lun,LIYi.DepartmentofImmunology,BethuneMedicalCollege,JilinUniversity,Changchun130021,China

Objective:To explore the influence of tumor cells on CD4+CD25+Treg cells via TLRs.Methods:The numbers changes of CD4+CD25+Treg cells in the co-culture system of Lewis lung cancer cells and splenic lymphocyteswere detected by flow cytometry;The expression of Foxp3 and TLR1-9mRNA after co-cu lturewere detected by RT-PCR;TLR9 expression on Lewis lung cancer cellswas blocked by TLR9 receptor antagonist chloroquine.Results:Compared with control group,the number of CD4+CD25+Treg cells and Foxp3mRNA expression were significantly increased in the co-culturegroup（P＜0.05）.The expression of a variety of TLRswere affected by the co-culture of lymphocyteswith Lewis lung cancer cells,and TLR9mRNA expression was significantly increased comparedwith thatof the control group（P＜0.05）;Blocking TLR9 of Lewis lung cancer cells significantly reduce CD4+CD25+Treg cells and Foxp3 mRNA（P＜0.05）.Conclusion:Lewis lung cancer cells could increase both number and function of CD4+CD25+Treg cells through inducing TLR9 expression in immunocells.Thismightbe one ofmechanisms of tumor-induced immune tolerance,and by which to contribute to the occurrence and p rogression of tumors.

CD4+CD25+Treg cells;Foxp3;TLRs;Tumor immunity

R392

A

1000-484X（2010）02-0124-05

李 欣（1979年-）,女,在讀博士,主要從事腫瘤免疫耐受研究;

及指導(dǎo)教師:李 一（1961年-）,女,教授,博士生導(dǎo)師,主要從事自身免疫耐受研究。