B7-H4在卵巢漿液性癌組織中的表達(dá)及其臨床意義

廖林虹 于曉紅

腫瘤細(xì)胞逃逸機(jī)體的免疫監(jiān)視與腫瘤細(xì)胞高表達(dá)B7分子有關(guān)，B7-H4是協(xié)同刺激因子B7家族中的1個新成員，B7-H4-Ig融合蛋白或與B7-H4分子相關(guān)的細(xì)胞參與抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的抗體特異性免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)[1]。RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，B7-H4 mRNA在脾、肺、胸腺、胎盤、肝、骨胳肌、腎、胰、前列腺、睪丸、卵巢和小腸中均表達(dá)；B7-H4蛋白在體外活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞中表達(dá)，而在正常組織中不表達(dá)[2]；B7-H4在許多腫瘤組織中有表達(dá)，如卵巢癌、布倫納瘤、乳腺癌、前列腺癌和食管癌等[3～6]，并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后相關(guān)。Simon等[7]發(fā)現(xiàn)可溶性B7-H4高度特異性表達(dá)在漿液性卵巢癌血清，為卵巢癌早期診斷、指導(dǎo)治療腫瘤提供了新的生物標(biāo)記物和依據(jù)。本研究應(yīng)用RT-PCR及免疫組織化學(xué)PV-9000二步法，研究分析B7-H4基因在40例卵巢漿液性癌中的表達(dá)，分析卵巢漿液性癌B7-H4蛋白的表達(dá)情況與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料 選取江西省婦幼保健院2005年4月～ 2009年12月收治的40例卵巢漿液性癌為患者研究對象，年齡32～67歲(48.8±7.41)歲，術(shù)前均未接受任何治療；FIGO分期(2006年標(biāo)準(zhǔn))：Ⅰ期8例，Ⅱ期5例，Ⅲ期17例，Ⅳ期10例；組織病理學(xué)分級：高分化3例，中分化13例，低分化24例。對照組為同期20例交界性卵巢漿液性腫瘤和15例卵巢漿液性囊腺瘤組織。

1.1.2 試劑 PCR引物由北京三博遠(yuǎn)志公司合成，免抗B7-H4多克隆抗體購自Santa Cruz，二抗試劑盒、DAB顯色液系北京中杉金橋產(chǎn)品，PT-PCR試劑盒系北京鼎盛公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 B7-H4 mRNA表達(dá)的檢測 采用RT-PCR技術(shù)，0.1%DEPC處理所有的實(shí)驗(yàn)用品，從液氮中取出收集的卵巢漿液性腫瘤組織研磨，按照說明操作，用Trizol試劑在凈化操作臺內(nèi)抽提總RNA，紫外分光光度儀檢測A260/A280，測定其質(zhì)量和濃度，A260/A280在1.8～2.0之間；行RT-PCR擴(kuò)增，以β-肌動蛋白(β-actin)為內(nèi)參照物。B7-H4序列[8](184 bp)：上游，5’CCCAATCCGAAGTGTCAACT3’；下游，5’TATCCTGGTGCCCGATAGAG3’。β-actin引物序列(285bp)：上游，5’AGCGAGCATCCCCCAAAGTT3’；下游，5’ GGGCACGAAGGCTCATCATT3’。95℃變性5 min，PCR擴(kuò)增條件為95℃45 s，58℃45 s，72℃45 s，35個循環(huán)，72℃延伸7 min，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，紫外觀測儀下觀察攝像。

1.2.2 B7-H4蛋白表達(dá)的檢測 采用免疫組化PV-

9000二步法。石蠟標(biāo)本切片厚4 μm，二甲苯、酒精脫蠟，微波加熱抗原修復(fù)，滴加3%雙氧水20 min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，依次滴加兔抗一抗(1∶100稀釋)37℃或室溫孵育20 min，增強(qiáng)劑37℃或室溫孵育20 min，鼠/兔抗人二抗37℃或室溫孵育30 min，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色1～5 min，蘇木精復(fù)染，磷酸鹽緩沖液(PBS)返藍(lán)，梯度酒精脫水透明，中性樹膠封片；以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.2.3 B7-H4蛋白的表達(dá)分析 計數(shù)細(xì)胞膜和(或)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有黃色或棕黃色顆粒狀物的陽性染色細(xì)胞數(shù)，對B7-H4蛋白表達(dá)進(jìn)行分析，染色強(qiáng)度根據(jù)陽性細(xì)胞百分比進(jìn)行半定量分級：陽性細(xì)胞率=0為0級,<10%為1級，10%～50%為2級，50%～80%為3級，>80%為4級；結(jié)果判斷：陽性細(xì)胞百分比<10%為陰性，10%～100%為陽性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計分析軟件采用χ2檢驗(yàn)、Fisher確切概率法及Kruskua-Wallis Test，分析B7-H4蛋白的表達(dá)情況及卵巢漿液性癌B7-H4蛋白表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 B7-H4 mRNA表達(dá)

所有卵巢漿液性腫瘤中B7-H4 mRNA均有表達(dá)。

2.2 B7-H4蛋白在卵巢漿液性腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)

B7-H4蛋白主要表達(dá)于卵巢漿液性腫瘤細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞膜，呈棕黃色。B7-H4蛋白在卵巢漿液性癌、交界性卵巢漿液性腫瘤和卵巢漿液性囊腺瘤組織中陽性表達(dá)率分別為75.0%(30/40)、50.0%(10/20)和13.3%(2/15)，陽性率逐級下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 B7-H4蛋白在卵巢漿液性腫瘤中的表達(dá)

注：*為漿液性癌組與交界性漿液性腫瘤組比較；**為交界性漿液性腫瘤組與漿液性囊腺瘤組比較；***為漿液性癌組與漿液性囊腺瘤組比較

2.3 B7-H4蛋白與卵巢漿液性癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

卵巢漿液性癌組織中B7-H4蛋白表達(dá)與患者年齡、FIGO分期、病理分級、腹腔積液細(xì)胞學(xué)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無相關(guān)性，見表2。

表2 B7-H4蛋白在卵巢漿液性癌組織中的表達(dá)及與其臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例，%)

3 討論

卵巢惡性腫瘤是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，約占20%，且逐年呈上升趨勢，其中20%卵巢惡性腫瘤為惡性上皮性卵巢腫瘤。由于卵巢組織的解剖位置關(guān)系，早期癥狀不明顯且缺乏有效的檢測手段，大多數(shù)患者就診時已為中晚期，預(yù)后差、5年存活率較低,其中以卵巢漿液性癌居多。早期發(fā)現(xiàn)與早期診斷是改善卵巢癌患者預(yù)后的有效措施之一，因此，尋找到1個早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、特異性強(qiáng)、靈敏度高的腫瘤分子標(biāo)記物對于改善卵巢癌患者的預(yù)后具有重要的臨床和現(xiàn)實(shí)意義，同時也能為新型靶向治療技術(shù)提供新的依據(jù)。

B7-H4分子又稱B7S1和B7x，是B7家庭中新近發(fā)現(xiàn)的1個成員，2003年Sina等[1]發(fā)現(xiàn)B7-H4蛋白屬于免疫球蛋白超家庭，人B7-H4序列含282個氨基酸，包括信號肽區(qū)、一對免疫球蛋白(IgV和IgC)胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)，屬I型跨膜蛋白。大量研究發(fā)現(xiàn)B7-H4在T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫抑制中具有重要作用，它能抑制T細(xì)胞活化、增殖和細(xì)胞因子IL-1、IL-2等分泌，阻斷細(xì)胞周期使細(xì)胞停滯于G0/G1期、抑制CD8+CTL的增殖和成熟；在酵母細(xì)胞上構(gòu)建的真核質(zhì)粒胞漿表達(dá)鼠B7-H4能抑制T淋巴細(xì)胞增殖和IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ分泌；此外B7-H4在自身免疫性疾病過程中也發(fā)揮著重要作用，能下調(diào)器官自身特異性抗原反應(yīng)，使實(shí)驗(yàn)性腦脊髓炎加劇[1,9～12]。

本研究通過RT-PCR方法，檢測發(fā)現(xiàn)B7-H4 mRNA在卵巢漿液性腫瘤組織中均有表達(dá)，免疫組化法發(fā)現(xiàn)B7-H4蛋白在卵巢漿液性腫瘤細(xì)胞中呈細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞膜表達(dá)，在卵巢漿液性癌、交界性卵巢漿液性腫瘤和卵巢漿液性囊腺瘤陽性表達(dá)率分別為75.0%(30/40)、50.0%(10/20)和13.3%(2/15)，陽性率呈逐級下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。Zhang等[3]在卵巢癌的研究發(fā)現(xiàn)，與交界性和良性卵巢腫瘤相比B7-H4顯著高表達(dá)在卵巢癌，B7-H4在漿液性卵巢癌的表達(dá)明顯高于黏液性卵巢癌，提示B7-H4蛋白表達(dá)增強(qiáng)可能導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸從而促進(jìn)卵巢癌的發(fā)生。Kryczek等[13]發(fā)現(xiàn)，惡性卵巢腫瘤中表達(dá)在巨噬細(xì)胞的B7-H4濃度與Treg數(shù)量顯著相關(guān)，Treg和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞上的B7-H4患者的愈后呈負(fù)相關(guān)。Salceda 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，B7-H4 分子的過度表達(dá)可以促進(jìn)上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，促使 SCID(重癥聯(lián)合免疫缺陷)鼠卵巢癌的形成，并保護(hù)上皮細(xì)胞免于失巢凋亡。Cheng等[15]發(fā)現(xiàn)B7-H4能直接促進(jìn)卵巢癌SKOV3細(xì)胞生長和惡化。其他腫瘤中B7-H4蛋白表達(dá)的研究發(fā)現(xiàn)均提示它在腫瘤免疫逃逸和不良預(yù)后中起著重要作用；Hyunkeun等[16]發(fā)現(xiàn)B7-H4表達(dá)的B細(xì)胞易感染EB病毒，B7-H4靶向治療可誘導(dǎo)感染EB病毒的B細(xì)胞凋亡。

雖然B7-H4 在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的作用和機(jī)制尚未完全明確，但它與卵巢漿液性癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，作為卵巢漿液性癌患者治療的潛在靶位已逐步受到關(guān)注。B7-H4 在卵巢漿液性癌彌漫性高表達(dá)的特征為卵巢漿液性癌診斷和靶向治療提供了新的策略。

[1] Sica GL,Choi IH,Zhu G,et al.B7-H4,a molecule of the B7 family,negatively regulates T cell immunity〔J〕.Immunity,2003,18(6):849.

[2] Choi IH,Zhu G,Sica GL,et al.Genomic organization and expression analysis of B7-H4,an immune inhibitory molecule of the B7 family〔J〕.J Immunol,2003,171(9):4650.

[3] Zhang LL,Shao SL,Wu Y.Expressions of osteopontin and B7-H4 in epithelial ovarian neoplasm and their significance〔J〕.Ai zheng,2010,29(1):24.

[4] Yee EU,Zaino RJ,Torkko KC,et al.B7-H4 expression in Brenner tumours,a descriptive and comparative study〔J〕.Histopathology,2010,56(5):652.

[5] Zhang J,Zhang M,Jiang W,et al.B7-H4 gene polymorphisms are associated with sporadic breast cancer in a Chinese Han population 〔J〕.BMC Cancer,2009,11(9):394.

[6] 蔣 敏,顧國浩,張光波,等.可溶性B7-H4在食管癌患者血清中的表達(dá)分析〔J〕.廣東醫(yī)學(xué)，2009,30(6):925.

[7] Simon I,Liu Y,Krall KL,et al.Evaluation of the novel serum markers B7-H4,Spondin 2,and DcR3 for diagnosis and early detection of ovarian cancer〔J〕.Gynecol Oncol,2007,106(1):112.

[8] 魏雙燕，姜 潔，南芳芳,等.卵巢漿液性癌 B7-H4的表達(dá)及臨床病理意義〔J〕.現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展,2008,17(7):493.

[9] Zang X,Loke P,Kim J,et al.B7x:A widely expressed B7 family member that inhibits T cell activation〔J〕.PNAS,2003,100(18):10388.

[10] Prasad DVR,Richards S,Mai XM,et al.B7S1,a Novel B7 Family Member that Negatively Regulates T Cell Activation〔J〕.Immunity,2003,18(6):6863.

[11] Mao YX,Chen YJ,Ge Y,et al.Recombinant human B7-H4 expressed in Escherichia coli inhibits T lymphocyte proliferation and IL-2 secretion in vitro〔J〕.Acta Pharmacol Sin,2006,27(6):741.

[12] Qian Y,Yao HP,Cheng LF,et al.Expression and identification of recombinant mouse gene B7-H4〔J〕.Zhejiang Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban,2009,38(2):117.

[13] Kryczek I,Wei S,Zhu G,et al.Relationship between B7-H4,regulatory T cells,and patient outcome in human ovarian carcinoma〔J〕.Cancer Res,2007,67(18):8900.

[14] Salceda S,Tang T,Kmet M,et al.The immunomodulatory protein B7-H4 is overexpressed in breast and ovarian cancers and promotes epithelial cell transformation〔J〕.Exp Cell Res,2005,306(1):128.

[15] Cheng L,Jiang J,Gao R,et al.B7-H4 expression promotes tumorigenesis in ovarian cancer〔J〕.Int J Gynecol Cancer,2009,19(9):1481.

[16] Song H,Park G,Kim YS,et al.B7-H4 reverse signaling induces the apoptosis of EBV-transformed B cells through Fas ligand up-regulation〔J〕.Cancer Letters，2008,266:227.