下調(diào)HMGA2基因表達(dá)對改善骨肉瘤U2OS細(xì)胞惡性表型的實(shí)驗(yàn)研究①

曲珊珊 李榮貴 張海英 王 洋 史艷芬 呂 慧 李玉林

（吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院病理生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,長春 130021）

下調(diào)HMGA2基因表達(dá)對改善骨肉瘤U2OS細(xì)胞惡性表型的實(shí)驗(yàn)研究①

曲珊珊 李榮貴 張海英 王 洋 史艷芬 呂 慧 李玉林

（吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院病理生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,長春 130021）

目的:研究HMGA2表達(dá)在維持人骨肉瘤U2OS細(xì)胞惡性表型中的作用,為基因靶向治療提供理論依據(jù)。方法:采用基于DNA的shRNA表達(dá)載體HMGA2-shRNA,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人骨肉瘤U2OS細(xì)胞,下調(diào)其HMGA2表達(dá)水平,并應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測其對HMGA2基因的沉默效果;經(jīng)Cell Counting Kit-8（CCK8）測定、Hoechst33342染色熒光顯微鏡觀察及Boyden小室法分別檢測細(xì)胞增殖、凋亡及遷移情況;實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測m RNAs表達(dá)水平。結(jié)果:穩(wěn)定轉(zhuǎn)染靶向HMGA2的shRNA可特異性下調(diào)U2OS細(xì)胞HMGA2mRNA表達(dá)水平;其作用結(jié)果使細(xì)胞的增殖和遷移能力受到明顯抑制,自發(fā)凋亡率及Caspase 3和Caspas 9基因表達(dá)水平顯著升高。結(jié)論:HMGA2基因異常表達(dá)在維持人骨肉瘤U2OS細(xì)胞惡性表型中起重要作用,靶向HMGA2的基因治療可能為骨肉瘤治療帶來新希望。

HMGA2基因;shRNA;骨肉瘤U2OS;細(xì)胞增殖;細(xì)胞凋亡

骨肉瘤發(fā)病率快速增長并趨于年輕化,惡性程度高,預(yù)后差,化療或放療效果欠佳,可于數(shù)月內(nèi)出現(xiàn)肺部轉(zhuǎn)移。因此,尋找骨肉瘤有效的治療方法是骨腫瘤研究的焦點(diǎn),靶向基因治療被認(rèn)為是最佳的治療方法之一,尋找有效的治療靶基因極為重要。高遷移率族蛋白A2（Highmobility group A2,HMGA 2）是HMGA家族成員之一,可選擇性結(jié)合到DNA特異構(gòu)像中,調(diào)節(jié)復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及DNA修復(fù)。HMGA2是胚胎發(fā)育期表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子,在正常成人組織中幾乎無表達(dá)。但在一些惡性腫瘤中則呈現(xiàn)高表達(dá),例如乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、胰腺癌、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、鱗狀細(xì)胞癌等[1-5],提示其在腫瘤細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中起重要作用[6]。越來越多的研究顯示,在白血病和一些實(shí)體惡性腫瘤細(xì)胞群體中只有一少部分細(xì)胞具有形成新腫瘤的能力而被稱之為腫瘤起始細(xì)胞（Tumor initiating cells,TIC）或癌腫干細(xì)胞（Cancer stem cell,CSC）。CSC對化療、放療均不敏感,是惡性腫瘤難以治愈、早期轉(zhuǎn)移及容易復(fù)發(fā)的根源[7]。研究表明,HMGA2和H-Ras基因的高表達(dá)抑制乳腺癌干細(xì)胞分化,而利于其自我更新的維持[8]。miRNAs let-7通過抑制兩者的表達(dá),促使乳腺癌干細(xì)胞分化,達(dá)到治療乳腺癌的目的[8]。關(guān)于HMGA2在人骨肉瘤細(xì)胞的表達(dá)及作用的研究則尚少見報(bào)道。本研究擬通過靶向HMGA2的shRNA真核表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人骨肉瘤U2OS細(xì)胞,觀察其對U2OS細(xì)胞惡性表型的影響,為骨肉瘤的HMGA2靶向基因治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料、儀器 U2OS細(xì)胞株為吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系保存。DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司;優(yōu)級胎牛血清購自北京元亨金馬生物公司;LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司;Trizol試劑盒、RT-PCR試劑盒購自Takara公司;Cell Counting Kit-8（CCK8）為日本 Dojindo公司產(chǎn)品;Hoechst33342細(xì)胞凋亡試劑盒購自鼎國生物科技公司;Boyden小室為美國BD公司產(chǎn)品;鼠尾膠原Ⅰ型購自Sigma公司;2×SYBR GreenⅠ試劑購自ABI公司。Real time-PCR儀為美國ABI7300。

1.2 靶向HMGA2的shRNA真核表達(dá)載體HMGA 2-shRNA的構(gòu)建根據(jù)GeneBank中HMGA2人全長cDNA序列（No.003483）,參考文獻(xiàn)[9],選取特異性序列 5′-CGCCAACGTTCGATTTCAT-3′為干擾作用的靶點(diǎn),加入9 bp的loop環(huán)結(jié)構(gòu),設(shè)計(jì)模板為Sence+Loop+Antisence,退火后插入pGenesil質(zhì)粒（含GFP熒光蛋白及G418篩選標(biāo)志）,形成shRNA表達(dá)載體（HMGA2-shRNA）, 其 序 列 為 :5′-CGCCAACGTTCGATTTCATTTCAAGAGATAGAAATCGAACGTTGGCG-3′。另行設(shè)計(jì)一條與人的任何基因序列均無同源關(guān)系的隨機(jī)亂碼scrambled DNA序列,其形成的shRNA不對任何人源mRNA進(jìn)行干擾。上述質(zhì)粒載體由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司構(gòu)建。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 人骨肉瘤U2OS細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,置于37℃、5%CO2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前一天接種細(xì)胞于24孔板,每孔5×104個(gè)細(xì)胞。具體操作步驟按Lipofectamine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑廠家說明書進(jìn)行,分別將HMGA2-shRNA及scrambled載體轉(zhuǎn)染U2OS細(xì)胞。將轉(zhuǎn)染細(xì)胞按照25個(gè)細(xì)胞/m l密度接種于6孔板內(nèi),每孔 2m l細(xì)胞懸液,并以600μg/L的G418進(jìn)行篩選,2周后胰酶消化法挑取轉(zhuǎn)染成功的克隆,獲得克隆株。

1.4 RNA提取及RT-PCR 分別按照產(chǎn)品說明書,應(yīng)用Trizol試劑提取細(xì)胞總 RNA;RT-PCR試劑盒（Two-Step Reverse Transcription-PCR法）分析HMGA2 mRNA。反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性2分鐘;94℃變性30秒,54℃退火30秒,72℃延伸30秒,循環(huán)30次;最后72℃延伸5分鐘。RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離后紫外燈下觀察并用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描和圖像分析。凋亡相關(guān)基因表達(dá)分析采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR（SYBRGreen法）進(jìn)行。反應(yīng)程序?yàn)?50℃2分鐘;95℃10分鐘;92℃10秒,60℃30秒,共50個(gè)循環(huán)。上述引物由上海生工生物工程公司合成,見表1。

1.5 細(xì)胞生長曲線測定 采用CCK8試劑盒檢測各組細(xì)胞增殖反應(yīng)。取指數(shù)生長期細(xì)胞,以1×103細(xì)胞/孔接種于96孔板,100μl/孔,按照實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行標(biāo)記,每組 6個(gè)復(fù)孔,于接種 1天、2天、3天、4天、5天、6天每孔加入CCK8液10μl,置于 37℃、5%CO2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)1小時(shí),室溫下振蕩5min,靜置10分鐘;酶標(biāo)儀490 nm處測定吸光度,繪制細(xì)胞生長曲線。

1.6 細(xì)胞凋亡檢測 采用Hoechst33342熒光染色法檢測各組細(xì)胞凋亡。呈指數(shù)生長期的細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后,收集每組細(xì)胞（1 000 r/min,離心5分鐘）,PBS洗2次,調(diào)整細(xì)胞密度為1×105細(xì)胞/m l,Hoechst33342（10mg/L）避光染色10分鐘,取10μl細(xì)胞懸液涂片室溫干燥后,4%多聚甲醛固定10分鐘,然后PBS洗2次,室溫干燥,熒光顯微鏡350 nm波長下觀察并拍照。

1.7 細(xì)胞遷移測定 采用Boyden小室（孔徑為8 μm）測定各組細(xì)胞遷移。用0.1%鼠尾膠原Ⅰ型溶液包被Boyden小室,37℃結(jié)合1小時(shí)之后棄去溶液4℃保存。無血清培養(yǎng)基水化Boyden小室10分鐘,再以含1%血清的培養(yǎng)基水化90分鐘。常規(guī)胰酶消化各組細(xì)胞,PBS洗2次,無血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為5×104細(xì)胞/ml,6孔板內(nèi)加入3T3細(xì)胞條件培養(yǎng)基1.6ml/孔,將 Boyden小室置于其內(nèi),上室加入800μl細(xì)胞懸液,于37℃,5%CO2條件下培養(yǎng)2.5小時(shí),棄去上室培養(yǎng)基,4%多聚甲醛溶液固定20分鐘,HE染色,用生理鹽水棉簽輕輕拭去小室上層的細(xì)胞,倒置顯微鏡下觀察,200×視野下選取5個(gè)不重復(fù)視野照相,并數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)量。

表1 PCR擴(kuò)增所用引物及序列Tab.1 Primer sequence used for the PCR amp lification

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)采用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,所得結(jié)果用±s表示,采用方差分析,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染HMGA2-shRNA可下調(diào)U2OS細(xì)胞HMGA2 mRNA表達(dá) 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示,各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞樣本均可在250 bp處見亮度一致的β-actin條帶。在未轉(zhuǎn)染組和scrambled組可在270 bp處見明顯的HMGA2目的條帶,而轉(zhuǎn)染HMGA2-shRNA組HMGA2表達(dá)明顯受到抑制,經(jīng)灰度值測定HMGA2 mRNA下調(diào)達(dá)60%～75%（圖1）。

2.2 轉(zhuǎn)染HMGA2-shRNA可抑制U2OS細(xì)胞增殖細(xì)胞生長曲線顯示,未轉(zhuǎn)染組和scrambled組細(xì)胞生長無顯著差異,轉(zhuǎn)染HMGA 2-shRNA質(zhì)粒的U2OS細(xì)胞生長緩慢,生長受到明顯的抑制,4、5和6天的細(xì)胞數(shù)均明顯低于scrambled組（P＜0.05）（圖2）。

圖1 HMGA2-shRNA下調(diào)U2OS細(xì)胞HMGA2 mRNA表達(dá)的RT-PCR結(jié)果Fig.1 Result of down regulation of HMGA2m RNA exp ression in U2OS cells transfected with HMGA2-shRNA

2.3 轉(zhuǎn)染HMGA2-shRNA可促進(jìn)U2OS細(xì)胞凋亡熒光顯微鏡下觀察可見,與未轉(zhuǎn)染組和scrambled組相比,轉(zhuǎn)染HMGA2-shRNA組U2OS細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增加。凋亡細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞核濃縮及細(xì)胞核碎裂等典型改變,未轉(zhuǎn)染組和scrambled組細(xì)胞無顯著細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變,代表性的圖片如圖3所示。

2.4 轉(zhuǎn)染HMGA 2-shRNA可降低U2OS細(xì)胞遷移能力 Boyden小室遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,細(xì)胞在接種2.5小時(shí)后,未轉(zhuǎn)染組和scrambled組遷移細(xì)胞數(shù)分別為（118±22.1）個(gè)和（96±18.6）個(gè),兩者無顯著差異,而HMGA2-shRNA組細(xì)胞移至微孔膜下層的細(xì)胞數(shù)為（47±11.9）個(gè),與scrambled組相比遷移細(xì)胞數(shù)明顯減少,差異顯著（P＜0.01,圖4）。

2.5 轉(zhuǎn)染HMGA2-shRNA對細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響 與未轉(zhuǎn)染組和scrambled組比較,轉(zhuǎn)染HMGA2-shRNA組U2OS細(xì)胞的凋亡基因Caspase 3和Caspase 9mRNA表達(dá)水平上調(diào)（圖5）。

圖2 HMGA2-shRNA抑制U2OS細(xì)胞生長Fig.2 Proliferation of U2OS cells transfected with HMGA2-shRNA was inhibited

圖3 各組U2OS細(xì)胞的凋亡熒光顯微鏡觀察圖（Hoechst33342熒光染色,×200）Fig.3 The apop tosis of U2OS cells（Hoechst33342 fluorescent staining,×200）

圖4 HMGA2-shRNA降低U2OS細(xì)胞遷移能力（×200）Fig.4 Themigratory ability of U2OS cells transfected with HMGA2-shRNA was degraded（×200）

圖5 轉(zhuǎn)染HMGA2-shRNA對U2OS細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.5 Effect of HMGA2-shRNA on exp ression of apoptosis related gene in U2OS cells transfected with HMGA2-shRNA

3 討論

本研究結(jié)果顯示,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染靶向HMGA2的shRNA表達(dá)載體有效地下調(diào)了U2OS細(xì)胞中HMGA 2 mRNA水平,但不影響β-actin的表達(dá)水平,表明其沉默基因表達(dá)的特異性。表達(dá)質(zhì)粒介導(dǎo)的shRNA在人骨肉瘤細(xì)胞的持續(xù)表達(dá)及對靶向基因的特異負(fù)向調(diào)控,提示這一技術(shù)在骨肉瘤治療中具有可行性。本研究特異下調(diào)HMGA2表達(dá)引起U2OS細(xì)胞增殖和遷移能力的明顯抑制,顯示HMGA 2的異常高表達(dá)對該細(xì)胞增殖和遷移能力的維持具有十分重要作用。細(xì)胞增殖能力是決定惡性腫瘤生長速度的關(guān)鍵因素,而腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移力則決定于腫瘤細(xì)胞遷移能力。上述結(jié)果提示,HMGA2的表達(dá)失調(diào)可能是導(dǎo)致骨肉瘤惡性程度高、侵襲能力強(qiáng)、病程進(jìn)展快和容易早期轉(zhuǎn)移的主要原因。本研究結(jié)果中,下調(diào)HMGA 2表達(dá)也引起U2OS細(xì)胞凋亡的明顯增加,表明其異常表達(dá)可能也參與了U2OS細(xì)胞逃逸免疫監(jiān)視功能有關(guān)。細(xì)胞凋亡是機(jī)體清除突變細(xì)胞維持自身穩(wěn)定的重要機(jī)制,腫瘤細(xì)胞通過避免細(xì)胞凋亡及免疫機(jī)制的監(jiān)控才得以生存?；熕幬镆捕嗍峭ㄟ^誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以來達(dá)到治療目的。獲得對藥物誘導(dǎo)凋亡的抗性是多數(shù)惡性腫瘤對化療藥物治療不敏感的根本原因。總之,本研究結(jié)果表明HMGA2的異常高表達(dá)在維持U2OS細(xì)胞惡性表型的多方面發(fā)揮作用,提示靶向HMGA2的基因療法在臨床骨肉瘤的治療中具有很好的應(yīng)用前景。

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[收稿2009-12-19]

（編輯 許四平）

Down regulation of HMGA2 expression changesmalignant phenotypes themalignant phenotype of human osteosarcoma U2OS cells

QUShan-Shan,LIRong-Gui,ZHANGHai-Ying,WANGYang,SHIYan-Fen,LüHui,LIYu-Lin.KeyLaboratoryof Pathobiology,MinistryofEducation,SchoolofBasicMedicalScience,JilinUniversity,Changchun130021,China

Objective:The roles of HMGA2 inmaintainingmalignantphenotypes of theosteosarcoma U2OS cellswas studied to explore the possibilities for it to be developed as a target for gene therapy.Methods:U2OS cellswere stab ly transfectedwith a DNA based shRNA expression vectorwhich targeted to HMGA2.The exp ression of HMGA2mRNA was proved by RT-PCR;Cell growth,migration and apoptosiswere determined with CCK8,hoechst33342 staining and Boyden ventricle,respectively.ThemRNA levels of Caspase 3 and Caspase 9 were determined by real time quantitative RT-PCR.Results:The transfectionwith shRNA exp ression vector significantly decreased HMGA2m RNA levels of U2OS cells.Cellgrow th andm igration were decreased,but apoptosis and themRNA levels of Caspase 3 and Caspas 9were increased following the decrease of HMGA2m RNA.Conclusion:The abnormal expression of HMGA2 plays an important role inmaintaining themalignant phenotypes of U2OS cells.Gene therapy targeted to HMGA2 could be helpfu l in the treatmentof human osteosarcoma.

HMGA 2;shRNA;U20S;Proliferation;Apoptosics

R730

A

1000-484X（2010）03-0228-04

①本文為國家自然科學(xué)基金（30872193）

曲珊珊（1980年-）,女,在讀博士,主要從事腫瘤生物學(xué)研究;

及指導(dǎo)教師:李榮貴（1952年-）,男,教授,博士生導(dǎo)師,主要從事腫瘤分子病理學(xué)研究。