多發(fā)性骨髓瘤患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性研究

趙志華 趙智剛 陸 寧 王曉芳

骨髓中除了造血干細(xì)胞外，還有一類(lèi)具有干細(xì)胞特征的細(xì)胞群體，被稱(chēng)為間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)。MSCs是骨髓微環(huán)境中很重要的組份并發(fā)揮著重要作用。既往研究表明MSCs具有支持造血和調(diào)控造血干細(xì)胞增殖和分化的能力[1,2]。此外，MSCs在不同的誘導(dǎo)條件下可分化為多種組織，如骨骼、軟骨、骨髓基質(zhì)、肌肉、腱、脂肪和神經(jīng)細(xì)胞等[3,4]。MSCs的上述生物學(xué)特性決定了其在組織工程和細(xì)胞治療領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用前景。 但是，我們尚不清楚的是：血液病患者骨髓MSCs是否受到疾病的影響以及受影響的程度。因此我們獲取多發(fā)性骨髓瘤(MM)患者的骨髓MSCs，觀察其生物學(xué)特征和多向分化能力，并檢測(cè)其是否表達(dá)造血相關(guān)因子并具有體外支持造血的能力，為其今后在臨床中的應(yīng)用提供初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

IMDM、DMEM、DF12、MCDB培養(yǎng)基、胎牛血清、馬血清、Trizol裂解液、甲基纖維素均為GIBCO公司產(chǎn)品。鼠抗人CD14、CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD105和HLA-DR抗體購(gòu)自 BD-PharMingen,鼠抗人Ⅰ、Ⅲ膠原單克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司。免疫組化試劑盒購(gòu)自北京中山公司；胰酶，EDTA,β磷酸甘油和1-甲基-3-異丁基-黃嘌呤購(gòu)自Sigma公司。

1.2 病例資料

15例MM患者，其中男性11例，女性4例，平均年齡53歲(46～67歲)，均為天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院住院病例，MM的診斷標(biāo)準(zhǔn)參見(jiàn)文獻(xiàn)[5]。全部15例患者在獲取標(biāo)本時(shí)均未接受過(guò)任何化療。8例正常人，平均年齡23歲(14～36歲)，作為對(duì)照。

1.3 MSCs的分離、培養(yǎng)和擴(kuò)增

髂后上棘抽取骨髓5～10 ml，用淋巴細(xì)胞分離液(密度1.077)1 200 rpm離心20 min，獲取全部單個(gè)核細(xì)胞，計(jì)數(shù)后接種于含40%MCDB、2%胎牛血清(FCS)的DF12培養(yǎng)液中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，24～48 h后換液，去除未貼壁細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%融合，應(yīng)用胰酶-EDTA消化后按照1∶3比例傳代。

1.4 MSCs免疫表型的檢測(cè)

分別取不同代數(shù)MSCs，胰酶消化后，用含2%牛血清白蛋白(BSA)的磷酸鹽緩沖液(PBS)制成1×106/ml的細(xì)胞懸液。每個(gè)上機(jī)試管中加入500 μl細(xì)胞懸液，加入鼠抗人CD14、CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD105和HLA—DR單克隆抗體，于40℃孵育30 min。再加入FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG,40℃孵育30 min,PBS洗4遍。流式細(xì)胞儀檢測(cè),應(yīng)用cellquest軟件獲取并分析數(shù)據(jù)。

1.5 MSCs多向分化能力的檢測(cè)

成骨誘導(dǎo)：將5×104個(gè)細(xì)胞接種于預(yù)置玻片的35 mm培養(yǎng)皿中，加入含10-7mol/L地塞米松、10 mol/Lβ磷酸甘油、0.05 mol/L維生素C和10% FCS的IMDM，3周后應(yīng)用Von cosa染色檢測(cè)鈣化小結(jié)；脂肪誘導(dǎo)：將5×104個(gè)細(xì)胞接種于預(yù)置玻片的35 mm培養(yǎng)皿中，加入含10-6mol/L地塞米松、0.5 mol/L 1-甲基-3-異丁基-黃嘌呤、0.1 mol/L維生素C和10%FCS的IMDM，5～7天后油紅O染色檢測(cè)脂肪滴。

1.6 MSCs造血因子表達(dá)的檢測(cè)

用Trizol 裂解液提取總RNA。RT-PCR擴(kuò)增干細(xì)胞因子(SCF)，白介素6(IL-6)，白介素3(IL-3)，粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，粒、單核細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)，單核細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)和血小板生長(zhǎng)因子(TPO)。管家基因GAPDH作為內(nèi)對(duì)照。反應(yīng)條件:94℃變性5min后開(kāi)始循環(huán)。94℃變性30 s,60℃退火1 min,72℃延伸1 min,循環(huán)35次,72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳。溴化乙錠染色并觀察結(jié)果。

1.7 MSCs支持造血能力的檢測(cè)

將骨髓MSCs經(jīng)60Coγ線10.0 Gy照射，然后接種于長(zhǎng)期培養(yǎng)基(含質(zhì)量濃度12.5% FCS,12.5%馬血清，2 mmol/L谷氨酰胺，10-6mol/L氫化考的松的IMDM)中。獲取健康人骨髓單個(gè)核細(xì)胞，預(yù)先培養(yǎng)4 h以去除貼壁細(xì)胞，將懸浮細(xì)胞按照1×106/ml接種在照射后的MSCs中，在37℃、 5%CO2中培養(yǎng),每周半量換液。4周后獲取全部細(xì)胞接種于甲基纖維素體系中測(cè)定其集落形成能力。培養(yǎng)體系:IMDM中含30%馬血清,1g/L BSA,2 mmol/L谷氨酰胺,1×10-4/L β2 巰基乙醇,1%甲基纖維素和重組細(xì)胞因子。細(xì)胞因子包括rhSCF 50 ng/ml、IL-3 10 ng/ml、GM-CSF 50 ng/ml 和促紅細(xì)胞生成素(EPO) 4 U/ml。集落形成實(shí)驗(yàn)在24孔培養(yǎng)板中進(jìn)行,每孔接種1×106個(gè)細(xì)胞,于37℃、 5%CO2培養(yǎng)14天。14天后在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)集落,50個(gè)以上細(xì)胞為1個(gè)集落。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，組間比較進(jìn)行t檢驗(yàn)或方差分析。

2 結(jié)果

2.1 MM骨髓MSCs的生物學(xué)特征

12例MM患者骨髓中培養(yǎng)出可以連續(xù)傳代的MSCs,另外3例MM骨髓單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)過(guò)2周培養(yǎng)，只有很少的貼壁細(xì)胞而且?guī)缀醪辉鲋常S著繼續(xù)培養(yǎng)逐漸死亡。在倒置顯微鏡下，MM骨髓MSCs呈現(xiàn)為成纖維樣，細(xì)胞核較大，位于細(xì)胞中央，其中可見(jiàn)核仁，細(xì)胞生長(zhǎng)成漩渦狀形態(tài)。在培養(yǎng)過(guò)程中，12例標(biāo)本中均有集落形成單位(CFU-F)形成,CFU-F計(jì)數(shù)為(10±2.7)/107骨髓單個(gè)核細(xì)胞[(6～21)/107骨髓單個(gè)核細(xì)胞;n=12]。MSCs在體外增殖能力強(qiáng)，平均倍增時(shí)間為(43.2±5.8)h(36.7～55.1；n=10)，細(xì)胞形態(tài)和倍增時(shí)間隨著細(xì)胞的傳代變化不大。MM來(lái)源的MSCs表達(dá)CD29、CD44、CD105，不表達(dá)造血細(xì)胞表面抗原CD34和CD45，內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志CD31也為陰性，此外CD14和HLA-DR均為陰性。該免疫表型隨著細(xì)胞傳代變化不大,免疫組化顯示其表達(dá)Ⅰ和Ⅲ型膠原。此外，MM骨髓MSCs的形態(tài)、增殖能力和免疫表型與正常成人骨髓MSCs相似。

2.2 MSCs的誘導(dǎo)分化

MM骨髓MSCs和正常成人骨髓MSCs都具有在體外向骨和脂肪細(xì)胞分化的能力。在成脂肪誘導(dǎo)體系中，5～7d后可以看見(jiàn)60%～80%細(xì)胞中出現(xiàn)脂肪滴，油紅O染色證實(shí)為脂肪滴。在成骨誘導(dǎo)體系中培養(yǎng)3周后，細(xì)胞呈現(xiàn)多層生長(zhǎng)的結(jié)節(jié)狀，并有大量鈣鹽沉積。Von Kossa 染色證實(shí)為鈣鹽沉積(圖1)。分別檢測(cè)了不同代數(shù)MSCs，發(fā)現(xiàn)都具有相同的分化能力。

圖1 RT-PCR檢測(cè)MM骨髓MSCs中造血因子的表達(dá)

1為Marker；2為IL-6 (174bp)；3為M-CSF (231bp); 4為SCF (275bp)；5為 G-CSF (346bp)；6為T(mén)PO (347bp); 7為GM-CSF (384bp); 8為IL-3 (347bp)

2.3 造血相關(guān)因子的表達(dá)

通過(guò)RT-PCR，檢測(cè)到SCF、M-CSF、IL-6和G-CSF在MM骨髓MSCs中穩(wěn)定表達(dá)，但是沒(méi)有檢測(cè)到GM-CSF、IL-3和TPO的表達(dá)。隨著細(xì)胞傳代，造血相關(guān)因子的表達(dá)并不發(fā)生改變。

2.4 體外支持造血能力

為了評(píng)估MM骨髓MSCs支持造血的能力，骨髓單個(gè)核細(xì)胞被接種于照射過(guò)的MSCs中，在長(zhǎng)期骨髓培養(yǎng)基中培養(yǎng)4周后檢測(cè)CFU生成情況。由圖2可見(jiàn)，MM骨髓MSCs具有促進(jìn)CFU-GM、CFU-E和CFU-GEMM增殖的能力，以MM骨髓MSCs為滋養(yǎng)層的培養(yǎng)體系中，CFU-GM、CFU-E和CFU-GEMM的產(chǎn)率分別為128.2±4.1、69.5±8.6和9.8±3.4；以正常成人骨髓MSCs為滋養(yǎng)層的培養(yǎng)體系中，CFU-GM、CFU-E和CFU-GEMM的產(chǎn)率分別為138.6±12.1、85.4±6.3和12.6±0.9；兩者支持造血的能力沒(méi)有明顯差別。

圖2 RT-PCR檢測(cè)MM骨髓MSCs中造血因子的表達(dá)

3 討論

多發(fā)性骨髓瘤(MM)是漿細(xì)胞在骨髓內(nèi)惡性克隆性增殖伴單克隆免疫球蛋白產(chǎn)生為特征的1種造血系統(tǒng)惡性克隆性疾病。主要表現(xiàn)為骨髓瘤細(xì)胞增殖、浸潤(rùn)和破壞骨組織及髓外其它組織。多發(fā)性骨髓瘤是一中老年惡性疾病,常規(guī)化療效果差。大劑量化療聯(lián)合自體造血干細(xì)胞移植治療效果較好,異基因造血干細(xì)胞移植是唯一可以治愈該病的方法。但是大劑量化療或移植前的預(yù)處理會(huì)損害骨髓中的MSCs，從而影響造血干細(xì)胞的植入和移植后患者的造血恢復(fù)[6，7]。骨髓MSCs具有在體內(nèi)和體外支持造血的功能，因此聯(lián)合MSCs的造血干細(xì)胞移植(HSCT)有可能解決上述問(wèn)題，最近研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)聯(lián)合MSCs的HSCT可以促進(jìn)造血干細(xì)胞的植入和造血恢復(fù)[1，2，8]。具有臨床應(yīng)用潛能的MSCs包括異基因MSCs和自體MSCs。但是，排斥反應(yīng)、來(lái)源有限、增加患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)等因素限制了異基因MSCs的臨床應(yīng)用。而且研究發(fā)現(xiàn)異基因MSCs不能修復(fù)被放化療損傷的骨髓基質(zhì)細(xì)胞。因此，我們希望獲取患者自體MSCs用于臨床治療，但是我們尚不清楚骨髓中惡性克隆性增殖的骨髓瘤細(xì)胞是否影響與其關(guān)系密切的骨髓MSCs。

在本研究中，我們獲取并研究了MM骨髓來(lái)源MSCs的生物學(xué)特征,同時(shí)獲取正常成人骨髓MSCs作為對(duì)照。研究結(jié)果顯示MM骨髓MSCs具有很強(qiáng)的增殖能力，其倍增時(shí)間約為45h，這種生長(zhǎng)速度隨細(xì)胞連續(xù)傳代無(wú)明顯變化，這意味著我們獲取的間充質(zhì)干細(xì)胞可以在體外大量擴(kuò)增。MSCs具有一系列的表面標(biāo)志，通過(guò)對(duì)這些表面標(biāo)志的檢測(cè)，我們可以進(jìn)一步鑒定所獲取細(xì)胞的性質(zhì)。我們用FACS檢測(cè)獲取的MM骨髓MSCs的免疫表型，結(jié)果顯示該細(xì)胞群體表達(dá)CD29、CD44和CD105，不表達(dá)CD14、CD34、CD31、CD45、和HLA-DR，這與文獻(xiàn)報(bào)道的間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫表型是一致的[9]。此外，多向分化能力是MSCs的重要特性之一，因此在本研究中我們檢測(cè)了MM來(lái)源的MSCs在體外向骨、脂肪分化的能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在相應(yīng)的誘導(dǎo)體系中，MM骨髓MSCs可以向骨和脂肪分化，進(jìn)一步證實(shí)在MM患者的骨髓中存在著一類(lèi)具有MSCs特點(diǎn)的細(xì)胞群體。

MM的發(fā)病機(jī)制目前尚不明了，骨髓微環(huán)境中IL-6的升高、抑癌基因的失活和膜受體的改變與該病的發(fā)生有著一定關(guān)系。本研究中我們發(fā)現(xiàn)MM和正常成人骨髓MSCs均穩(wěn)定表達(dá)IL-6,我們進(jìn)一步通過(guò)半定量RT-PCR方法進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)IL-6在MM和正常成人骨髓MSCs中的表達(dá)沒(méi)有明顯差別。因此，我們推測(cè)MM骨髓MSCs表達(dá)IL-6與MM的發(fā)病關(guān)系不大，而與其支持造血作用相關(guān)。

既往研究發(fā)現(xiàn)，骨髓MSCs通過(guò)表達(dá)細(xì)胞黏附分子和分泌多種造血調(diào)控因子來(lái)促進(jìn)造血干細(xì)胞的增殖和分化。在本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)MM骨髓MSCs高表達(dá)黏附分子CD29和CD44，并且表達(dá)Ⅰ和Ⅲ型膠原，這些分子的表達(dá)有助于MSCs與造血細(xì)胞之間的相互黏附，從而促進(jìn)造血細(xì)胞的增殖和分化。此外，MM骨髓MSCs一方面通過(guò)穩(wěn)定表達(dá)造血調(diào)控因子SCF、IL-6和G-CSF，進(jìn)一步來(lái)調(diào)控造血；另一方面作為滋養(yǎng)層來(lái)支持造血。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)骨髓單個(gè)核細(xì)胞在以MSCs作為滋養(yǎng)層的骨髓長(zhǎng)期培養(yǎng)體系和甲基纖維素培養(yǎng)體系中經(jīng)過(guò)續(xù)貫培養(yǎng)后可以生成CFU-GM、CFU-E和CFU-GEMM，說(shuō)明MM骨髓MSCs具有支持造血干/祖細(xì)胞增殖的能力。進(jìn)一步同正常成人骨髓MSCs比較，MM骨髓MSCs對(duì)造血干/祖細(xì)胞的增殖能力沒(méi)有明顯差別，進(jìn)而闡明MM骨髓MSCs具有很好的支持造血作用。

綜上所述，我們首次從MM患者骨髓中分離純化出MSCs，它可以在體外大量擴(kuò)增并維持低分化狀態(tài)，在特定的條件下可以向多種組織分化。MM骨髓MSCs具有表達(dá)造血相關(guān)因子和體外支持造血的作用，因此，是1種理想的可應(yīng)用于臨床的種子細(xì)胞。

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