四種藥用植物花總黃酮類物質(zhì)提取及抗氧化性研究

于文廣,王 郝,白 瑩,符永鵬,王文英,吳冬青

(西部資源環(huán)境化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河西學(xué)院化學(xué)系,甘肅張掖 734000)

黃酮類化合物是具有酚羥基結(jié)構(gòu)的一類還原性化合物,其生理作用具有多種多樣性。

總黃酮廣泛存在于植物界中,有良好的抗氧化性能和消除自由基、抗腫瘤、抗突變的作用[1]。自由基生物學(xué)研究認(rèn)為,許多疾病與自由基導(dǎo)致的生物大分子如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)以及 DNA氧化損傷有關(guān),尤其是活性氧如超氧陰離子自由基、羥基自由基、脂質(zhì)自由基與心腦血管疾病、糖尿病、癌癥等密切相關(guān)[2]。本文采用微波輔助法提取 4種藥用植物花中總黃酮類化合物,通過(guò)鄰二氮菲 -Fe2+-H2O2體系和普魯士藍(lán)法,用分光光度法對(duì) 4種藥用植物花提取物抗氧化性進(jìn)行了研究,為進(jìn)一步開發(fā)利用資源提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

小瓣玫瑰 (Rose rugosaThunb.)(采集于甘肅省天?？h);大薊刺兒菜花 (Cirsium japonicamDC.)(采集于甘肅省河西學(xué)院校園);百合花 (L ilium)(采集于甘肅省臨洮縣);夏至草花〔lagopsis supine(Steph.)IK.〕(采集于甘肅省隴西縣)。材料洗凈、陰干,粉碎備用。

1.2 主要試劑

蘆丁 (生化試劑,中國(guó)醫(yī)藥 (集團(tuán))上海化學(xué)試劑公司)、鄰二氮菲、雙氧水、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、硫酸亞鐵、三氯乙酸、三氯化鐵等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 主要儀器

WFJ2100型可見(jiàn)分光光度計(jì) (尤尼柯儀器有限公司);RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 (上海青浦瀘西儀器廠);LG燒烤型微波爐〔樂(lè)金電子 (天津)電器有限公司〕;SHB-III循環(huán)水式多用真空泵 (鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司);國(guó)華 HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 (常州國(guó)華電器有限公司);LDZ4-0.8A低速自動(dòng)平衡微型離心機(jī) (北京醫(yī)用離心機(jī)廠)等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 黃酮類化合物提取

稱取各樣品粉末 5.000 0 g兩份,加入 95%乙醇 100 mL,室溫浸提 2 h后,進(jìn)行微波低火提取3 min,提取結(jié)束后冷卻抽濾,濾渣進(jìn)行第 2次、第 3次微波提取,濾液合并,濃縮定容至 100 mL,備用。

2.2 總黃酮含量的測(cè)定[3]

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取蘆丁對(duì)照品 30 mg,用 80%乙醇微熱溶解后,置于 50 mL容量瓶中,用 80%乙醇定容。再精密吸取 20.00 mL,用乙醇定容至 50 mL,搖勻,即得蘆丁對(duì)照液,濃度為 0.24 mg/mL。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密吸取蘆丁對(duì)照液 0.00、0.20、0.60、1.20、1.80、2.40、3.00、3.60 mL,分別置于 10 mL容量瓶中,補(bǔ)水至 4.00 mL,加入 5%NaNO20.40 mL,搖勻 ,放置 6 min后 ,加入 10%Al(NO3)30.40 mL,搖勻,再放置 6 min,然后加 5%NaOH溶液 4.00 mL,補(bǔ)水至刻度,放置 10 min后,在 510 nm處測(cè)定吸光度 (以試劑空白為參比),以蘆丁濃度為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo)作圖,得回歸方程為:y=0.263 8x+0.006 7 R2=0.999 8,測(cè)定范圍 0～0.9 mg。

黃酮含量 (mg/g)=x×d/w(d為稀釋倍數(shù),w為樣品含量,g)

2.3 清除羥基自由基能力測(cè)定[4-5]

2.3.1 羥基自由基的檢測(cè)

取兩只潔凈的 10 mL容量瓶,1號(hào)瓶中依次加入 5 mmol/L鄰二氮菲溶液 0.50 mL,pH 7.4 PBS溶液 2.00 mL,7.5 mmol/L FeSO4溶液 1.00 mL,加水補(bǔ)至 10.00 mL,37℃下恒溫水浴加熱反應(yīng) 1 h,在536 nm處測(cè)得吸光度為 A1;2號(hào)瓶中依次加入 5 mmol/L鄰二氮菲溶液 0.50 mL,pH 7.4 PBS溶液2.00 mL,7.5 mmol/L FeSO4溶液 1.00 mL,0.2%過(guò)氧化氫溶液 1.00 mL,加水補(bǔ)至 10.00 mL,37℃下恒溫水浴加熱反應(yīng) 1 h,在 536 nm處測(cè)得吸光度為A2。計(jì)算ΔA。

2.3.2 羥自由基清除率的測(cè)定

吸取 0.50 mL 5 mmol/L鄰二氮菲溶液置于 10 mL潔凈的容量瓶中,加入 2.00 mL pH值為 7.4的PBS溶液,混勻后加入 1.00 mL 7.5 mmol/L的 Fe-SO4溶液,充分混勻后加入 1.00 mL 0.2%過(guò)氧化氫溶液,水定容至刻度,在 37℃恒溫水浴下反應(yīng) 1 h后,然后以 536 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度 A536(損傷)。同上法,加提取物后加過(guò)氧化氫,測(cè)定 A536(加藥)。同上法,不加入過(guò)氧化氫和提取物測(cè)定 A536(未損傷)。

表觀羥基自由基清除率 d計(jì)算方法如下:

2.4 提取物還原力的測(cè)定—普魯士藍(lán)法[6]

移取一定量的提取液,分別加入 0.2 mol/L pH 6.6的磷酸鹽緩沖液和 1%的 K3Fe(CN)6溶液各2.50 mL并混合均勻,混合液在 50℃保溫 20 min后加入 2.50 mL 10%的三氯乙酸溶液,混合后 (3000 r/min)離心 10 min。取上清液 2.50 mL,加入 2.50 mL蒸餾水及 0.50 mL 0.1%的 FeCl3溶液。測(cè)定反應(yīng)液在 700 nm處的吸光度值。用吸光度的大小表示還原力的強(qiáng)度。

3 結(jié)果與分析

3.1 各提取物中總黃酮含量

精密吸取一定量的樣品備用液,根據(jù) 2.2.2節(jié)方法測(cè)定樣品在 510 nm處吸光度值,代入回歸方程,計(jì)算出樣品中黃酮的含量,結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 總黃酮含量 (mg·g-1 n=4)

由表1可知:不同藥用植物花中總黃酮類物質(zhì)含量存在較大差異,其中大薊刺兒菜花的黃酮含量最高 (63.02 mg/g),夏至草花的黃酮含量最低(11.39 mg/g)。

3.2 各提取物清除羥基自由基能力

將 4種藥用植物花提取液稀釋成相同濃度,然后精密吸取不同量各樣品提取液,按 2.3.2節(jié)的實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定吸光度值,計(jì)算其清除率,結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 提取液對(duì)羥自由基清除作用

圖1表明,4種藥用植物花提取液對(duì)羥基自由基均有不同程度的清除能力,清除能力存在較大差異。4種藥用植物花中大薊刺兒菜花清除率最弱,提取液用量為 5.00 mL時(shí),清除率達(dá)到最高,但僅為21.67%;小瓣玫瑰花清除率隨提取物用量增加而增大幅度較快,提取物用量為 2.00 mL時(shí),清除率達(dá)到70.20%,但超過(guò) 2.00 mL反應(yīng)液出現(xiàn)沉淀;夏至草花提取液用量超過(guò) 5.00 mL時(shí)清除能力趨于平穩(wěn);百合花提取液用量為 5.00 mL清除率達(dá)到最高為91.38%。藥用植物花清除羥自由基能力與黃酮含量、結(jié)構(gòu)有密切關(guān)系。

3.3 提取物的還原力

精密吸取一定量稀釋后的各樣品提取液,按2.4節(jié)的實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定吸光度值,結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 提取物還原能力研究

圖2可知,4種藥用植物花提取液均有一定的還原能力,還原能力與提取液量呈正相關(guān),小瓣玫瑰的還原能力最強(qiáng),用量為 0.90 mL時(shí)吸光度值超過(guò)有效讀數(shù)范圍。其余 3種藥用植物花還原能力基本相當(dāng),用量超過(guò) 5.00 mL時(shí) 3者還原能力均趨于平穩(wěn)。

4 結(jié) 論

(1)采用微波輔助法提取甘肅產(chǎn) 4種藥用植物花中總黃酮類化合物省時(shí)、省能,能得到較高的提取率,是一條理想的提取黃酮類物質(zhì)的途徑。采用硝酸鋁比色法測(cè)定總黃酮化合物含量的精密度在0.3401%～0.7433%,測(cè)量方法可靠性。4種藥用植物花中,大薊刺菜花中總黃酮含量最高為 63.02 mg/g,夏至草花中總黃酮含量最低為 11.39 mg/g,不同植物花總黃酮含量有較大差異。

(2)4種藥用植物花提取液對(duì)·OH均有不同程度的清除能力。大薊刺兒菜花清除羥基自由基能力最弱,用量為 5.00 mL時(shí)清除率僅為 21.67%;小瓣玫瑰清除羥基自由基能力最強(qiáng),當(dāng)小瓣玫瑰花用量為 2.00 mL時(shí),清除率達(dá)到 70.20%。清除羥基自由基能力與黃酮含量、結(jié)構(gòu)有關(guān)。

(3)4種藥用植物花提取液均有一定的還原能力,在一定濃度范圍內(nèi)還原能力與黃酮含量呈正相關(guān),4種藥用植物花中,小瓣玫瑰的還原能力最強(qiáng)。

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