鎳鈦記憶合金支架治療兔外耳道狹窄的實(shí)驗(yàn)研究

王孟冬 黃志純 顧建興 孫寶賓 馮旭

外耳道閉鎖(包括伴隨的中耳及耳廓畸形)是臨床上導(dǎo)致傳導(dǎo)性聽(tīng)力障礙的常見(jiàn)原因之一。雖然國(guó)內(nèi)外耳科學(xué)者采用了外耳道薄層皮瓣或中厚皮瓣植皮、明膠海綿或碘仿紗條填塞及硅膠管擴(kuò)張、瘢痕形成后局部類(lèi)固醇激素注射等方法，都不能完全阻止新造外耳道的再狹窄。其重要原因之一是傳統(tǒng)擴(kuò)張材料如硅膠管等壓力不均勻、不易固定、易繼發(fā)感染等最終導(dǎo)致治療失敗。鎳鈦記憶合金支架具有優(yōu)良的生物相容性，耐腐蝕，長(zhǎng)期使用無(wú)毒副作用，具有超彈性，可通過(guò)植入裝置植入比本身更狹窄的管腔，不僅可以產(chǎn)生更大的壓力，同時(shí)也有良好的固定效果[1，2]。因此，鎳鈦記憶合金支架在臨床上已逐步取代了不銹鋼及其他成分的擴(kuò)張材料，成為治療人體各種腔道狹窄的首選材料。為了探討使用鎳鈦記憶合金支架治療外耳道狹窄的可行性，本研究分別應(yīng)用鎳鈦記憶合金支架和硅膠管治療兔外耳道瘢痕狹窄，并比較其療效，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇和分組 16只外耳道瘢痕狹窄的新西蘭大白兔動(dòng)物模型[3]，兩組兔外耳道瘢痕狹窄的直徑差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。年齡2～3歲，性別不限，隨機(jī)分為植皮組與不植皮組，每組各8只16耳，采用自身對(duì)照的方法進(jìn)行研究，各組在兔的雙側(cè)外耳道分別植入鎳鈦記憶合金支架和硅膠管。

1.2置入材料 硅膠管的選擇：普通白色硅膠管，外徑6 mm，內(nèi)徑4 mm，購(gòu)自南京晚晴公司，每節(jié)硅膠管長(zhǎng)度為20 mm。鎳鈦記憶合金支架植入器的研制：支架材料由本研究小組與南京微創(chuàng)醫(yī)學(xué)科技有限公司共同合作，采用通過(guò)國(guó)家鑒定并在臨床使用的鎳鈦記憶合金初步研制出適合外耳道狹窄使用的鎳鈦記憶合金支架(以下簡(jiǎn)稱(chēng)“支架”)，長(zhǎng)20 mm，外徑6 mm，外覆硅膠膜，上有12個(gè)直徑1 mm的微孔,便于外耳道分泌物的排出。

1.3置入方法 不植皮組：動(dòng)物0.6%戊巴比妥那(4 ml/kg)全身麻醉后將支架壓入置入器外管，插入內(nèi)芯送至置入器最前端，按刻度指示送至距外耳道口2 cm處，固定置入器內(nèi)芯并撤出外管，支架自然膨脹固定。將硅膠管置入同一兔的另一側(cè)外耳道后固定，肌肉注射青霉素40萬(wàn)單位/次，2次/日，預(yù)防感染。植皮組：同法麻醉動(dòng)物后，切除少量外耳道瘢痕組織，暴露新鮮創(chuàng)面，于兔耳廓腹側(cè)避開(kāi)較大血管，切取長(zhǎng)條形皮膚長(zhǎng)約2 cm，寬約1 cm，深達(dá)軟骨面，熱燒灼止血，外涂0.5%金霉素眼膏。將所取皮膚按不同個(gè)體卷成不同直徑的皮瓣，前后對(duì)稱(chēng)各選2點(diǎn)縫合后再縫合于兔耳根部皮膚上。同法固定支架及硅膠管，并肌肉注射青霉素預(yù)防感染。

1.4觀察指標(biāo)與方法

1.4.1大體觀察外耳道直徑 植皮組在支架置入后第5、15、30、60天時(shí)，臨時(shí)取出擴(kuò)張管，用耳內(nèi)窺鏡觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物外耳道分泌物及鼓膜情況，游標(biāo)卡尺分別測(cè)量雙側(cè)外耳道直徑大小。

1.4.2HE染色觀察成纖維細(xì)胞 不植皮組在支架和硅膠管置入后第5、15、30、60天時(shí)，臨時(shí)取出雙側(cè)外耳道的擴(kuò)張管，分別取雙側(cè)外耳道瘢痕組織行HE染色，觀察瘢痕中成纖維細(xì)胞增生情況。在400倍的視野下，觀察6個(gè)視野的成纖維細(xì)胞的數(shù)量，取平均值。

1.4.3RT-PCR檢測(cè)TGFβ1表達(dá) 不植皮組在支架和硅膠管置入后第5、15、30、60天分別取雙側(cè)外耳道瘢痕組織，提取RNA，與β肌動(dòng)蛋白(βactin)一起行RT-PCR，使用ImageMasterVDS圖像分析儀進(jìn)行掃描攝像保存，用Total lab軟件分析圖譜并將TGFβ1/βactin比值作為半定量數(shù)值觀察瘢痕中TGFβ1的表達(dá)情況。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS12統(tǒng)計(jì)軟件，組內(nèi)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1大體觀察外耳道直徑 2月后植皮組取出擴(kuò)張材料，鎳鈦記憶合金支架側(cè)外耳道植皮表面除有淺表的網(wǎng)狀壓痕外皮膚表面光滑；硅膠管側(cè)外耳道植皮部分皮膚有皺縮；兩側(cè)植入后各時(shí)間點(diǎn)外耳道的直徑均增大，鎳鈦記憶合金支架側(cè)外耳道直徑較硅膠管側(cè)增大明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，兩側(cè)外耳道直徑增大越明顯，除30天外，各時(shí)間點(diǎn)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2HE染色 不植皮組鎳鈦記憶合金支架側(cè)和硅膠管側(cè)置入后各時(shí)間點(diǎn)外耳道瘢痕組織中成纖維細(xì)胞數(shù)均逐漸下降，除30天外，各時(shí)間點(diǎn)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在同一時(shí)間點(diǎn)，鎳鈦記憶合金支架側(cè)外耳道瘢痕中成纖維細(xì)胞數(shù)量較硅膠管側(cè)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表2)。

2.3RT-PCR檢測(cè) 不植皮組鎳鈦記憶合金支架和硅膠管置入后各時(shí)間點(diǎn)所取瘢痕組織中的TGFβ1mRNA/β-actin比值均下降，除術(shù)后30天外，各時(shí)間點(diǎn)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；同一時(shí)間點(diǎn)鎳鈦記憶合金支架側(cè)瘢痕中TGFβ1mRNA/β-actin比值較硅膠管側(cè)明顯降低，差異有統(tǒng)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表2)。

3 討論

人外耳道閉鎖術(shù)后再狹窄主要是由于創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程中瘢痕組織中成纖維細(xì)胞增生活躍，細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積所致[4]。TGFβ1是一種多功能細(xì)胞因子，在細(xì)胞外基質(zhì)合成和重塑方面起到關(guān)鍵的作用，同時(shí)參與了成纖維細(xì)胞的凋亡過(guò)程,是組織損傷的上調(diào)基因,其作用貫穿于創(chuàng)傷愈合過(guò)程的始終[5]。因此，本實(shí)驗(yàn)選用TGFβ1作為瘢痕增生的檢測(cè)指標(biāo)，由于RT-PCR檢測(cè)TGFβ1為半定量方法，故采用同時(shí)測(cè)量?jī)?nèi)參β-actin并計(jì)算比值的方法確定TGFβ1相對(duì)值以便于比較。

表1 植皮組鎳鈦記憶合金支架側(cè)與硅膠管側(cè)術(shù)后不同時(shí)間兔外耳道直徑變化比較(n=8耳)

注：*與硅膠管側(cè)同一時(shí)間點(diǎn)比較，P<0.05

表2 不植皮組鎳鈦記憶合金支架側(cè)與硅膠管側(cè)各時(shí)間點(diǎn)瘢痕組織中成纖維細(xì)胞的數(shù)量(個(gè))和TGFβ1mRNA/β-actin比值(n=8耳)

注：*與硅膠管側(cè)同一時(shí)間點(diǎn)比較，P<0.05

增生性瘢痕的治療方法很多，如硅膠膜、注射類(lèi)固醇激素、加壓治療等[6]，加壓療法是所有非侵入療法中最有效和應(yīng)用最廣泛的方法之一。李世榮等[7]報(bào)道加壓能抑制瘢痕組織增生的機(jī)理可能是：①壓力造成瘢痕組織相對(duì)缺血，使螺旋狀膠原重新排列，組織二氧化碳分壓升高，氧分壓降低，血管數(shù)量減少，水腫減輕；②壓力使血管內(nèi)皮細(xì)胞退變，使血管壁損傷加重，造成組織缺血，抑制了瘢痕增生；③缺氧狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)氧分壓降低，線粒體的功能減退甚至停止，同時(shí)發(fā)生形態(tài)學(xué)改變，如線粒體腫脹、空泡變性等，導(dǎo)致承擔(dān)細(xì)胞生物氧化作用的線粒體不能在氧化磷酸化過(guò)程中釋放能量，致使成纖維細(xì)胞的增生受到抑制，最后發(fā)生變性壞死，使生成膠原纖維和基質(zhì)的能力降低，從而抑制了瘢痕增生。治療開(kāi)始時(shí)間越早，持續(xù)的時(shí)間越長(zhǎng)，其預(yù)防和治療效果越好[8～10]。

使用硅膠管等材料進(jìn)行加壓擴(kuò)張，防治外耳道再狹窄，存在以下不足：①硅膠管管壁厚、無(wú)彈性，難以與外耳道形狀相吻合，對(duì)外耳道植皮壓力分布不均勻，影響外耳道植皮存活；②不易固定、易脫出；③管壁無(wú)縫隙，妨礙了外耳道創(chuàng)面滲液的排出并影響耳內(nèi)滴藥的療效，術(shù)后易繼發(fā)感染。

鎳鈦記憶合金支架具有獨(dú)特的形狀記憶性能和超彈性，可以通過(guò)低溫或物理方法將支架縮小口徑，通過(guò)原來(lái)難以經(jīng)過(guò)或不能到達(dá)的部位，然后利用溫度或超彈性使支架自然膨脹，達(dá)到使狹窄管腔擴(kuò)大的目的。研究表明鎳鈦記憶合金支架具有良好的力學(xué)性能及優(yōu)良的生物相容性和耐腐蝕性，是一種理想的醫(yī)用生物材料[2]。

本課題組與南京微創(chuàng)醫(yī)學(xué)科技有限公司合作，設(shè)計(jì)了供實(shí)驗(yàn)用的鎳鈦記憶合金支架，該支架具有以下特點(diǎn)：①支架直徑適合外耳道大小，有彈性，可彎曲，具有超彈性,植入后對(duì)外耳道植皮壓力分布較均勻，利于植皮存活；②支架呈網(wǎng)格狀，外覆帶微孔的被膜,便于外耳道創(chuàng)面分泌物的排出和耳內(nèi)滴藥；③研制配套的支架植入設(shè)備，使支架容易放置及取出；④支架易固定、不易脫出。本實(shí)驗(yàn)顯示支架側(cè)外耳道瘢痕組織中成纖維細(xì)胞的數(shù)量明顯少于硅膠管側(cè)，去除擴(kuò)張物后支架側(cè)的外耳道直徑明顯大于硅膠管側(cè)，且植皮生長(zhǎng)良好，無(wú)感染及再狹窄發(fā)生，說(shuō)明鎳鈦記憶合金支架對(duì)兔外耳道瘢痕組織中成纖維細(xì)胞的增生有更明顯的抑制作用，能有效地抑制外耳道中瘢痕組織的增生。這可能是由于鎳鈦記憶合金支架對(duì)外耳道的壓力比硅膠管更大且更均勻的緣故。亦提示TGFβ1可以作為判斷瘢痕增生程度的一項(xiàng)輔助指標(biāo)，從而證實(shí)了鎳鈦記憶合金支架的優(yōu)越性。

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