p-[18F]FSTC的合成和初步動物學評價

郭飛虎，施玲麗，王 妮，武明星，張勇平，杜 進，4，*,張 嵐,*

1.中國原子能科學研究院 同位素研究所，北京 102413； 2.中國科學院 上海應(yīng)用物理研究所 放射性藥物研究中心，上海 201800；3.復(fù)旦大學 附屬腫瘤醫(yī)院 核醫(yī)學科 PET中心，上海 200032；4.中國同位素公司，北京 100045

腫瘤乏氧現(xiàn)象普遍存在于多種實體腫瘤內(nèi)，是導(dǎo)致放療和化療失敗的主要因素之一[1-2]，且易使腫瘤發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移[3-4]。正電子斷層顯像(PET)在腫瘤乏氧檢測中的應(yīng)用依賴于對腫瘤乏氧具有特異性的PET分子探針的開發(fā)。18F標記的硝基咪唑類化合物18F-FMISO[5-6]和18F-FAZA[7]以及64Cu標記的64Cu-ATSM[8-9]的研究在不同程度上取得了一定成功[10]。其中18FMISO是第一個用于臨床診斷研究的乏氧組織顯像劑。但目前18FMISO乏氧顯像仍有不足之處，主要包括：(1) 由于體內(nèi)組織有較低的18FMISO吸收率，使病灶與正常組織的吸收比不理想；(2) 正常組織對這類示蹤劑的細胞清除率慢，延誤成像并影響圖像質(zhì)量；(3) 由于18FMISO具有較高的親脂性，所以存在一定程度的神經(jīng)毒性。這些因素均妨礙了其臨床應(yīng)用[11]。

乏氧會在腫瘤內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生一系列的生理、生化變化。在乏氧環(huán)境中，乏氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)含量的變化可引起腫瘤細胞內(nèi)多種基因的高表達[12]，碳酸酐酶Ⅸ(carbonic anhydrase Ⅸ，CA Ⅸ)即是這些HIF-1的靶基因之一。作為碳酸酐酶的一個亞型，CA Ⅸ是一種跨膜蛋白，其活性位點在細胞膜表面，其主要生化作用是催化二氧化碳-碳酸的可逆反應(yīng)，和通過高度糖酵解產(chǎn)生的乳酸而降低腫瘤細胞pH值，使其酸化，從而提高腫瘤細胞的生存幾率和抵抗放射或化學治療的效果[13]。CA Ⅸ在人體內(nèi)大多數(shù)正常組織中沒有表達或表達很低，而在通過HIF-1誘導(dǎo)的多種實體腫瘤中有高度的表達(前列腺除外)，如子宮頸癌、頭頸部瘤、乳癌、肺癌、胰腺癌、軟組織肉瘤等[14]。這些性質(zhì)使CA Ⅸ作為一種腫瘤乏氧的內(nèi)源性標志物，是一個非常具有前景的腫瘤分子顯像診斷的靶點，并且磺胺類藥物對CA Ⅸ有很好的靶向性。因此，結(jié)合一些CA Ⅸ特異性的磺胺類分子探針通過PET顯像對腫瘤乏氧進行檢測是一種可靠、無創(chuàng)、方便的方法。這對腫瘤的早期診斷、準確分期、監(jiān)測復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移以及協(xié)助確定腫瘤治療方案，以提高腫瘤治療的效果、降低死亡率具有重要的現(xiàn)實意義和應(yīng)用價值。

Chrastina等[15]的研究表明，125I標記的CA Ⅸ單克隆抗體M75在經(jīng)24 h乏氧氣氛培養(yǎng)后的HT-29、HeLa、SiHa等腫瘤細胞內(nèi)的攝取比正常培養(yǎng)的細胞顯著增高，生物體內(nèi)分布實驗顯示125I-M75在HT-29腫瘤內(nèi)特異性濃集，與CA Ⅸ在腫瘤內(nèi)的高水平表達一致。111In標記的另外一種CA Ⅸ抗體G250也在荷瘤小鼠模型體內(nèi)取得了類似的結(jié)果[16]。但由于大分子抗體在體內(nèi)緩慢的藥代動力學過程，使得標記的抗體需24 h甚至更長時間才能完成與細胞上CA Ⅸ的結(jié)合，此外單抗價格昂貴，這些因素限制了它們作為分子顯像探針在臨床上的應(yīng)用。另外，體內(nèi)廣泛分布并和CA Ⅸ有競爭的CA Ⅰ和CA Ⅱ主要分布于細胞內(nèi)，而CA Ⅸ是一種跨膜蛋白，其活性位點在細胞膜表面，如果CA Ⅸ分子探針的親脂性高，會導(dǎo)致探針通過細胞膜，和細胞核內(nèi)部的CA Ⅰ和CA Ⅱ結(jié)合。因此理想的CA Ⅸ分子探針應(yīng)該具有良好的親水性，和CA Ⅸ有特異性結(jié)合，并且能夠方便快速的合成。

意大利Vullo,Garaj等人合成并篩選出一系列磺胺類CA Ⅸ抑制劑，其中一些化合物如2,3,5,6-四氟-3’-磺酰胺基苯酰替苯胺[17]、2,4-二甲氧基-6-[(4-磺胺基苯)甲基胺基]-1’，3’，5’-三嗪[18]、2,4-二甲氧基-6-[(4-磺胺基苯胺基)]-1’,3’,5’-三嗪[18]、2,4-二氯-6-[(4-磺胺基苯胺基)]-1’,3’,5’-三嗪[18]，均在實驗中顯示了高CA Ⅸ抑制能力(Ki<1 nmol/L)和高選擇性(抑制能力是對CA Ⅱ的26～706倍)。Wilkinson等[19]將帶端炔基的磺酰胺與帶疊氮基團的糖通過點擊化學方法(click chemistry)得到一系列的化合物，實驗表明其中化合物(3S，4S，5S，6R)-3，4，5-三羥基-6-(4-((4-磺胺基苯胺基)甲基)-1H-1，2，3-三氮唑-1-基)四氫-2H-吡喃-2-羧酸甲酯((3S,4S,5S,6R)-methyl 3,4,5-trihydroxy-6-(4-((4-sulfamoylbenz amido) methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl) tetrahydro-2H-pyran-2-carboxylate)有相對較高的CA Ⅸ抑制能力(Ki=23 nmol/L)和選擇性(抑制能力是對hCA Ⅱ、Ⅻ和ⅩⅣ的16.4、16.8和4.6倍)。武明星等[20-22]合成了可能具有高親和力和選擇性的CA Ⅸ抑制劑,其中化合物4-{[4-(2-氟乙氧基)-6-(2-羥基乙氧基)-1，3，5-三嗪-2氨基]甲基}苯磺酰胺對CA Ⅸ有較好的抑制能力，抑制常數(shù)為9.6。并且嘗試合成了18F標記的化合物4-[4-(2-氟[18F]乙氧基)-6-(2-羥基乙氧基)-1,3,5-三嗪-2-亞胺基]苯磺酰胺，但是標記率不是很理想，僅為5%。

1 實驗儀器及材料

AVANCE 400 MHz(或300 MHz)核磁共振儀，瑞士Bruker公司，選用TMS為內(nèi)標，化學位移值以δ值表示;AVATAR370 FTIR紅外光譜儀，美國Thermo Nicolet公司；GC CP3800-MS Saturn2100氣質(zhì)聯(lián)用分析儀，美國Varian公司；RE-52-2型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海申生科技有限公司；MicroMass GCT CA 055質(zhì)譜儀，美國安捷倫科技公司；放射性薄層掃描儀(Radio-TLC)，德國Merck公司；SN-697全自動雙探頭放射免疫伽馬計數(shù)儀，上海應(yīng)用物理研究所日環(huán)光電儀器有限公司；旋風30型回旋加速器，比利時IBA公司；FJ-391A2型微機放射性活度計，北京核儀器廠；高效液相系統(tǒng) Dionex P680 summmit HPLC分析系統(tǒng)，美國Dionex公司，HPLC柱為LoChrosorb C18，分為2種，分析柱：10 μm,300 mm×3.9 mm；半制備柱：10 μm，300 mm×7.8 mm；C18 plus Sep-Pak Cartridge柱，美國Waters公司；季銨型陰離子交換柱(quarternary methylamine column,QMA柱)，美國Waters公司。

對溴苯磺酰氯、2-甲基-3-丁炔-2-醇、4-二甲胺基吡啶(DMAP)、抗壞血酸鈉，日本TCI化學試劑公司；對氨基苯磺酰胺、間氨基苯磺酰胺，比利時Acros化學試劑公司；4，4’-二甲氧基三苯基氯甲烷，吉爾生化試劑有限公司；對甲基苯磺酰氯、三苯基膦二氯化鈀，美國Aldrich化學試劑公司；乙二醇，上海云翔化工有限公司；2-氟乙醇，上海元吉有限公司；4,7,13,16,21,24-六疊氮-1,10-二唑雙環(huán)酮K222(Kryptofix 222)、無水乙腈，比利時Acros公司；無水DMSO，美國Fluka化學試劑公司。除特別說明外，所有的商品化試劑使用前均未進一步純化處理。

昆明小鼠21只，每只約20 g，購于中國科學院上海實驗動物中心。

藥代動力學計算軟件DAS 2.0，蕪湖高斯數(shù)據(jù)分析有限公司提供。

2 p-[18F]FSTC的合成

p-[18F]FSTC合成路線示于圖1。

圖1 p-[18F]FSTC的合成路線Fig.1 Synthesis of p-[18F]FSTC

2.1 乙二醇二對甲苯磺酸酯(化合物2)的合成

向用冰浴冷卻的乙二醇(2.8 mL，50.0 mmol)、三乙胺(34 mL，250 mmol)和4-二甲胺基吡啶(0.3 g)的二氯甲烷(120 mL)溶液中，緩慢滴加對甲苯磺酰氯(24 g，125 mmol)的二氯甲烷(80 mL)溶液，0 ℃攪拌30 min后，室溫下攪拌過夜，蒸去二氯甲烷，硅膠柱純化得到淡黃色固體。

5.犢牛地方流行性肺炎。也叫運輸熱或稱運輸熱肺, 是由多種病原微生物所引起犢牛的一種急性呼吸道傳染病。以發(fā)熱、流鼻液、急性肺炎和纖維素性胸膜炎為特征。

2.2 2-疊氮乙基對甲苯磺酸酯(化合物3)的合成

向化合物2(3.7 g，10 mmol)的無水DMF(20 mL)溶液中，分批加入疊氮化鈉(0.65 g，10 mmol)，室溫反應(yīng)48 h，過濾，濾液倒入200 mL水中，再用3×30 mL乙酸乙脂萃取，經(jīng)飽和食鹽水洗滌、硫酸鈉干燥后除去溶劑，硅膠柱純化得到淡黃色油狀物。

2.3 [18F]氟離子的生產(chǎn)和活化

[18F]F-由上海市復(fù)旦大學附屬腫瘤醫(yī)院提供，具體生產(chǎn)條件如下：采用核反應(yīng)18O(p，n)18F，應(yīng)用小體積(1.5 mL)H2O[18O]富氧水(95%)靶，在回旋加速器上用質(zhì)子束流連續(xù)轟擊15～60 min，得到的[18F]F-富集在QMA柱上，由1 mL含K222和K2CO3的溶液洗脫得到[18F]F-溶液。100 ℃下氮氣流中共沸蒸干后直接用于反應(yīng)。

2.4 2-[18F]氟疊氮乙烷的制備

向活化后含有[18F]F-的反應(yīng)瓶中，加入2-疊氮乙基對甲苯磺酸酯(5 mg，20.7 μmol)的300 μL無水乙腈的溶液，90 ℃反應(yīng)15 min，將反應(yīng)體系用冰水浴冷卻到室溫，通過TLC檢測反應(yīng)進展情況(流動相：乙酸乙酯，Rf=0.88)。該體系不做分離直接用于下一步反應(yīng)。

2.5 p-[18F]FSTC的制備

氮氣保護下，向100 μL 0.10 mol/L pH=6.0磷酸鹽(PBS)緩沖溶液中，依次加入50 μL 0.45 mol/L硫酸銅溶液和100 μL 1.50 mol/L抗壞血酸鈉溶液，4-丙炔酰胺基苯磺酰胺(5 mg，22.3 μmol)的150 μL DMF和100 μL t-BuOH溶液，上一步制備的2-[18F]氟疊氮乙烷的乙腈溶液300 μL。在35 ℃反應(yīng)15 min后加10 mL水稀釋，Sep-Pak C-18柱純化得粗產(chǎn)物后，再用半制備HPLC柱來純化目標產(chǎn)物(流動相是水和乙醇梯度淋洗，流速為1.5 mL/min，UV(254 nm)檢測和放射性檢測，接收19.2～23.2 min之間的組分，蒸掉溶劑后，用50 μL乙醇和2 mL 9%生理鹽水溶解)。

2.6 p-[18F]FSTC注射液的質(zhì)量控制

上述溶液用0.22 μm微孔濾膜過濾滅菌后得到[18F]FSTC注射液，肉眼觀察其外觀性狀，HPLC分析柱分析檢測(流動相由純水(流動相A)和乙腈(流動相B)兩相組成，經(jīng)過UV(254 nm)檢測器和放射性檢測器，梯度分離條件為：0 min，5% B；5 min，5% B；10 min，38%B；25 min，38%B；30 min，5% B。流速為1 mL/min。保留時間為14 min)。

2.7 p-[18F]FSTC的體外穩(wěn)定性測試

磷酸鹽緩沖液(PBS)法：取100 μL (3.7 MBq)p-[18F]FSTC注射液，置于1 mL pH=7.24、0.02 mol/L PBS中，37 ℃孵育30、60、120、180 min后，采用Radio-TLC(V(乙酸乙酯)∶V(石油醚)=3∶1)法測定其放射化學純度，以觀察其體外穩(wěn)定性。

小牛血清(BS)法：取100 μL (3.7 MBq) p-[18F]FSTC注射液，置于1 mL小牛血清BS中， 37 ℃孵育30、60、120、180 min后，依次取100 μL混合液，加入100 μL乙腈，渦旋1 min，4 ℃ 13 500 r/min條件下離心10 min，取上清液用Radio-TLC(V(乙酸乙酯)∶V(石油醚)=3∶1)測定其放射化學純度，以觀察其體外穩(wěn)定性。

2.8 p-[18F]FSTC的脂水分配系數(shù)(lg P)的測定

取5 μL [18F]FSTC制劑于5 mL vial(含有1 mL 1-octanol和1 mL pH=7.24 0.02 mol/L PBS)，密封好，在室溫下渦旋10 min，靜置至兩相平衡。依次取出有機相和水相各500 μL置于γ計數(shù)管中，用γ計數(shù)器測定計數(shù)。重復(fù)3次，據(jù)下列公式，計算得到p-[18F]FSTC的平均lgP值。

lgP=lg (有機相中計數(shù)/水相中計數(shù))

3 p-[18F]FSTC初步生物學評價

3.1 體內(nèi)脫氟穩(wěn)定性實驗

將約3.7 MBq/100 μL p-[18F]FSTC生理鹽水，經(jīng)尾靜脈注射到9只小白鼠體內(nèi)(每只約20 g)，分別于注射后30、60、120 min時眼眶取血。血液收集到50 μL肝素化的指型管中，立即離心分離(13 500 r/min，4 ℃)5 min，得到約300 μL上清液，加入等量的乙腈，渦旋2 min，然后再離心分離(13 500 r/min，4 ℃)5 min，得到約400 μL上清液，通過Radio-TLC (V(乙酸乙酯)∶V(石油醚)=3∶1)測定其放射化學純度，以觀察其體內(nèi)脫氟穩(wěn)定性。

3.2 血液清除實驗

將約3.7 MBq/100 μL p-[18F]FSTC生理鹽水，經(jīng)尾靜脈注射到3只小白鼠體內(nèi)，分別于注射后1、3、5、10、15、30、45、60、90、120 min時斷尾，用移液槍準確移取5 μL血樣，置于計數(shù)管底部，測放射性計數(shù)(N)，用N0=Nt×exp(0.006 32t)校正后繪制每5 μL血液中的計數(shù)-時間關(guān)系曲線。用藥代動力學計算軟件DAS 2.0計算其藥代動力學參數(shù)。

3.3 正常鼠體內(nèi)分布實驗

將約3.7 MBq/100 μL p-[18F]FSTC生理鹽水，經(jīng)尾靜脈注射到9只正常小白鼠體內(nèi)，分別于注射后60、120、180 min時處死，取心臟、肝臟、脾、肺、腎、胃、腸、肌肉、骨頭、血、腦、甲狀腺等相應(yīng)器官置于事先稱量好的計數(shù)管底部，稱重，測量計數(shù)經(jīng)衰變校正后計算每克組織百分注射劑量率(%ID/g)。

4 結(jié)果和討論

4.1 p-[18F]FSTC的放化合成和質(zhì)量控制

首先由對甲苯磺酸-2-疊氮乙酯經(jīng)親核取代18F標記得到2-疊氮-1-[18F]氟乙醇，再和4-丙炔酰胺基苯磺酰胺在Cu(I)作用下通過點擊化學兩步反應(yīng)最終合成p-[18F]FSTC。

合成過程中得到化合物2(淡黃色固體)12 g，收率65%；Rf=0.73(展開劑：V(乙酸乙酯)∶V(石油醚)=1∶2)；熔點120.8～121.4 ℃；IR (KBr，ν)：3 432、2 970、2 940、1 601、1 373、1 364、1 176、1 095、1 033、1 010、915、804、772 cm-1。得到化合物3(淡黃色油狀物)0.69 g，收率28.8%；

合成總共花費時間約為60 min，第一步反應(yīng)用放射性TLC分析顯示標記率為90%，第二步點擊化學反應(yīng)幾乎100%反應(yīng)。衰變校正后總放化產(chǎn)率54.2%。p-[18F]FSTC注射液放化純度大于98%，外觀為無色澄清透明液體。

4.2 p-[18F]FSTC的體外穩(wěn)定性測試

4.2.1體外穩(wěn)定性實驗(PBS法) p-[18F]FSTC在pH=7.24 0.02 mol/L PBS緩沖溶液中于37 ℃下孵育3 h后放化純度(RCP)沒有明顯變化，仍然大于98%(圖2a)。

4.2.2體外穩(wěn)定性實驗(BS法) p-[18F]FSTC在小牛血清中37 ℃下孵育3 h后放化純度沒有明顯變化，仍然大于98%(圖2b)。

圖2 p-[18F]FSTC的體外穩(wěn)定性Fig.2 Stability of p-[18F]FSTC in vitro(a)——pH=7.24 0.02 mol/L PBS，(b)——BS

4.3 p-[18F]FSTC的lg P測定值

p-[18F]FSTC的脂水分配系數(shù)lgP=-0.016±0.013。

4.4 體內(nèi)脫氟穩(wěn)定性實驗結(jié)果

圖3為p-[18F]FSTC在小鼠體內(nèi)的穩(wěn)定性研究結(jié)果。由圖3結(jié)果可知，p-[18F]FSTC注入小鼠體內(nèi)3 h后，Radio-TLC分析顯示放化純度仍然大于97%，說明該藥物在體內(nèi)不易脫氟。

圖3 p-[18F]FSTC在小鼠體內(nèi)的穩(wěn)定性研究Fig.3 Stability of p-[18F]FSTC in vivo

4.5 血液清除曲線

p-[18F]FSTC血液清除曲線示于圖4。由藥代動力學計算軟件DAS 2.0雙室模型給出的分布相和清除相半衰期分別為t1/2α≈2 min，t1/2β≈99 min(n=3)。以上數(shù)據(jù)表明該探針能迅速分布到全身，但在血中滯留時間較長。

圖4 p-[18F]FSTC血液清除曲線Fig.4 Curve of blood clearance of p-[18F]FSTC

4.6 正常鼠體內(nèi)分布實驗

p-[18F]FSTC在正常小鼠體內(nèi)各器官的分布

數(shù)據(jù)列于表1。由表1數(shù)據(jù)可知，p-[18F]FSTC在血液中的濃度很高，60、120、180 min時的放射性攝取依次為59、44、42。說明該藥物在血液中清除非常緩慢，這可能會造成模型鼠Micro-PET顯像時非靶組織攝取過高，效果不理想。其次在脾、肺、腎、胃中的吸收也比較高。p-[18F]FSTC在胃中的高吸收與CA Ⅸ在胃腸道中的較高表達[14]相一致。在今后的研究中如果能在p-[18F]FSTC結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上引入羧基、羥基等一些親水性基團，以提高探針的水溶性，增強和CA Ⅸ的特異性結(jié)合，可能會獲得更為理想的分布及顯像效果。

表1 p-[18F]FSTC在正常小鼠體內(nèi)分布Table 1 Biodistribution of p-[18F] FSTC in normal mice

注(Note)：n=3

5 結(jié) 論

本課題為研究開發(fā)一種適合18F標記的用于CA Ⅸ檢測的特異性PET探針，快速高效的合成了PET探針p-[18F]FSTC。p-[18F]FSTC在體內(nèi)外都非常穩(wěn)定，正常小鼠體內(nèi)分布結(jié)果顯示其在血液中的清除很慢，在脾、肺、腎、胃中的攝取較高。本工作為進一步研制開發(fā)針對CA Ⅸ的腫瘤乏氧顯像PET探針提供了實驗依據(jù)。

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