血清脂蛋白a和載脂蛋白a(TTTTA)(n)基因多態(tài)性與血管性認(rèn)知功能障礙的關(guān)系*

于愛(ài)玲 趙仁亮 王 勤 秦麗晨

(1青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東 青島 266003；2 泰山醫(yī)學(xué)院附屬泰山醫(yī)院，山東 泰安 271000)

血管性認(rèn)知功能障礙 (vascular cognitive impairment, VCI)是血管或與血管相關(guān)因素引起的認(rèn)知功能障礙，它可以單獨(dú)發(fā)生或與Alzheimer病合并出現(xiàn)[1]。VCI范圍包括非癡呆血管性認(rèn)知功能障礙、血管性癡呆、伴有血管因素的阿爾茨海默病((AD)三大類，均與動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)[2]。Apo(a)是脂蛋白(a)[]的獨(dú)特抗原成分，是一種高度糖基化的蛋白質(zhì)，具有促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的作用，近年來(lái)成為遺傳學(xué)和生物化學(xué)的研究熱點(diǎn)之一[3]。在Apo(a)5’端側(cè)翼1.5 kb內(nèi)存在一個(gè)5核苷酸的重復(fù)序列(TTTTA)n(pentanucleotide repeats，PNR)顯示多態(tài)性，對(duì)研究遺傳和預(yù)測(cè)動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)性具有一定的價(jià)值[4]。血清Lp(a)與心腦血管病密切相關(guān)，而其與血管性認(rèn)知功能障礙的關(guān)系尚不清楚。為此我們檢測(cè)了2008年1月至2009年8月在我院診治122例VCI患者血清LP(a)濃度及Apo(a)基因的5’調(diào)控區(qū)(TTTTA)n基因的多態(tài)性，并與88例健康查體者對(duì)照，探討Apoa (TTTTA)n基因多態(tài)性在血管性認(rèn)知功能障礙患者中的分布狀況及其與血清Lp(a)水平的關(guān)系，為VCI的早期治療及進(jìn)行一級(jí)和二級(jí)預(yù)防提供依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1對(duì)象 病例組為2008年1月至2009年8月在我院診治的血管性認(rèn)知功能障礙患者122例，男78例，女44例，平均年齡65歲。均按蒙特利爾認(rèn)知評(píng)估量表(Montreal Cognitive Assessment, MoCA)加簡(jiǎn)易精神狀態(tài)檢查量表(MMSE)選取，同時(shí)排除以下原因?qū)е碌恼J(rèn)知障礙，如中樞神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷、感染、代謝性疾病、正常壓力腦積水、葉酸或者維生素B12缺乏、甲狀腺功能低下、癲癇、腫瘤、多發(fā)性硬化、精神病、酗酒或?yàn)E用藥物等，另排除漢密爾頓抑郁量表(Hamilton Depression, HAMD)<8分，漢密爾頓焦慮量表(HAMA) <7分患者。對(duì)照組88例，男51例，女37例，平均年齡60歲，均為同地區(qū)同期同年齡組同種族健康老年人。病例組與對(duì)照組性別構(gòu)成比及受教育程度無(wú)顯著性差異，且兩組均排除肝、腎、內(nèi)分泌等影響脂質(zhì)代謝的疾病。

1.2血清Lp(a)測(cè)定 用免疫放射比濁法,在全自動(dòng)生化儀上進(jìn)行檢測(cè)。以300 mg/l為界。

1.3基因組DNA提取和Apo(a)PNR基因型測(cè)定 100 μl全血采用碘化鈉法提取基因組DNA。用一對(duì)寡核苷酸引物擴(kuò)增Apo(a)PNR基因序列，引物序列為P1:5’-GAATTCATITrGcGGAAAGATrG-3’；P2：5’-CTTCAACCCGGGTGAGAGTCTC-3’，反應(yīng)體系及反應(yīng)條件參照Malgaretti等[5]的方法。取PCR產(chǎn)物1.5 μl，加樣于2.5%的瓊脂糖凝膠上電泳，100 V、60mA、電泳30 min，在紫外燈箱里觀察電泳條帶，然后取電泳條帶較亮的PCR產(chǎn)物2.0μl予6%變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳，400 V、7mA預(yù)電泳20 min，然后1000 V、12 mA電泳2 h結(jié)束。最后用銀染法染色，并觀測(cè)結(jié)果。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用方差分析，組間比較用q檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。全部數(shù)據(jù)采用Excel 2003軟件處理。

2 結(jié) 果

2.1基因型檢測(cè)結(jié)果 采用PCR技術(shù)擴(kuò)增出含五核苷酸重復(fù)序列的Apo(a)基因片段，經(jīng)6%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離擴(kuò)增產(chǎn)物，共檢出8種五核苷酸重復(fù)序列等位基因，16種五核苷酸重復(fù)序列基因型，分別為4/4、4/9、5/5、5/6、5/7、5/8、5/9、5/11、7/8 、7/9、8/9、8/10 、8/11 、9/9、10/10、和10/11。DNA片段長(zhǎng)度76～1 l 1bp。常見(jiàn)基因型電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 PCR擴(kuò)增Apo(a)(TTTTA)n基因型，6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳后銀染色圖譜。兩側(cè)為Marker,其中分別為1：4/9，2：7/8，3：7/9，4：5/8，5：8/8，6：8/9，7：9/9，8：8/11

2.2病例組與對(duì)照組中主要基因型頻率分布情況(表1)。兩組人群Apo(a)PNR共檢出16種基因型和7種等位基因，兩組人群基因型頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡，具有群體代表性。兩組人群男、女間基因型分布沒(méi)有顯著差異，但兩組人群間Apo(a)PNR基因型有顯著差異。兩組中純合子8/8基因型攜帶者占整個(gè)人群的50%左右，血管性認(rèn)知功能障礙組中5/8基因型分布頻率高于對(duì)照組，基因頻率分布差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=14．59，P<0.05)。

表1 血管性認(rèn)知功能障礙組和對(duì)照組中主要基因型頻率

2.3高Lp(a)組及低Lp(a)組中基因型分布見(jiàn)表2。高Lp(a)組5/8基因型攜帶者明顯高于低Lp(a)組(P<0．01)。

表2 高Lp(a)組和低Lp(a)組主要基因型的分布頻數(shù)

2.4高Lp(a)組和低Lp(a)組中血管性認(rèn)知功能障礙的發(fā)病情況： 高Lp(a)組中血管性認(rèn)知功能障礙患者人數(shù)為38，發(fā)病比例為0.76，而低Lp(a)組中血管性認(rèn)知功能障礙患者共84人，發(fā)病比例為0.53。血管性認(rèn)知功能障礙病人在兩組中的分布亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9．57，P<0.01)。

2.5基因型與血清Lp(a)水平的關(guān)系 對(duì)照組中5/8基因型Lp(a)水平雖然高于其他幾種基因型，但只有5/8型基因型與8/9基因型相比差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而與其他基因型間的Lp(a)比較差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在血管性認(rèn)知功能障礙組中，5/8基因型攜帶者的Lp(a)水平均高于其他幾種主要基因型攜帶者，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表3

表3 基因型與VCI組和對(duì)照組Lp(a)水平的關(guān)系

注：a=2.36，為對(duì)照組4種基因型組間比較；b=2.89，為VCI組4種基因型組間比較；c=3.37，為VCI組5/8與8/8均數(shù)兩兩比較；d=4.61，為對(duì)照組5/8與8/9均數(shù)兩兩比較；e=4.21，為VCI組5/8與8/9均數(shù)兩兩比較；f=VCI組5/8與9/9均數(shù)兩兩比較；以上P<0.05。

3 討 論

近年來(lái)，國(guó)際上提出了血管性認(rèn)知功能損害(vascular cognitive impairement, VCI)的概念,呼吁積極識(shí)別和控制引起各種認(rèn)知損害的血管性危險(xiǎn)因素。我國(guó)亦根據(jù)國(guó)情在2007年編篡了《血管性認(rèn)知功能損害專家共識(shí)》。此共識(shí)再一次從血管角度要求臨床醫(yī)師重視VCI的病因之一動(dòng)脈粥樣硬化的早期控制。

許多學(xué)者認(rèn)為L(zhǎng)P(a)參與并加速動(dòng)脈硬化的形成和發(fā)展，是心腦血管疾病的危險(xiǎn)因素[6,7]。LP(a)的高血清濃度與冠心病、腦血管病、糖尿病等多種疾病有密切的相關(guān)性。劉曉寧等[8]的研究證實(shí)腦梗死組中LP(a)較對(duì)照組高，且Apo(a)n的小片斷重復(fù)與腦梗死的發(fā)病有關(guān)。侯澤等[9]報(bào)道糖尿病血管并發(fā)癥如視網(wǎng)膜病變，腎病變組血清LP(a)水平升高。本研究結(jié)果亦顯示高血清LP(a)組中血管性認(rèn)知功能障礙發(fā)病率高。提示高血清LP(a)者需引起人群注意。有研究認(rèn)為L(zhǎng)P(a)無(wú)法用藥物來(lái)調(diào)控，故對(duì)高血清LP(a)人群，需及早加強(qiáng)其它誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化可控高危因素如吸煙，飲酒，肥胖等的控制。

LP(a)是一種與低密度脂蛋白(LDL)類似的脂蛋白，由LDL成分和Apo(a)組成。LP(a)的血清濃度與Apo(a)分子量大小成反比，主要由Apo(a)基因的多態(tài)性決定，有個(gè)體差異和種族差異。其中導(dǎo)致Apo(a)基因多態(tài)性的位點(diǎn)有一個(gè)是由位于Apo(a)基因1373bp處起始密碼子前5個(gè)核苷酸序列(TTTTA)n的重復(fù)數(shù)目決定[10]。本研究檢測(cè)200名中國(guó)泰安地區(qū)漢族人，共檢出8種等位基因，16種基因型。這與中國(guó)湖北地區(qū)漢族人群載脂蛋白(a)(TTTTA)n檢出結(jié)果略有不同[11]。但本研究檢出的常見(jiàn)等位基因型與胡波報(bào)道相似,主要為5/8、8/8、8/9、9/9型。在血管性認(rèn)知功能障礙組中5/8基因型頻率高于對(duì)照組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在血管性認(rèn)知功能障礙組中，5/8基因型攜帶者的Lp(a)水平均高于其他幾種主要基因型攜帶者，也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而在對(duì)照組中高LP (a)組的Apo(a)(TTTTA)n基因型以5/8型多見(jiàn)，但除5/8型基因型與8/9基因型相比差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余各型差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此研究結(jié)果提示Apo(a)(TTTTA)n基因型差異與血管性認(rèn)知功能障礙有一定相關(guān)性。Apo(a)重復(fù)序列數(shù)為5的等位基因可能是我國(guó)泰安地區(qū)漢族人群血管性認(rèn)知功能障礙病人的一個(gè)危險(xiǎn)因素之一，在血管性認(rèn)知功能障礙的防治工作中應(yīng)予以重視。

目前對(duì)不同種族的研究結(jié)果顯示，至今已發(fā)現(xiàn)8種等位基因，其中重復(fù)序列數(shù)為6的等位基因多見(jiàn)于黑種人，而重復(fù)序列數(shù)為4、5的等位基因多見(jiàn)于黃種人，歐美白種人中未見(jiàn)重復(fù)序列數(shù)為4、5、6的等位基因出現(xiàn)[12]。本實(shí)驗(yàn)檢出的基因型與國(guó)內(nèi)外報(bào)道的不甚相同，提示存在種族和地區(qū)差異。Apo(a)(TTTTA)n基因多態(tài)性及它的地區(qū)和種族差異為血管性認(rèn)知功能障礙的基因研究和防治提供了重要參考依據(jù)。但本研究亦有局限之處。因?yàn)閂CI是一綜合征，是一籠統(tǒng)的概念，沒(méi)有唯一的診斷標(biāo)準(zhǔn)，不同的診斷標(biāo)準(zhǔn)VCI的患病率和發(fā)病率不同[1，13]。而且本研究中病例組入選患者中以腦血管因素致VCI者為多，腦血管外因素致VCI者少些。故血清LPa和Apo(a)(TTTTA)(n)基因多態(tài)性與血管性認(rèn)知功能障礙的關(guān)系尚可通過(guò)不同VCI診斷標(biāo)準(zhǔn)等來(lái)做進(jìn)一步的研究。

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