大鼠神經(jīng)干細(xì)胞中MAPKK/MEK-MAPK/ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的實(shí)驗(yàn)研究

趙宇，謝鵬，朱曉峰，蔡志友

（1.重慶醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，重慶 400016；2.佳木斯大學(xué) 神經(jīng)科學(xué)研究所，黑龍江 佳木斯 154007）

大鼠神經(jīng)干細(xì)胞中MAPKK/MEK-MAPK/ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的實(shí)驗(yàn)研究

趙宇1，謝鵬1，朱曉峰2，蔡志友1

（1.重慶醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，重慶 400016；2.佳木斯大學(xué) 神經(jīng)科學(xué)研究所，黑龍江 佳木斯 154007）

目的 應(yīng)用絲裂原激活的蛋白激酶激酶（MAPKK/MEK）特異性阻滯劑PD98059孵育大鼠神經(jīng)干細(xì)胞（NSC），探討MAPKK/MEK-MAPK/ERK信號(hào)通路在NSC中的作用。方法 體外分離、培養(yǎng)大鼠NSC，應(yīng)用不同濃度的PD98059孵育NSC后進(jìn)行WTS-8、Nestin，BrdU、β-tubulin-Ⅲ、Western blot檢測(cè)。結(jié)果 PD98059對(duì)NSC的存活、增殖和分化的影響呈劑量依賴性，在PD98059較高濃度時(shí)NSC的存活率明顯下降（P<0.05），BrdU和β-tubulin-Ⅲ的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯少于正常對(duì)照組（P<0.05）。PD98059阻斷ERK表達(dá)的作用呈劑量依賴性。結(jié)論 MAPKK/MEK-MAPK/ERK信號(hào)通路對(duì)大鼠NSC的存活、增殖、分化起重要作用。

絲裂原激活的蛋白激酶激酶；細(xì)胞外信號(hào)調(diào)控激酶；神經(jīng)干細(xì)胞

目前已知絲裂原激活的蛋白激酶（mitogen activated protein kinases，MAPK）在所有真核細(xì)胞中均有表達(dá)，MAPK屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可被細(xì)胞因子、神經(jīng)遞質(zhì)、激素等多種刺激因素所激活，是將細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)部的主要途徑，MAPK激活后可磷酸化核轉(zhuǎn)錄因子和其他蛋白激酶等多種底物，調(diào)節(jié)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而參與細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育等多種生理過程［1～6］。神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells，NSC）是一種具有自我更新、多分化潛能的原始細(xì)胞，是神經(jīng)發(fā)生的啟動(dòng)者，目前對(duì)于多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療方向是促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生，NSC的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)使它成為治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的焦點(diǎn)［7，8］，本實(shí)驗(yàn)通過應(yīng)用絲裂原激活的蛋白激酶激酶（mitogen activated protein kinases kinases，MAPKK/MEK）的特異性阻滯劑PD98059孵育大鼠NSC，探討該通路在NSC中的作用，為確定NSC增殖、分化的調(diào)控靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

TC2323型CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Sheldon公司）、CX-RFL-2落射熒光顯微鏡（日本Olympus公司）、LEICADMIL倒置生物顯微鏡（德國(guó)LEICA公司）、ELX-800全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)BIO-TEK公司）、SDSPAGE蛋白電泳儀和蛋白轉(zhuǎn)膜儀（上海天能公司）。培養(yǎng)NSC所用動(dòng)物為準(zhǔn)確胎齡的Wistar孕鼠，購(gòu)于重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。DMEM/F-12、B27、HBSS液、胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；EGF、bFGF購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；LY294002購(gòu)于美國(guó)Promega公司；Cell Counting Kit-8試劑盒購(gòu)于日本同仁公司；多聚賴氨酸、兔抗大鼠Nestin、小鼠抗大鼠BrdU、兔抗大鼠β-tubulin-Ⅲ、FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG、TRITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG等均購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司。BCAProtein Kit（HyClone-Pierce公司）；Prestained protein marker（中晶公司）；ECL-PLUS/Kit（Amersham 公司）；兔抗P44/42MAPK（ERK1/2）多克隆抗體、小鼠 Phospho-P44/42MAPK（ERK1/2）（Thr202/Tyr204）多克隆抗體、羊抗小鼠IgG-HRP和羊抗兔IgG-HRP（Cell Signaling Technology公司）。

1.2 方法

1.2.1 NSC的分離、培養(yǎng)：無(wú)菌條件下取E15-16大鼠胎鼠全腦，保留嗅腦，去除小腦，用組織分離液（DHank）沖洗干凈。仔細(xì)剝離血管和腦膜，剪碎，加0.25%胰酶37℃消化10～20min，500g離心5min，去除上清液，加入NSC培養(yǎng)基（DMEM/F12+2%B27+20ng/ml bFGF+20ng/ml EGF），吹打成為單細(xì)胞懸液，按照2×106/ml的比例接種于塑料培養(yǎng)瓶，置于 37℃、5%CO2、80%濕度（HR）條件下 CO2培養(yǎng)箱中懸浮培養(yǎng)。隔2～3d換半量培養(yǎng)液1次。

1.2.2 NSC的Nestin鑒定：取原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)的神經(jīng)球滴在涂布0.1%多聚賴氨酸的無(wú)菌蓋玻片上，37℃、5%CO2、80%濕度（HR）培養(yǎng)箱孵育2d后，取出蓋玻片用0.01mol/LPBS（pH7.2）洗滌，行Nestin細(xì)胞免疫組化鑒定，兔抗Nestin的濃度為1∶400。

1.2.3 經(jīng)PD98059孵育后NSCWST-8檢測(cè)：用不同濃度的PD98059（0～20mmol/L）孵育NSC12h后用Cell Counting Kit-8試劑盒做WST-8檢測(cè)，通過OD值了解PD98059對(duì)NSC存活的影響。

1.2.4 經(jīng)PD98059孵育后NSCBrdU鑒定：將BrdU溶于無(wú)血清培養(yǎng)液，BrdU終濃度為5μmol/L，然后用不同濃度的PD98059（0～20mmol/L）孵育NSC5d后，吸出細(xì)胞球滴在涂布10%多聚賴氨酸的無(wú)菌蓋玻片上，2d后做BrdU免疫組化鑒定，其中小鼠抗BrdU的濃度為1∶400。

1.2.5 經(jīng)PD98059孵育后 NSCβ-tubulin-Ⅲ鑒定：用不同濃度的PD98059（0～20mmol/L）孵育NSC2d后，吸出細(xì)胞球滴在涂布10%多聚賴氨酸的無(wú)菌蓋玻片上，加入含10%FBS的DMEM/F12誘導(dǎo)分化，14d后做β-tubulin-Ⅲ免疫組化鑒定，兔抗大鼠βtubulin-Ⅲ的濃度為1∶400。

1.2.6 經(jīng)PD98059孵育后NSCWestern blot檢測(cè)：用不同濃度的PD98059（0～20mmol/L）孵育NSC60min后做Western blot檢測(cè)。用0.01mol/LPBS洗滌細(xì)胞后，加入適量預(yù)冷的含蛋白酶抑制劑（PI）1×Lysis buffer裂解細(xì)胞，超聲破碎儀破碎細(xì)胞后取上清，采用BCAProtein Assay Kit測(cè)蛋白濃度后，每個(gè)樣品均調(diào)整為 2μg/μl的蛋白終濃度，每孔上樣 20μl后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電流強(qiáng)度為15mA，電泳2h。電泳結(jié)束后，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，電轉(zhuǎn)移的條件設(shè)定為恒流400mA，2h。然后將PVDF膜浸泡入5%的脫脂牛奶中，4℃過夜后加入一抗（1∶1000的兔抗P44/42MAPK（ERK1/2）和小鼠 Phospho-P44/42MAPK（ERK1/2）（Thr202/Tyr204）） 室溫下孵育 2h，TBST洗膜后加入二抗（1∶5000的辣根過氧化物酶驢抗兔/小鼠IgG）室溫下孵育2h，TBST和TBS洗膜后進(jìn)行ECL顯色反應(yīng)、曝光、顯影、過水、定影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)算染色后BrdU、β-tubulin-Ⅲ陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目。每個(gè)處理組做3張染片，每張染片隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)非重疊視野（×200）下的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，數(shù)據(jù)用±s表示，用SPSS13.0軟件進(jìn)行方差分析，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSC的培養(yǎng)及鑒定

自E15-16大鼠胎鼠大腦所得的細(xì)胞呈圓形，大小近似，細(xì)胞存活率80%～90%，呈懸浮生長(zhǎng)，分裂的細(xì)胞逐漸形成細(xì)胞團(tuán)，折光性強(qiáng)，邊界清楚（圖1），經(jīng)免疫組化染色，NSC標(biāo)記性蛋白Nestin在原代及傳代培養(yǎng)的神經(jīng)球均有表達(dá)（圖2）。胞質(zhì)及突起著色，表明分離培養(yǎng)的神經(jīng)球具有胚胎源性。提示所分離培養(yǎng)的細(xì)胞是NSC。

2.2 經(jīng)PD98059孵育后的NSCWST-8檢測(cè)結(jié)果

在 PD98059高濃度（12.5mmol/L、15.0mmol/L、17.5mmol/L、20.0mmol/L）時(shí)對(duì)NSC存活的影響與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說(shuō)明MAPKK/MEK-MAPK/ERK信號(hào)通路在NSC的存活中起重要作用。見表1。

表1NSC經(jīng)不同濃度PD98059孵育后的OD值（450n m/630n m）、Br d U和β-t u b u l i n-Ⅲ陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較（±s）Ta b.1Th e c o mp a r i s o n o f ODv a l u e（450n m/630n m），Br d U-p o s i t i v e c e l l s a n d β-t u b u l i n-Ⅲ p o s i t i v ec e l l s o f NSCa f t e r i n c u b a te d w i t h d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n o f PD98059f o r 12h（±s）Group ODvalue BrdUpositive cells β-tubulin-Ⅲ positive cells Control group（0mmol/L） 1.781±0.027 36.33±5.529 3.33±1.1552.5mmol/Lgroup 1.741±0.057 34.13±5.257 2.97±1.2175.0mmol/Lgroup 1.702±0.086 33.97±3.899 3.00±1.0837.5mmol/Lgroup 1.707±0.047 33.83±4.617 2.83±1.08510.0mmol/Lgroup 1.593±0.166 33.43±5.835 2.80±1.18612.5mmol/Lgroup 1.508±0.1011） 33.77±4.1581） 2.77±1.16515.0mmol/Lgroup 1.393±0.1051） 34.40±4.2481） 2.73±1.31117.5mmol/Lgroup 1.173±0.1521） 33.33±4.1801） 2.70±1.1191）20.0mmol/Lgroup 0.991±0.1192） 32.53±5.8001） 2.63±1.0981）1）P<0.05vs control group；2）P<0.01vs control group

2.3 經(jīng)PD98059孵育后NSC的BrdU陽(yáng)性細(xì)胞結(jié)果

在 PD98059的 12.5mmol/L、15.0mmol/L、17.5mmol/L、20.0mmol/L組中BrdU陽(yáng)性細(xì)胞與正常對(duì)照組比較下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表1）。

2.4 經(jīng)PD98059孵育后NSCβ-tubulin-Ⅲ陽(yáng)性細(xì)胞結(jié)果

當(dāng) PD98059濃度為 17.5mmol/L、20.0mmol/L時(shí)，β-tubulin-Ⅲ陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)少于正常對(duì)照組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表1），并且可見突觸短小發(fā)育不良的神經(jīng)元（圖3、圖4）。

2.5 經(jīng)PD98059孵育后NSC的Western blot檢測(cè)結(jié)果

從Western blot檢測(cè)結(jié)果可以看出PD98059對(duì)磷酸化的絲裂原激活的蛋白激酶（細(xì)胞外信號(hào)調(diào)控激酶）P44/42MAPK（ERK1/2）的抑制作用呈劑量依賴性的（圖 5），說(shuō)明PD98059對(duì)MAPKK/MEKMAPK/ERK信號(hào)通路的阻斷作用呈劑量依賴關(guān)系。

3 討論

目前已知，MAPK采用高度保守的三級(jí)激酶級(jí)聯(lián)傳遞信號(hào)，按激活順序?yàn)榻z裂原激活的蛋白激酶激酶激酶（MAPKK）-MAPKK-MAPK，它們構(gòu)成了一個(gè)連續(xù)的激活途徑。

MAPK信號(hào)級(jí)聯(lián)通路能將由表面受體介導(dǎo)的細(xì)胞外信號(hào)傳導(dǎo)到細(xì)胞核內(nèi)部，作為最重要的下游組件的ERK1和ERK2，是唯一能在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核之間穿梭往返的組件?，F(xiàn)己證實(shí)在MAPK級(jí)聯(lián)通路中，在接受細(xì)胞外信號(hào)刺激后，細(xì)胞外信號(hào)調(diào)控激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK）是唯一能在核中聚集的物質(zhì)，主要調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化。PD98059是MAPKK/MEK的特異性阻滯劑，在本實(shí)驗(yàn)中，低濃度的PD98059對(duì)NSC的存活、增殖和分化沒有明顯影響，但是經(jīng)較高濃度的PD98059孵育后，NSC的存活、增殖和分化受到明顯抑制，說(shuō)明PD98059對(duì)MAPKK/MEK-MAPK/ERK信號(hào)通路的阻斷作用呈劑量依賴關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)表明在大鼠NSC中MAPKK/MEK-MAPK/ERK信號(hào)通路對(duì)其多種生理功能起重要作用，MAPKK/MEK-MAPK/ERK信號(hào)通路維持正常是大鼠NSC存活、增殖和分化的必要條件。

目前已知MAPK廣泛分布于整個(gè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中。各種細(xì)胞外刺激信號(hào)，包括神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、生長(zhǎng)因子等均可通過這一通路影響突觸傳遞、神經(jīng)元的重塑、形態(tài)分化和生存等，從而參與神經(jīng)系統(tǒng)多種疾病的病理過程。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和其他刺激神經(jīng)的化學(xué)物質(zhì)可以激活ERK信號(hào)通路，活化的ERK參與神經(jīng)細(xì)胞的存活、分化及神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能的可塑性調(diào)節(jié)［3，9～11］。目前已知轉(zhuǎn)錄因子活化劑蛋白 1（activator protein-1，AP-1）如糖原合成激酶 3（glycogen synthesis kinase 3，GSK3）［12］及 Bcl-2，BAD，cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMPresponse element binding protein，CREB）和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）均是 MAPKK/MEK-MAPK/ERK通路的下游靶點(diǎn)，它們?cè)谏窠?jīng)元的發(fā)育、存活和維持神經(jīng)元的長(zhǎng)期可塑性上發(fā)揮重要作用［3，9～12］。

目前許多學(xué)者認(rèn)為一些神經(jīng)因子或促神經(jīng)發(fā)生的藥物是通過MAPKK/MEK-MAPK/ERK信號(hào)通路來(lái)影響其下游許多信號(hào)分子的表達(dá)，如果要探究它們是否是通過MAPKK/MEK-MAPK/ERK信號(hào)通路調(diào)節(jié)相關(guān)的信號(hào)分子，就需要先用MAPKK/MEK的特異性阻滯劑來(lái)孵育細(xì)胞然后再用因子或藥物來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞，所以確定NSC中既能抑制ERK的激活又不會(huì)影響細(xì)胞存活的MAPKK/MEK的特異性阻滯劑的濃度至關(guān)重要，因?yàn)槿绻鸐APKK/MEK的特異性阻滯劑的濃度過高就會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，就不會(huì)對(duì)后面的因子或藥物產(chǎn)生反應(yīng)，如果MAPKK/MEK的特異性阻滯劑的濃度過低就不會(huì)有效抑制MAPKK/MEK-MAPK/ERK信號(hào)通路，就不會(huì)探明相關(guān)信號(hào)分子是否是MAPKK/MEK-MAPK/ERK信號(hào)通路的下游信號(hào)。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得知:在NSC中，MAPKK/MEK的特異性阻滯劑PD98059為10～12.5mmol/L時(shí)既能有效抑制ERK的激活，又不會(huì)影響細(xì)胞存活，該濃度可以作為有效阻滯NSC中MAPKK/MEK-MAPK/ERK信號(hào)通路的阻滯劑濃度。

［1］Schaeffer HJ，Weber MJ.Mitogen-activated protein kinases：specific messages from ubiquitous messengers［J］.Mol Cell Biol，1999，19（4）：2435-2444.

［2］Lenormand P，Brondello JM，Brunet A，et al.Growth factor-induced p42/p44MAPKnuclear translocation and retention requires both MAPKactivation and neosynthesis of nuclear anchoring proteins［J］.Cell Biol，1998，142（3）：625-633.

［3］Huang EJ，Reichardt LF.Neurotrophins：roles in neuronal development and function［J］.Annu Rev Neurosci，2001，24（3）：677-736.

［4］Marinissen MJ，Gutkind JS.G-protein-coupled receptors and signaling networks：emerging paradigms ［J］.Trends Pharmacol Sci，2001，22（7）：368-376.

［5］Dawson TM，Ginty DD.CREBfamily transcription factors inhibit neuronal suicide［J］.Nat Med，2002，8（5）：450-451.

［6］Weeber EJ，Sweatt JD.Molecular neurobiology of human cognition［J］.Neuron，2002，33（6）：845-848.

［7］ Gage FH.Mammalian neural stem cells［J］.Science，2000，287（5457）：1433-1438.

［8］Goldman S.Stem and progenitor cell-based therapy of the human central nervous system［J］.Nat Biotechnol，2005，23（7）：862-871.

［9］Marinissen MJ，Gutkind JS.G-protein-coupled receptors and signaling networks：emerging paradigms ［J］.Trends Pharmacol Sci，2001，22（7）：368-376.

［10］Dawson TM，Ginty DD.CREBfamily transcription factors inhibit neuronal suicide［J］.Nat Med，2002，8（5）：450-451.

［11］Weeber EJ，Sweatt JD.Molecular neurobiology of human cognition［J］.Neuron，2002，33（6）：845-848.

［12］Karin M.The regulation of AP-1activity by mitogen-activated protein kinases［J］.Philos Trans RSoc Lond BBiol Sci，1996，351（1336）：127-134.

（編輯 武玉欣，英文編輯 鄭華川）

Effect of MAPKK/MEK-MAPK/ERKSignal Transduction Pathway in Rat Neural Stem Cells

ZHAOYu1，XIEPeng1，ZHUXiao-feng2，CAIZhi-you1
（1.Department of Neurology，The First Affiliated Hospital，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China；2.The Neuroscience Research Institute of Jiamusi University，Jiamusi 154007，China）

ObjectiveTo incubate the rat neural stem cells with specific inhibitor（PD98059）of MAPKK/MEKto clarify the effect of MAPKK/MEK-MAPK/ERKsignaling pathway in neural stem cells（NSC）.MethodsNSCs derived from E15-16rats were isolated and cultured.After treated with different concentration of PD98059，they were subjected to the detection of cell proliferation，Nestin，BrdUand βtubulin-IIIby WTS-8assay，immunofluorescent staining or Western Blot respectively.ResultsPD98059had an effect on the survival，proliferation and differentiation of NSCat a concentration-dependent manner.The viability of the NSCwas significantly decreased than the control（P<0.05），whereas the numbers of BrdU-positive and β-tubulin-Ⅲ positive cells were notably fewer than the control（P<0.05）after incubated with the higher concentration of PD98059.The ERKexpression was blocked by PD98059at a concentration-dependent manner.ConclusionThe MAPKK/MEK-MAPK/ERKsignaling pathway played a vital role in the survival，proliferation and differentiation of NSC.

mitogen activated protein kinases kinases；extracellular signal regulated kinase；neural stem cell

R742

A

0258-4646（2010）01-0014-04

高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金資助項(xiàng)目（20050631012）

趙宇（1973-），女，副主任醫(yī)師，博士.E-mail：wangpang0916@yahoo.com.cn

2009-05-22