• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    Cyr61促進(jìn)RA滑膜細(xì)胞增殖及炎癥因子調(diào)控研究①

    2010-02-06 04:38:08林錦驃吳娟娟沈佰華李寧麗
    中國(guó)免疫學(xué)雜志 2010年3期
    關(guān)鍵詞:滑膜細(xì)胞因子抗體

    林錦驃 吳娟娟 王 利 鄒 靜 沈佰華 李寧麗

    (上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院上海市免疫學(xué)研究所,上海 200025)

    Cyr61促進(jìn)RA滑膜細(xì)胞增殖及炎癥因子調(diào)控研究①

    林錦驃 吳娟娟 王 利②鄒 靜③沈佰華 李寧麗

    (上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院上海市免疫學(xué)研究所,上海 200025)

    目的:采用類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)患者滑膜細(xì)胞的體外培養(yǎng),研究基質(zhì)蛋白Cyr61在RA滑膜細(xì)胞增殖中的作用及其機(jī)制。方法:通過(guò)Real-time PCR、Westernblot和免疫組化檢測(cè)RA病人的滑膜組織和細(xì)胞中Cyr61的表達(dá)情況;用3H-TdR摻入法檢測(cè)滑膜液(SF)對(duì)滑膜細(xì)胞增殖的影響;用ELISA方法檢測(cè)RA患者滑膜液中Cyr61蛋白的水平。結(jié)果:RA病人的滑膜組織和細(xì)胞中高表達(dá)Cyr61;SF能刺激滑膜細(xì)胞發(fā)生明顯增殖;且RA患者滑膜液中含高濃度的Cyr61蛋白。用SiRNA干擾技術(shù)抑制滑膜細(xì)胞中Cyr61基因表達(dá),再加入滑膜液后,則滑膜細(xì)胞增殖明顯降低。同時(shí),將SF與anti-Cyr61抗體共同孵育后再刺激滑膜細(xì)胞,FLS也不再發(fā)生明顯增殖。進(jìn)一步研究滑膜液中與上調(diào)Cyr61表達(dá)有關(guān)的炎癥細(xì)胞因子,發(fā)現(xiàn)SF中IFN-γ和TNF-α具有上調(diào)Cyr61蛋白表達(dá)的作用。結(jié)論:Cyr61蛋白是促進(jìn)滑膜細(xì)胞增殖的重要調(diào)控基因;RA患者滑膜液中含有高濃度的炎癥因子IFN-γ和TNF-α,通過(guò)上調(diào)Cyr61蛋白表達(dá)而促進(jìn)滑膜細(xì)胞增殖,可能是促進(jìn)RA病理性滑膜增生的重要因素之一。

    類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎;滑膜液,Cy r61;滑膜纖維樣細(xì)胞;TNF-α/IFN-γ

    Cyr61(Cysteine-rich 61)是一種分泌性基質(zhì)蛋白,由381個(gè)氨基酸殘基組成。最早于1985年被Lau等在用血清或血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)刺激小鼠BALB/c 3T3成纖維細(xì)胞時(shí)所發(fā)現(xiàn)。因其結(jié)構(gòu)中富含半胱氨酸(含10%的半胱氨酸殘基)而被命名為富含半胱氨酸Cyr61(Cysteine-rich 61)。Cyr61具有明顯的促有絲分裂活性和趨化性,可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖和分泌細(xì)胞外基質(zhì),參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增生、分化、胚胎發(fā)育形成,是生命活動(dòng)的基本蛋白[1-4]。目前,對(duì)于Cyr61的研究多集中在腫瘤中,而在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的作用尚無(wú)報(bào)道[5-7]。

    本文在采用表達(dá)芯片技術(shù)對(duì)4例RA病人的滑膜組織進(jìn)行了表達(dá)基因表達(dá)譜的分析研究,發(fā)現(xiàn)Cyr61在RA患者的滑膜組織中顯著升高的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步采用RA滑膜細(xì)胞的體外培養(yǎng)、增殖實(shí)驗(yàn)、基因敲除技術(shù)等,較為系統(tǒng)地研究了Cyr61在RA滑膜細(xì)胞增殖中的作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn):RA滑液中含有較高濃度的Cyr61蛋白,具有介導(dǎo)RA滑膜細(xì)胞增殖的作用。而RA滑液中的炎癥因子TNF-α和IFN-γ能夠上調(diào)Cyr61表達(dá),這可能是導(dǎo)致RA病理性滑膜增殖的重要因素之一。這一研究為今后發(fā)現(xiàn)治療RA新靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 病人標(biāo)本 20例RA患者滑膜組織來(lái)自于上海光華中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科行膝關(guān)節(jié)置換或滑膜切除術(shù)的RA病人。所有病例的診斷符合1987年美國(guó)風(fēng)濕病協(xié)會(huì)(ARA)修訂的類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)[8]。其中女性 18例,男性 2例,年齡 40~60歲,病程平均(12±6)年。20例OA患者滑膜組織來(lái)自于上海光華中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科行膝關(guān)節(jié)置換或滑膜切除術(shù)的OA病人。所用病例符合Altam提出的關(guān)于OA的診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]。其中女性13例,男性7例,年齡40~60歲,病程平均(22±8)年。2例正?;そM織來(lái)自于本校第九人民醫(yī)院骨科,為外傷手術(shù)病人關(guān)節(jié)滑膜組織。上述患者滑膜組織用于體外培養(yǎng)(詳見(jiàn)下述),部分組織用4%多聚甲醛固定后留作免疫組化,血清和滑膜液(SF)高速離心后取上清,-80℃儲(chǔ)存待用。本研究中所用臨床樣本,均對(duì)患者進(jìn)行知情告知并經(jīng)本院倫理委員會(huì)通過(guò)。

    1.2 滑膜細(xì)胞體外培養(yǎng) 將無(wú)菌獲取的滑膜組織用PBS清洗后,用無(wú)菌手術(shù)剪刀反復(fù)剪切成約1mm×1mm×1mm的組織塊,加入膠原酶Ⅱ(0.5mg/m l),37℃、消化2小時(shí)后,經(jīng) 200目紗網(wǎng)過(guò)濾,離心去上清后,將細(xì)胞重懸于DMEM培養(yǎng)液,置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)成梭形并成片后,進(jìn)行傳代培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞傳至第3代后,分別加入FITC標(biāo)記的小鼠抗人CD3、CD14、CD19和PE 標(biāo)記的小鼠抗人CD11b進(jìn)行標(biāo)記,流式細(xì)胞儀檢測(cè)鑒定。上述4種標(biāo)記均為陰性的細(xì)胞為成纖維樣滑膜細(xì)胞(Fibroblast-like Synoviocytes,FLS)用于本研究。

    1.3 Cyr61表達(dá)檢測(cè)

    1.3.1 Real-time PCR檢測(cè)Cyr61表達(dá) 采用ABI公司提供的軟件prism2.0設(shè)計(jì)所檢測(cè)基因表達(dá)引物,序列見(jiàn)表1。Real-time PCR操作與結(jié)果分析同以前報(bào)道[10]。簡(jiǎn)述之:收集滑膜組織與FLS,用Trazol提取RNA,經(jīng)隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后,將熒光染料SYBRGreen和目的基因Cyr61與內(nèi)參GADPH的引物混勻后,加入 Real-time PCR檢測(cè)板、密封、上機(jī)檢測(cè)(ABI 7900)。所采用的反應(yīng)條件為:50℃2分鐘,95℃10分鐘,95℃15秒,60℃60秒,共 40個(gè)循環(huán)。根據(jù)PCR反應(yīng)信號(hào)強(qiáng)度Ct值計(jì)算每個(gè)樣本的Cyr61基因相對(duì)表達(dá)量。

    表1 Real-time PCR檢測(cè)基因及引物序列Tab.1 Gene and primer sequence for Real-time PCR

    1.3.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)滑膜組織Cyr61表達(dá)將所獲取的滑膜組織用4%多聚甲醛固定,經(jīng)脫水、包埋、切片固定等常規(guī)方法獲得滑膜組織切片。經(jīng)常規(guī)二甲苯脫臘、梯度酒精脫苯、洗滌后進(jìn)行Cyr61免疫組化染色。簡(jiǎn)述之:首先用兔血清封閉切片的非特異性抗原、去血清后加1∶50的羊抗人Cyr61多克隆抗體(Sant Cruz,USA)及抗人IgG作為空白對(duì)照,4℃過(guò)夜后,洗滌、加生物素標(biāo)記的兔抗羊IgG,室溫20分鐘后加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素親和素標(biāo)記抗體,經(jīng)DAB緩沖液顯色,中止后用蘇木素復(fù)染,常規(guī)脫水,透明封片。顯微鏡下拍照(×40),并采用圖像分析法對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行相對(duì)定量分析。

    1.3.3 Western blot檢測(cè)FLS細(xì)胞Cyr61蛋白表達(dá)常規(guī)Western blot方法檢測(cè)FLS中Cyr61表達(dá)。

    1.4 ELISA方法檢測(cè)滑膜液中Cyr61蛋白 采用自制的鼠抗人Cyr61單克隆抗體(將另文報(bào)道)包被ELISA板,其余同常規(guī)ELISA方法。簡(jiǎn)述之:鼠抗人Cyr61單克隆抗體包被(1μg/孔)并于4℃過(guò)夜,次日用1%BSA-PBS封閉2小時(shí),加入RA患者滑膜液及骨關(guān)節(jié)炎患者滑膜液各30份及RA患者血清20份,

    100μl/孔。同時(shí)加入倍比稀釋的hCyr61標(biāo)準(zhǔn)蛋白(200、100、50、25、12.5、6.25、3.13、0 ng/ml)。經(jīng)37℃孵育1小時(shí)后,加入市售羊抗人Cyr61抗體(Sant Cruz,USA)100μl/孔,孵育后加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗羊IgG抗體工作液、OPD底物顯色、終止反應(yīng)后于酶標(biāo)儀上測(cè)定OD(492 nm)值,根據(jù)hCyr61標(biāo)準(zhǔn)蛋白測(cè)定的OD值制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),獲得待測(cè)樣品中Cyr61蛋白濃度。

    1.5 成纖維樣滑膜細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和抗體中和實(shí)驗(yàn)將 FLS接種于 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每孔2×103cells/孔/200μl。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育 12小時(shí)后,加入不同稀釋度的RA滑膜液,繼續(xù)孵育24小時(shí),加入3H-TdR(1μCi/孔),再培養(yǎng) 18小時(shí),收集細(xì)胞,加液體閃爍液,β計(jì)數(shù)儀檢測(cè)cpm值??贵w中和實(shí)驗(yàn):FLS接種至96孔培養(yǎng)板中,將抗人Cyr61單抗按照 1∶25、1∶50、1∶100 比例加入 SF 中混勻 ,同時(shí)設(shè)無(wú)關(guān)單抗(1∶25)為對(duì)照。經(jīng)與滑膜細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后加3H-TdR(1μCi/孔),再培養(yǎng)18小時(shí),收集細(xì)胞,加液體閃爍液,β計(jì)數(shù)儀檢測(cè)cpm值以觀察FLS的增殖作用變化。

    1.6 Cyr61 SiRNA干擾實(shí)驗(yàn) 根據(jù)GeneBank數(shù)據(jù),人工合成隨機(jī)SiRNA(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)3對(duì)。采用Real-time PCR對(duì)于所合成的SiRNA干擾效果進(jìn)行篩選。選用干擾效果達(dá)70%的SiRNA進(jìn)行Cyr61干擾實(shí)驗(yàn)。簡(jiǎn)述之:在5×104FLS中加入轉(zhuǎn)染試劑(Lipofectin 2000,USA)與對(duì)照 SiRNA(稱(chēng)SiNC)和 Cyr61特異性 SiRNA(SiCyr61),混勻后,37℃、5%CO2培養(yǎng),24~48小時(shí)后,取被干擾細(xì)胞進(jìn)行Cyr61相對(duì)表達(dá)量檢測(cè),檢測(cè)干擾效果和對(duì)于滑膜細(xì)胞增殖的影響(滑膜細(xì)胞增殖測(cè)定方法同上)。

    1.7 細(xì)胞因子刺激和抗體中和實(shí)驗(yàn) 將重組人IL-10、IL-12、IFN-γ、TNF-α加入培養(yǎng)的 FLS中 ,8小時(shí)后Real-time PCR檢測(cè)Cyr61的mRNA表達(dá)水平。所用細(xì)胞因子濃度為:IL-10 0.1 ng/ml,IL-12 0.5 ng/ml,IFN-γ0.05 ng/ml,TNF-α0.05 ng/ml,滑膜液(1∶5 稀釋?zhuān)┳鳛殛?yáng)性對(duì)照。細(xì)胞因子抗體阻斷實(shí)驗(yàn):將抗IFN-γ(10 μg/m l)和抗 TNF-α(200 ng/ml)分別與IFN-γ、TNF-α、滑膜液混勻后加入滑膜細(xì)胞共同孵育,8小時(shí)后檢測(cè)Cyr61的mRNA表達(dá)水平。

    1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Grafpphad prism 5.0進(jìn)行作圖和分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示,組間比較采用t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 RA患者滑膜組織中Cyr61表達(dá)增高 本實(shí)驗(yàn)室前期運(yùn)用基因芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Cyr61基因在RA滑膜組織中表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常人和骨關(guān)節(jié)炎(OA)患者滑膜組織(圖1A),為明確RA病人FLS中Cyr61的表達(dá)情況,我們應(yīng)用Real-time PCR分析了10例RA患者外周血、關(guān)節(jié)液和滑膜組織來(lái)源的單個(gè)核細(xì)胞及滑膜組織中Cyr61mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果可見(jiàn):RA患者的滑膜組織Cyr61基因的相對(duì)含量比RA患者的外周血、關(guān)節(jié)液和滑膜組織來(lái)源的單個(gè)核細(xì)胞以及正常人的外周血單個(gè)核細(xì)胞分別高8.7倍、125倍及13.3倍(P<0.05),證實(shí)了基因芯片的結(jié)果。進(jìn)一步用免疫組化染色的方法觀察了Cyr61在滑膜組織不同細(xì)胞中的分布及蛋白表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn):與OA及正?;そM織相比,RA患者滑膜襯里層和襯里下層巨噬細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞浸潤(rùn),血管增生,大量淋巴細(xì)胞,漿細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤(rùn),淋巴濾泡形成伴纖維素樣壞死,FLS增生,而OA與正常人滑膜組織僅少量Cyr61表達(dá)(圖1C)。采用圖像分析證實(shí)了這一結(jié)果(圖1D)。

    圖1 RA患者組織及細(xì)胞中Cyr61基因的相對(duì)含量表達(dá)格局Fig.1 Relativeexpression of Cyr61 in synovial tissues and cells of RA patients

    圖2 體外培養(yǎng)的RA FLS中高表達(dá)Cyr61Fig.2 Overexpression of Cyr61 in RA FLS in vitro

    2.2 RA病人滑膜成纖維細(xì)胞Cyr61表達(dá)增高 為深入研究RA患者滑膜細(xì)胞中Cyr61表達(dá)與作用機(jī)理,我們?cè)隗w外培養(yǎng)了滑膜細(xì)胞(FLS)并用Real-time PCR分析了FLS中Cyr61mRNA的表達(dá)格局。結(jié)果可見(jiàn):在RA患者的FLS中Cyr61基因的相對(duì)含量明顯高于滑膜組織(圖2A),說(shuō)明Cyr61主要在RA滑膜組織的成纖維樣滑膜細(xì)胞中表達(dá)增高;同時(shí)我們還比較了RA、OA和正常人培養(yǎng)至第3代的FLS中Cyr61mRNA的表達(dá)水平。如圖2B所示,在RA患者的FLS中Cyr61基因的相對(duì)表達(dá)量比OA患者和正常人的FLS分別高3.5倍、20倍,從mRNA水平上證實(shí)了Cyr61在 RA病人 FLS表達(dá)增高。進(jìn)一步用Western blot的方法對(duì)RA、OA和正常人的FLS進(jìn)行Cyr61蛋白表達(dá)水平檢測(cè)。結(jié)果表明 RA FLS中Cyr61表達(dá)水平明顯高于OA和正常人FLS,從而驗(yàn)證免疫組化的結(jié)果,更加證明Cyr61主要表達(dá)在滑膜的成纖維樣細(xì)胞中(圖2C)。

    2.3 RA的滑膜液(SF)刺激FLS增殖與Cyr61表達(dá)為了觀察局部炎癥環(huán)境對(duì)于FLS的生物學(xué)效應(yīng)和Cyr61表達(dá)的影響,我們將RA患者的滑膜液(SF)加入培養(yǎng)的細(xì)胞中,采用Real-time PCR和Western blot觀察滑膜液對(duì)FLS中Cyr61mRNA和蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果表明:RA滑膜液能夠促進(jìn)FLS中Cyr61mRNA和蛋白表達(dá)(圖3A)。進(jìn)一步采用3H-TdR摻入法,觀察不同濃度滑液對(duì)于RA-FLS增殖的影響。結(jié)果表明:與對(duì)照組相比,各劑量組滑膜液均能促進(jìn)RA FLS增殖并呈劑量依賴(lài)性(圖3B)。

    圖3 不同濃度滑膜液對(duì)于FLS Cyr61表達(dá)和增殖的影響Fig.3 Enhancement of FLSexp ression of Cyr61 and proliferation by synovial fluid

    圖4 RA滑液中Cyr61含量與抗Cyr61抗體阻斷實(shí)驗(yàn)Fig.4 Concentration of Cyr61 in RA SF and anti-Cyr61 neutralization assay

    2.4 RA患者SF中Cyr61濃度增高,抗Cyr61抗體能夠阻斷SF促進(jìn)FLS增殖 由于Cyr61是一種分泌性蛋白,具有明顯的促有絲分裂活性,可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖。而我們的實(shí)驗(yàn)也證實(shí)RA病人滑膜細(xì)胞中高表達(dá)Cyr61蛋白,為此我們采用本室制備的鼠抗人Cyr61單抗檢測(cè)RA SF(n=30)中Cyr61蛋白的含量,并與OA SF和RA患者外周血清相對(duì)比。結(jié)果顯示:RA SF中Cyr61蛋白明顯高于對(duì)照OA SF,RA患者外周血(圖 4A)。而進(jìn)一步采用抗人Cyr61單抗進(jìn)行中和實(shí)驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn):Cyr61單克隆抗體能夠中和RA-SF刺激滑膜細(xì)胞增殖的作用,并且呈劑量依賴(lài)性。當(dāng)RA-SF稀釋到1∶100,阻斷作用基本消失(圖4B)。表明Cyr61蛋白具有刺激滑膜細(xì)胞增殖作用。

    圖5 Cyr61特異性基因干擾實(shí)驗(yàn)圖Fig.5 Specific Cyr61 SiRNA in RA FLS

    圖6 IFN-γ和TNF-α均可上調(diào)RA FLS中 Cyr61的表達(dá)Fig.6 Elevated expression of Cyr61 by IFN-γand TNF-αin RA FLS

    2.5 特異性基因干擾實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Cyr61具有促進(jìn)FLS增殖作用 我們分別設(shè)計(jì)了3條針對(duì)人Cyr61基因的雙鏈小RNA(SiRNA),同時(shí)用與哺乳動(dòng)物無(wú)關(guān)的SiRNA作為陰性對(duì)照(SiRNA of Negative control,siNC)。用脂質(zhì)體(Lipofectin2000)將SiRNA轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中,光學(xué)顯微鏡圖和熒光顯微鏡觀察表明轉(zhuǎn)染率達(dá)80%~90%。用Real-time PCR檢測(cè)干擾24小時(shí)后Cyr61的表達(dá)水平,其中H-3是針對(duì)人Cyr61的特異性SiRNA,抑制率約為 70%~80%(圖5A),因此,選用這一SiRNA進(jìn)行FLS增殖實(shí)驗(yàn)。進(jìn)一步觀察了干擾的最佳時(shí)間,發(fā)現(xiàn)干擾24小時(shí)效果最好(圖5B)。因此,采用干擾24小時(shí),結(jié)果表明當(dāng)FLS中Cyr61表達(dá)受到干擾時(shí),FLS受到滑液刺激后的增殖明顯降低(圖5C),提示Cyr61是介導(dǎo)SF刺激后滑膜細(xì)胞增殖的重要基因。

    2.6 RASF中 IFN-γ和TNF-α可上調(diào)Cyr61表達(dá)由于SF中含有高濃度的細(xì)胞因子[11],為了明確這些細(xì)胞因子是否與Cyr61上調(diào)有關(guān),本研究中用純化的細(xì)胞因子分別刺激RA FLS,觀察其Cyr61的表達(dá)情況。為了模擬其在體內(nèi)的作用,細(xì)胞因子的濃度選擇為在SF中能夠檢測(cè)到的濃度。結(jié)果表明:IFN-γ和TNF-α能夠上調(diào)Cyr61的表達(dá)(圖 6A)。為了明確該兩種細(xì)胞因子的作用,進(jìn)而采用阻斷抗體anti-IFN-γ(10μg/ml)和 anti-TNF-α(200 ng/ml)分別與SF混勻,在刺激8小時(shí)后收集培養(yǎng)的細(xì)胞,使用Real-time PCR的方法檢測(cè)其Cyr61的表達(dá)水平。結(jié)果顯示:用IFN-γ和TNF-α抗體阻斷后,SF的刺激作用也明顯下降,聯(lián)合阻斷的作用更明顯(圖6B)。

    3 討論

    類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoida athritis,RA)是一種以滑膜組織炎性增生、關(guān)節(jié)進(jìn)行性破壞為特征的慢性炎癥性自身免疫性疾病。其病因尚不明確,最近研究發(fā)現(xiàn),除了細(xì)胞因子和Th1/Th2細(xì)胞失衡外,非T細(xì)胞成分如FLS(Fibroblast-like synoviocytes,FLS)具有轉(zhuǎn)化細(xì)胞的特性,RA異常增生的滑膜組織類(lèi)似于局限性侵襲生長(zhǎng)的腫瘤,造成關(guān)節(jié)的破壞[12-15]。有研究報(bào)道,滑膜組織增生與癌基因和凋亡相關(guān)基因具有相關(guān)性,但Cyr61在RA滑膜組織增生中的作用,尚未見(jiàn)報(bào)道。

    本實(shí)驗(yàn)室前期運(yùn)用表達(dá)基因芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Cyr61基因在RA滑膜組織中表達(dá)增高。為進(jìn)一步驗(yàn)證此結(jié)果,我們應(yīng)用Real-time PCR分析了RA患者外周血、關(guān)節(jié)液和滑膜組織來(lái)源的單個(gè)核細(xì)胞,以及完整滑膜組織中Cyr61的表達(dá)水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn),RA患者的滑膜組織Cyr61基因的相對(duì)含量高于患者的外周血、關(guān)節(jié)液和滑膜組織來(lái)源的單個(gè)核細(xì)胞以及正常人的外周血單個(gè)核細(xì)胞。證實(shí)了用表達(dá)芯片所獲得結(jié)果。而用免疫組化也證實(shí)了只有RA滑膜組織高表達(dá)Cyr61,蛋白表達(dá)主要存在于滑膜襯里層細(xì)胞及襯里下層血管內(nèi)皮細(xì)胞、FLS。而OA患者和正常人的滑膜組織細(xì)胞中Cyr61表達(dá)比較微弱,并只分布在滑膜襯里層細(xì)胞中。

    為了深入研究Cyr61在RA滑膜組織中高表達(dá)的病理意義,我們首先建立了RA滑膜細(xì)胞的體外原代培養(yǎng),并獲得純化(原代培養(yǎng)第3代后)的纖維樣滑膜細(xì)胞(FLS)。在基因和蛋白水平上與OA和正常人滑膜組織的FLS進(jìn)行比較,明確了RA FLS中Cyr61的表達(dá)明顯高于OA和正常人FLS。在此基礎(chǔ)上,我們研究了Cyr61表達(dá)與關(guān)節(jié)滑膜液、FLS增殖及與炎癥因子的關(guān)系。

    我們首先用不同濃度的滑膜液刺激體外培養(yǎng)的滑膜細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)RA的SF能上調(diào)FLS中Cyr61表達(dá),同時(shí)促進(jìn)FLS增殖,而且Cyr61表達(dá)和FLS增殖均與滑液加入量呈正相關(guān),即表現(xiàn)出典型的劑量依賴(lài)性。由于RA FLS中高表達(dá)Cyr61蛋白,而Cyr61又是一種分泌蛋白,因此我們推測(cè)RA SF中可能存在Cyr61蛋白,這一推測(cè)通過(guò)ELISA檢測(cè)了RA和OA SF中Cyr61的含量得到證實(shí):RA SF中Cyr61蛋白含量明顯高于對(duì)照OA SF和RA患者外周血。而將抗Cyr61單克隆抗體加入SF,用于中和Cyr61作用,結(jié)果顯示這種處理后,SF刺激FLS增殖的能力明顯下降,說(shuō)明Cyr61的確能夠增強(qiáng)SF刺激FLS增殖的作用。

    RNA干擾(RNA interference,RNAi)是近幾年才發(fā)現(xiàn)的一種生物學(xué)現(xiàn)象,它由長(zhǎng)21~23個(gè)堿基對(duì)的雙鏈RNA介導(dǎo),通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì),導(dǎo)致序列特異的基因沉默。目前,RNA干擾已被廣泛應(yīng)用于探索基因功能、防治病毒感染以及治療腫瘤[16-18]。小干擾RNA(Small interfering RNA,SiRNA)抑制效率高,可達(dá)90%以上,而且沒(méi)有明顯的毒副作用。因此是近年應(yīng)用最為廣泛的特異性基因功能研究方法。我們針對(duì)Cyr61mRNA三個(gè)不同位點(diǎn)設(shè)計(jì)了三組SiRNA,并通過(guò)干擾后Cyr61表達(dá)變化篩選出干擾效率最高的Cyr61特異性SiRNA。用這一SiRNA轉(zhuǎn)染FLS,干擾FLS中Cyr61基因表達(dá),發(fā)現(xiàn)SiRNA干擾后,再用SF刺激,FLS增殖明顯下降,證實(shí)了Cyr61的確是介導(dǎo)FLS增殖的關(guān)鍵基因。

    由于RA SF中含有多種高濃度的細(xì)胞因子為RA滑膜炎提供了重要的微環(huán)境,在RA的發(fā)生和發(fā)展起重要作用[19,20]。我們推測(cè)SF中含有某些炎性細(xì)胞因子可能參與了Cyr61表達(dá)的上調(diào)。為了驗(yàn)證這一想法,我們用純化的細(xì)胞因子IL-10、IL-12、IFN-γ和TNF-α分別刺激FLS,結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有IFN-γ和TNF-α能夠上調(diào)FLS中Cyr61表達(dá)。進(jìn)一步采取抗IFN-γ和抗TNF-α中和抗體分別或同時(shí)與SF預(yù)孵育,以達(dá)到中和 SF中TNF-α和 IFN-γ的目的,然后再用這種預(yù)處理的SF刺激FLS,結(jié)果顯示此時(shí)的SF刺激FLS增殖的作用明顯下降。提示:RA SF含有的高濃度TNF-α和IFN-γ能夠通過(guò)上調(diào)滑膜細(xì)胞中Cyr61表達(dá),繼而,Cyr61促進(jìn)滑膜細(xì)胞增生。

    關(guān)于滑膜組織增生與癌基因和凋亡相關(guān)基因的關(guān)系已有研究報(bào)道[21-23],但是Cyr61與RA滑膜細(xì)胞增殖則未見(jiàn)報(bào)道。本研究首次報(bào)道了Cyr61蛋白介導(dǎo)RA滑膜增殖,而SF中的炎癥因子TNF-α和IFN-γ能夠上調(diào)Cyr61表達(dá)。這可能是導(dǎo)致RA病理性滑膜增殖的重要因素之一。這為今后進(jìn)一步篩選治療RA新靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但是,關(guān)于Cyr61如何促進(jìn)滑膜細(xì)胞增殖及其調(diào)控機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

    1 KunzM,Moeller S,Koczan Detal.Mechanismsof hypoxic gene regulation of angiogenesis factor Cyr61 in melanoma cells[J].J Biol Chem,2003;278(46):45651-45660.

    2 Xie D,Yin D,Wang H Jetal.Levelsof expression ofCYR61 and CTGF are prognostic for tumor progression and survival of individuals with gliomas[J].Clin Cancer Res,2004;10(6):2072-2081.

    3 Tong X,O'Kelly J,Xie Detal.Cyr61 suppresses the growth of nonsmall-cell lung cancer cellsvia the beta-catenin-c-myc-p53 pathway[J].Oncogene,2004;23(28):4847-4855.

    4 Grzeszkiewicz TM,Kirschling D J,Chen Netal.CYR61 stimulateshuman skin fibroblastm igration through Integrin alphavbeta5 and enhances mitogenesis through integrin alpha vbeta3,independentof its carboxyl-terminaldomain[J].JBiolChem,2001;276(24):21943-21950.

    5 Chen N,Chen CC,Lau L F.Adhesion of human skin fibroblasts toCyr61 ismediated through integrin alpha6beta1 and cellsurface heparan sulfate proteoglycans[J].JBiol Chem,2000;275(32):24953-24961.

    6 Holloway S E,Beck AW,Girard Letal.Increased expression of Cyr61(CCN1)identified in peritonealmetastases from human pancreatic cancer[J].JAm CollSurg,2005;200(3):371-377.

    7 Sampath D,Zhu Y,Winneker R Cetal.Aberrant expression of Cyr61,a member of the CCN(CTGF/Cyr61/Cef10/NOVH)family,and dysregulation by 17 beta-estradioland basic fibroblastgrowth factor in human uterine leiomyomas[J].JClin EndocrinolMetab,2001;86(4):1707-1715.

    8 Arnett F C,Edworthy SM,Bloch D Aetal.The American Rheumatism Association 1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis[J].Arthritis Rheum,1988;31(3):315-324.

    9 A ltman R,Asch E,Bloch Detal.Development of criteria for the c lassification and reporting of osteoarthritis.Classification of osteoarthritis of the knee.Diagnostic and therapeutic criteria committee of the American Rheumatism Association[J].A rthritis Rheum,1986;29(8):1039-1049.

    10 Du F,Wang L,Zhang Yetal.Role ofGADD45 beta in the regulation of synovial fluid T cellapoptosis in rheumatoid arthritis[J].Clin Immunol,2008;128(2):238-247.

    11 Miossec P.An update on the cytokine network in rheumatoid arthritis[J].CurrOpin Rheumatol,2004;16(3):218-222.

    12 Harris ED Jr.Rheumatoid arthritis.Pathophysiology and implications for therapy[J].N Engl JMed,1990;322(18):1277-1289.

    13 Bromley M,Woolley D E.Histopathology of the rheumatoid lesion.Identification of cell types at sitesof cartilage erosion[J].A rthritis Rheum,1984;27(8):857-863.

    14 TrabandtA,AicherW K,Gay REetal.Expression of the collagenolytic and Ras-induced cysteineproteinase cathepsin L and proliferation-associated oncogenes in synovial cells of MRL/I mice and patients with rheumatoid arthritis[J].Matrix,1990;10(6):349-361.

    15 Muller-Ladner U,K riegsmann J,Franklin BNetal.Synovial fibroblasts of patientswith rheumatoid arthritis attach to and invade normal human cartilagewhen engrafted into SCID m ice[J].Am J Pathol,1996;149(5):1607-1615.

    16 Tuschl T.Expanding small RNA interference[J].Nat Biotechnol,2002;20(5):446-448.

    17 Yu JY,DeRuiter S L,Turner D L.RNA interference by expression of short-interfering RNAsand hairpin RNAs in mammalian cells[J].Proc Natl Acad SciUSA,2002;99(9):6047-6052.

    18 SchwarzDS,Hutvagner G,Du Tetal.Asymmetry in the assembly of the RNAi enzyme complex[J].Cell,2003;115(2):199-208.

    19 Ciurtin C,Cojocaru VM,Miron IMetal.Correlation between different componentsof synovial fluid and pathogenesisof rheumatic diseases[J].Rom J Intern Med,2006;44(2):171-181.

    20 Wan B,Nie H,Liu Aetal.Aberrant regulation of synovialT cellactivation by soluble costimulatorymolecules in rheumatoid arthritis[J].J Immunol,2006;177(12):8844-8850.

    21 Nakashima M,Eguchi K,Aoyagi Tetal.Expression of basic fibroblast growth factor in synovial tissues from patientswith rheumatoid arthritis:detection by immunohistological staining and in situ hybridisation[J].Ann Rheum Dis,1994;53(1):45-50.

    22 Sano H,Engleka K,Mathern Petal.Coexpression of phosphotyrosinecontaining proteins,platelet-derived growth factor-B,and fibroblast growth factor-1 in situ in synovial tissues of patients with rheumatoid arthritisand Lewis ratswith adjuvant or streptococcal cellwall arthritis[J].JClin Invest,1993;91(2):553-565.

    23 Shiozawa S,Shiozawa K,Tanaka Yetal.Human epidermal growth factor for the stratification of synovial lining layer and neovascularisation in rheumatoid arthritis[J].Ann Rheum Dis,1989;48(10):820-828.

    [收稿2009-11-08]

    (編輯 張曉舟)

    Cyr61 promotes proliferation of fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis and its regulation by inflammatory factor

    LINJin-Piao,WUJuan-Juan,WANGLi,ZOUJing,SHENBai-Hua,LINing-Li.ShanghaiInstituteofImmunology,ShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200025,China

    Objective:To investigate the effectof Cyr61 on the proliferation of Fibroblast-like Synoviocytes(FLS)in rheumatoid arthritis(RA).Methods:Cyr61 expression in synovial tissues(ST)and FLSwas examined using Real-time PCR,Westernb lot and immunohistochemistry simultaneously.FLSwere isolated from synovial tissueof RA patients and cultured in vitro.The proliferation of FLSstimulated with synovial fluid(SF)was determined by3H-TdR incorporation.Cyr61 protein level in RA SF was detected by ELISA.Results:Cyr61 was over expressed in ST,FLSof RA patientswhilehardly examined in normal individuals and osterarthritis(OA)patients.Meanwhile,Cy r61 protein level was elevated in SF,which promoted the proliferation of RA FLS.This proliferation was abrogated by knockdown the Cyr61 gene of FLS or neutralizingmonoclonal antibody againsthuman Cyr61.Moreover,inflammatory factor IFN-γand TNF-αup-regulated the expressionof Cyr61.Conclusion:These results indicate that the elevated level of IFN-γand TNF-αin RA SF can promote the proliferation of the FLS derived from RA patients by increasing expression of Cyr61,suggesting that Cyr61may play an important role in the development of RA.

    Rheumatoid arthritis;Synovium fu lid,Cyr61;Fibroblast-like synoviocytes;TNF-α/IFN-γ

    R392

    A

    1000-484X(2010)03-0264-06

    ①本文受?chē)?guó)家自然基金(30872990)、863項(xiàng)目(2008AA02Z429)、上海市科委(08JC1413200)、上海市教委(J50207)、仁濟(jì)醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院合作研究基金項(xiàng)目(PY07011)資助

    ②上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室,上海200025

    ③上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院呼吸科,上海200025

    林錦驃(1985年-),男,在讀碩士,主要從事自身免疫與免疫調(diào)節(jié)研究,E-mail:jinpiaolin@yahoo.com.cn;

    及指導(dǎo)教師:李寧麗(1957年-),女,博士,教授,主要從事自身免疫與免疫調(diào)節(jié)研究,E-mail:ninglixiaoxue57@yahoo.com.cn。

    猜你喜歡
    滑膜細(xì)胞因子抗體
    基于滑膜控制的船舶永磁同步推進(jìn)電機(jī)直接轉(zhuǎn)矩控制研究
    高層建筑施工中的滑膜施工技術(shù)要點(diǎn)探討
    抗GD2抗體聯(lián)合細(xì)胞因子在高危NB治療中的研究進(jìn)展
    抗BP5-KLH多克隆抗體的制備及鑒定
    急性心肌梗死病人細(xì)胞因子表達(dá)及臨床意義
    滑膜肉瘤的研究進(jìn)展
    細(xì)胞因子在慢性腎缺血與腎小管-間質(zhì)纖維化過(guò)程中的作用
    乙肝抗體從哪兒來(lái)
    肝博士(2015年2期)2015-02-27 10:49:44
    Galectin-7多克隆抗體的制備與鑒定
    原發(fā)性肺滑膜肉瘤診斷與治療——附一例報(bào)告及文獻(xiàn)復(fù)習(xí)
    亚洲国产精品专区欧美| 91成人精品电影| 亚州av有码| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 少妇高潮的动态图| 赤兔流量卡办理| 好男人视频免费观看在线| 亚洲精品乱久久久久久| 一区二区三区精品91| 99国产精品免费福利视频| 久久狼人影院| 精品一区二区三卡| 中文字幕亚洲精品专区| 免费观看性生交大片5| 国产精品一区二区在线不卡| 精品人妻偷拍中文字幕| 国产精品99久久久久久久久| 97超碰精品成人国产| 国产免费又黄又爽又色| 一本久久精品| 一区二区av电影网| 伊人亚洲综合成人网| 精品熟女少妇av免费看| 久久久国产精品麻豆| 超碰97精品在线观看| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 人人妻人人澡人人看| 国产高清不卡午夜福利| 午夜福利,免费看| 日本黄色片子视频| 老司机影院成人| 国产精品三级大全| 91久久精品电影网| 欧美激情国产日韩精品一区| videos熟女内射| 一级黄片播放器| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 夫妻午夜视频| 视频区图区小说| 久久热精品热| 亚洲av二区三区四区| 亚洲丝袜综合中文字幕| 亚洲国产成人一精品久久久| 日韩亚洲欧美综合| 国产综合精华液| 91久久精品国产一区二区三区| 黄色欧美视频在线观看| 美女视频免费永久观看网站| 在线免费观看不下载黄p国产| 观看美女的网站| 久久ye,这里只有精品| av播播在线观看一区| 国产精品99久久久久久久久| av视频免费观看在线观看| 午夜影院在线不卡| 乱码一卡2卡4卡精品| 国产精品一二三区在线看| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 美女福利国产在线| 在线观看免费高清a一片| 久久久国产精品麻豆| 韩国高清视频一区二区三区| 亚洲精品av麻豆狂野| 最近中文字幕高清免费大全6| 国产成人a∨麻豆精品| 最近最新中文字幕免费大全7| 人妻夜夜爽99麻豆av| 看免费成人av毛片| 久久久久久久久久成人| 久久这里有精品视频免费| 蜜桃在线观看..| 欧美人与善性xxx| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 夜夜爽夜夜爽视频| 精品人妻一区二区三区麻豆| 丝瓜视频免费看黄片| 国产 精品1| 国产精品熟女久久久久浪| 免费日韩欧美在线观看| 国产老妇伦熟女老妇高清| 丝袜美足系列| 国产极品天堂在线| .国产精品久久| 亚洲av二区三区四区| 色网站视频免费| 欧美变态另类bdsm刘玥| 亚洲少妇的诱惑av| 香蕉精品网在线| 狂野欧美激情性bbbbbb| 久久久久精品性色| 国产在视频线精品| 中文字幕av电影在线播放| 99热网站在线观看| 久久精品国产自在天天线| 国产成人精品久久久久久| www.av在线官网国产| 国产精品人妻久久久久久| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 草草在线视频免费看| 91aial.com中文字幕在线观看| 人妻夜夜爽99麻豆av| 国产av码专区亚洲av| 久久久久久久久久久免费av| 中国美白少妇内射xxxbb| 一级毛片aaaaaa免费看小| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 久久久久久人妻| 亚洲精品456在线播放app| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 午夜91福利影院| 国产av国产精品国产| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 69精品国产乱码久久久| 久久99精品国语久久久| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕 | 日韩 亚洲 欧美在线| 黄片播放在线免费| 国产高清国产精品国产三级| 最近中文字幕高清免费大全6| 十分钟在线观看高清视频www| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 国产精品人妻久久久影院| 国产高清国产精品国产三级| 久久青草综合色| 2018国产大陆天天弄谢| 国产男女超爽视频在线观看| 精品一品国产午夜福利视频| 久热这里只有精品99| 午夜福利,免费看| 色网站视频免费| 夜夜爽夜夜爽视频| 美女视频免费永久观看网站| 久久精品久久久久久久性| 免费黄网站久久成人精品| 久久99热6这里只有精品| 亚洲人成网站在线播| 久热这里只有精品99| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 在线观看一区二区三区激情| av在线老鸭窝| 十八禁高潮呻吟视频| 高清毛片免费看| 另类精品久久| 秋霞在线观看毛片| 晚上一个人看的免费电影| 99热6这里只有精品| 99九九在线精品视频| 亚洲综合色网址| 爱豆传媒免费全集在线观看| 亚洲欧洲国产日韩| 国产成人免费观看mmmm| 亚洲av免费高清在线观看| 国产极品粉嫩免费观看在线 | 久久久久久伊人网av| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 爱豆传媒免费全集在线观看| 日韩中文字幕视频在线看片| 成人影院久久| 日韩三级伦理在线观看| 国产一区二区在线观看av| 精品一区二区免费观看| 精品一区二区免费观看| 一级毛片 在线播放| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 亚洲精品色激情综合| 精品久久蜜臀av无| 一级片'在线观看视频| 午夜激情久久久久久久| 国国产精品蜜臀av免费| 国产亚洲最大av| 丰满迷人的少妇在线观看| 国产精品一区二区在线不卡| 欧美性感艳星| 在线观看美女被高潮喷水网站| 黄片播放在线免费| 久久久久久久精品精品| 91精品国产国语对白视频| 一本大道久久a久久精品| av不卡在线播放| 午夜91福利影院| 在线免费观看不下载黄p国产| 精品亚洲成国产av| 久久久久久久久久成人| 成年av动漫网址| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 亚洲不卡免费看| 蜜桃在线观看..| 两个人的视频大全免费| 国产国语露脸激情在线看| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 精品久久久久久电影网| 色婷婷av一区二区三区视频| 亚洲,一卡二卡三卡| 国产成人aa在线观看| 丁香六月天网| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 日日啪夜夜爽| 18禁观看日本| 亚洲不卡免费看| 国产午夜精品一二区理论片| 波野结衣二区三区在线| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 日本黄大片高清| 日韩人妻高清精品专区| 又大又黄又爽视频免费| 亚洲熟女精品中文字幕| 精品久久久久久久久av| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 久久精品久久精品一区二区三区| 精品国产国语对白av| 免费黄色在线免费观看| 亚洲av在线观看美女高潮| 亚洲三级黄色毛片| 岛国毛片在线播放| 国产极品天堂在线| 国产精品欧美亚洲77777| 天堂8中文在线网| 国产综合精华液| 日日摸夜夜添夜夜爱| 春色校园在线视频观看| 中文字幕亚洲精品专区| 18+在线观看网站| 亚洲欧美成人精品一区二区| 久热这里只有精品99| 在线播放无遮挡| 最近中文字幕2019免费版| a级毛片在线看网站| www.色视频.com| 国产精品一区二区在线不卡| 在线观看国产h片| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 日日爽夜夜爽网站| 热99国产精品久久久久久7| 久久精品国产亚洲网站| 99久久人妻综合| 日韩一区二区视频免费看| 伊人久久精品亚洲午夜| 91久久精品电影网| 中文欧美无线码| 我的女老师完整版在线观看| av一本久久久久| 日日摸夜夜添夜夜爱| 男人爽女人下面视频在线观看| 亚洲av综合色区一区| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 天天影视国产精品| 久久狼人影院| 国产欧美亚洲国产| 日本与韩国留学比较| 久久久久人妻精品一区果冻| 在现免费观看毛片| 老司机影院成人| 99热全是精品| 女性被躁到高潮视频| 热99国产精品久久久久久7| 老女人水多毛片| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 亚洲av中文av极速乱| 99热国产这里只有精品6| 欧美另类一区| 免费观看的影片在线观看| 久久久久久久久久久丰满| 精品酒店卫生间| 2022亚洲国产成人精品| 精品久久久久久久久亚洲| 街头女战士在线观看网站| 国产一区亚洲一区在线观看| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 老司机影院成人| 亚洲精品中文字幕在线视频| 欧美精品高潮呻吟av久久| 性高湖久久久久久久久免费观看| 亚洲精品,欧美精品| 九色成人免费人妻av| 五月天丁香电影| 人妻 亚洲 视频| 久久热精品热| 久久久国产一区二区| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| av国产久精品久网站免费入址| 久久久久久人妻| 午夜视频国产福利| 亚洲人成77777在线视频| av播播在线观看一区| 观看美女的网站| 特大巨黑吊av在线直播| 少妇高潮的动态图| 91国产中文字幕| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕 | 日韩电影二区| 久久热精品热| 色哟哟·www| 国产精品人妻久久久影院| xxxhd国产人妻xxx| 国产精品99久久99久久久不卡 | 国产色婷婷99| 九九在线视频观看精品| 精品久久久久久久久亚洲| 夫妻午夜视频| 国产av国产精品国产| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 美女视频免费永久观看网站| 久久久国产欧美日韩av| 久久久久国产网址| 最新的欧美精品一区二区| 国产男人的电影天堂91| 精品国产国语对白av| 晚上一个人看的免费电影| 亚洲欧美成人精品一区二区| 成人毛片60女人毛片免费| 亚洲国产精品专区欧美| 亚洲色图综合在线观看| 99热这里只有是精品在线观看| 中文字幕久久专区| 大陆偷拍与自拍| 国产黄色免费在线视频| 久久久国产一区二区| 我要看黄色一级片免费的| 日韩视频在线欧美| 欧美精品一区二区大全| 午夜av观看不卡| 日韩制服骚丝袜av| 国产日韩一区二区三区精品不卡 | 亚洲国产色片| 在线观看免费视频网站a站| 亚洲精品自拍成人| 久久久久久伊人网av| 免费av中文字幕在线| 曰老女人黄片| av在线老鸭窝| 日韩一本色道免费dvd| 久久久久人妻精品一区果冻| 久久午夜福利片| 精品一区二区三区视频在线| 性色av一级| 免费看不卡的av| 大香蕉久久成人网| 一二三四中文在线观看免费高清| 亚洲av在线观看美女高潮| 天堂中文最新版在线下载| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 成人国产av品久久久| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 亚洲av欧美aⅴ国产| 97在线视频观看| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 日本黄色日本黄色录像| 精品久久久久久电影网| 一级毛片我不卡| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 熟女av电影| 国产极品粉嫩免费观看在线 | 成人无遮挡网站| 如何舔出高潮| 久久国产精品大桥未久av| 精品久久蜜臀av无| 久久人人爽人人片av| 久久精品国产亚洲av涩爱| 久久久午夜欧美精品| 精品久久蜜臀av无| 国精品久久久久久国模美| 熟妇人妻不卡中文字幕| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 美女国产高潮福利片在线看| 欧美一级a爱片免费观看看| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 国产日韩欧美在线精品| 久久久久久久久久久久大奶| 男女国产视频网站| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 人妻一区二区av| 久久99精品国语久久久| 国产成人免费无遮挡视频| 久久久a久久爽久久v久久| 人妻夜夜爽99麻豆av| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 欧美激情 高清一区二区三区| 婷婷色麻豆天堂久久| 久久影院123| 国产亚洲一区二区精品| 亚洲久久久国产精品| 一区在线观看完整版| 日日摸夜夜添夜夜爱| 亚洲国产精品国产精品| 在线天堂最新版资源| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 国产精品一区www在线观看| 国产又色又爽无遮挡免| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 青青草视频在线视频观看| 亚洲国产成人一精品久久久| 国产精品一区二区在线观看99| 亚洲av男天堂| 大香蕉97超碰在线| 欧美97在线视频| 男的添女的下面高潮视频| 日韩强制内射视频| 亚洲精品456在线播放app| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 搡女人真爽免费视频火全软件| 亚洲成人手机| 亚洲精品久久成人aⅴ小说 | 国产成人91sexporn| 99久久精品国产国产毛片| 蜜桃在线观看..| 人人妻人人澡人人看| a级毛片黄视频| 男女无遮挡免费网站观看| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 色视频在线一区二区三区| 午夜精品国产一区二区电影| 亚洲av日韩在线播放| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 少妇精品久久久久久久| 成人手机av| 婷婷色综合www| 成年av动漫网址| 国产成人精品久久久久久| 国产综合精华液| 精品一品国产午夜福利视频| 成人国产麻豆网| 最近2019中文字幕mv第一页| 免费高清在线观看日韩| 精品久久国产蜜桃| 久久99热6这里只有精品| 十八禁网站网址无遮挡| 如日韩欧美国产精品一区二区三区 | 日韩制服骚丝袜av| 国产乱来视频区| 国产免费福利视频在线观看| 国精品久久久久久国模美| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 两个人的视频大全免费| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 婷婷色av中文字幕| 久久久精品免费免费高清| 成人国产麻豆网| 精品卡一卡二卡四卡免费| 亚洲av在线观看美女高潮| 成人手机av| 国产精品一区www在线观看| .国产精品久久| 欧美国产精品一级二级三级| 麻豆乱淫一区二区| 国产成人精品在线电影| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 大香蕉久久成人网| 人妻人人澡人人爽人人| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 久久亚洲国产成人精品v| 视频区图区小说| 热re99久久精品国产66热6| 国产免费一级a男人的天堂| 国产在视频线精品| 久久久国产精品麻豆| 一级毛片电影观看| 伊人久久国产一区二区| av网站免费在线观看视频| 91久久精品国产一区二区成人| av视频免费观看在线观看| av免费在线看不卡| 99热全是精品| 成年人免费黄色播放视频| 亚洲综合色网址| 18禁动态无遮挡网站| 人成视频在线观看免费观看| 91在线精品国自产拍蜜月| 精品亚洲成a人片在线观看| 亚洲精品亚洲一区二区| 99久久综合免费| 久久这里有精品视频免费| 免费观看a级毛片全部| 亚洲精品国产av成人精品| 91精品一卡2卡3卡4卡| 女人精品久久久久毛片| 久久精品国产亚洲网站| 久久精品国产自在天天线| 亚洲精品日本国产第一区| 国产欧美亚洲国产| 亚洲欧洲日产国产| 国产在线一区二区三区精| freevideosex欧美| 午夜福利影视在线免费观看| 亚洲无线观看免费| av又黄又爽大尺度在线免费看| 美女视频免费永久观看网站| 国产成人精品无人区| 国产免费视频播放在线视频| 午夜免费观看性视频| 国产国语露脸激情在线看| 国产黄色视频一区二区在线观看| 伦理电影大哥的女人| 色哟哟·www| 久久久a久久爽久久v久久| a级毛片在线看网站| 午夜老司机福利剧场| 亚洲中文av在线| 黄片播放在线免费| 在线播放无遮挡| 大片电影免费在线观看免费| av在线老鸭窝| 久久久久久久久大av| 丝瓜视频免费看黄片| 免费人妻精品一区二区三区视频| 亚洲欧美清纯卡通| 国产欧美亚洲国产| 国产视频首页在线观看| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 我要看黄色一级片免费的| 国产男女超爽视频在线观看| 日日摸夜夜添夜夜爱| 国产精品不卡视频一区二区| 亚洲精品色激情综合| 久久久久久久久久久丰满| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 亚洲精品456在线播放app| freevideosex欧美| 亚洲人与动物交配视频| 91久久精品电影网| 久久国内精品自在自线图片| 少妇高潮的动态图| 亚洲色图综合在线观看| 国产精品人妻久久久久久| 黑人高潮一二区| 久久精品国产亚洲av天美| 亚洲天堂av无毛| 天堂俺去俺来也www色官网| 中文天堂在线官网| 在线 av 中文字幕| 国产免费一级a男人的天堂| 日本欧美国产在线视频| 精品熟女少妇av免费看| 能在线免费看毛片的网站| 免费大片黄手机在线观看| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 成人综合一区亚洲| 精品午夜福利在线看| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 久久久久久伊人网av| 亚洲少妇的诱惑av| 美女国产视频在线观看| 久久久久久久国产电影| 国产精品一国产av| 欧美丝袜亚洲另类| 大香蕉久久成人网| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 成人手机av| 91精品国产九色| 国产一区二区在线观看日韩| 亚洲成人一二三区av| 国产黄频视频在线观看| 亚洲人与动物交配视频| 大话2 男鬼变身卡| 亚洲精品国产av成人精品| 国产欧美亚洲国产| 日本vs欧美在线观看视频| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 人人澡人人妻人| 亚洲第一av免费看| 在线观看三级黄色| 亚洲丝袜综合中文字幕| 国产精品免费大片| 久久狼人影院| 亚洲综合色网址| 免费人成在线观看视频色| 国产精品免费大片| 日韩电影二区| 在线观看三级黄色| 一级毛片aaaaaa免费看小| 欧美国产精品一级二级三级| 精品视频人人做人人爽| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 午夜视频国产福利| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 亚洲丝袜综合中文字幕| 大片电影免费在线观看免费| 在线观看免费视频网站a站| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 人妻 亚洲 视频| a级毛片免费高清观看在线播放| av视频免费观看在线观看| 男女国产视频网站| 亚洲精品一二三| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 久久精品国产亚洲av涩爱| 91在线精品国自产拍蜜月| 亚洲精品美女久久av网站| 91在线精品国自产拍蜜月| 久久久久国产网址| 91精品伊人久久大香线蕉| 波野结衣二区三区在线| 最后的刺客免费高清国语| 高清午夜精品一区二区三区| 久久国内精品自在自线图片| 大话2 男鬼变身卡| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 国产成人精品无人区| 国产成人aa在线观看| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 啦啦啦啦在线视频资源| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 |