小鼠動(dòng)物毒性試驗(yàn)、神奈川溶血試驗(yàn)以及tdh試驗(yàn)對(duì)副溶血性弧菌致病性檢測(cè)有效性的研究＊

陳明環(huán),劉俊平,王慶忠,王宏萍,劉國(guó)剛,張繼倫

小鼠動(dòng)物毒性試驗(yàn)、神奈川溶血試驗(yàn)以及tdh試驗(yàn)對(duì)副溶血性弧菌致病性檢測(cè)有效性的研究＊

陳明環(huán)1,劉俊平2,王慶忠3,王宏萍4,劉國(guó)剛5,張繼倫2

目的 比較小鼠動(dòng)物腹腔注射、灌胃、神奈川溶血實(shí)驗(yàn)以及熒光tdh基因PCR反應(yīng)對(duì)副溶血性弧菌致病性檢測(cè)的有效性。方法采用四種方法,對(duì)分離自腹瀉者、水產(chǎn)品及自然水體中的菌株測(cè)定陽性率,以精確卡方統(tǒng)計(jì)比較結(jié)果。結(jié)果tdh反應(yīng)可區(qū)分腹瀉者來源菌株陽性率為90.0%,水產(chǎn)品來源陽性率為9.62%,自然水體來源陽性率為7.32%,P<0.001。結(jié)論熒光tdh基因PCR反應(yīng)可有效應(yīng)用于致病性菌株檢測(cè)。

致病性副溶血性弧菌;熒光 tdh基因 PCR反應(yīng);腹瀉;水產(chǎn)品;水體

副溶血性弧菌(V ibrio parahaem oly ticus)廣泛分布于近海岸與入?？谒?常為海洋魚貝類所攜帶。我國(guó)華東沿海海洋水生動(dòng)物攜帶該菌率可高達(dá)60.4%〔1〕。食用致病性副溶血性弧菌,可使食用者出現(xiàn)腹瀉、腸痙攣、惡心、嘔吐、發(fā)燒等胃腸炎反應(yīng)〔1-2〕,是全球沿海地區(qū)夏秋季腹瀉高發(fā)的主要原因〔2〕。但是,副溶血性弧菌中具有致病性菌僅占其中小部分,食用非致病性副溶血性弧菌對(duì)人體無大礙。若要求食品中不得檢出副溶血性弧菌,或采用食用水產(chǎn)品的限量值〔3〕,都會(huì)妨礙水產(chǎn)品生產(chǎn)、加工、銷售,實(shí)際操作中不可行。為了精準(zhǔn)的測(cè)定副溶血性弧菌菌群中的致病性株系,從而提高水產(chǎn)品檢驗(yàn)檢疫的控制效率,需要建立特異性的檢驗(yàn)方法。目前已有的方法有:小鼠毒性試驗(yàn)(GB/T4789.7-2003)、神奈川溶血試驗(yàn)(GB/T4789.7-2008)、耐熱性溶血毒素基因檢測(cè)(thermostable direct hemolysin,tdh),我們?cè)诂F(xiàn)場(chǎng)中應(yīng)用需要評(píng)估這些方法的使用價(jià)值〔4-5〕。為此,我們收集了從上海和浙江舟山的分別由腹瀉者肛拭、水產(chǎn)品和水體中分離到的三類副溶血性弧菌標(biāo)本,評(píng)價(jià)上述方法對(duì)致病性副溶血性弧菌的檢測(cè)效率。

1 材料和方法

1.1 副溶血性弧菌 標(biāo)本采集于2008年5月-10月,以 TCBS和 CHROMagar弧菌平板分離培養(yǎng),按照副溶血性弧菌檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn) GB/T4789.7-2003,進(jìn)行生化鑒定。

合計(jì)分離收集到273株副溶血性弧菌,其中從腹瀉者肛拭中分離菌株180株;從來自上海和舟山農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)的水產(chǎn)品中分離52株;從水體(出口中轉(zhuǎn)養(yǎng)殖水、近海河水、海水)中分離41株。副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株A TCC17802來自上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院,VPJ33來自上海海洋大學(xué)。

1.2 小鼠毒性試驗(yàn) 依據(jù) GB/T4789.7-2003,菌液經(jīng)37℃16h-18h培養(yǎng)后,腹腔注射0.3m L,或用灌胃針灌注小鼠0.4m L,以小鼠在3d內(nèi)死亡為毒性判斷依據(jù)。試驗(yàn)小鼠為昆明株 F1,體重為18-22g,購自上海第二軍醫(yī)大學(xué)。

1.3 神奈川溶血試驗(yàn) 神奈川實(shí)驗(yàn)用血平板使用新鮮兔血漿配制。用接種環(huán)將測(cè)試菌株點(diǎn)種表面干燥的我妻氏血瓊脂平板,35℃培養(yǎng)不超過24h,并立即觀察。陽性結(jié)果為菌落周圍呈半透明環(huán)的β溶血。

1.4 熒光定量 tdh基因檢測(cè)〔6〕采用自制tdh熒光PCR試劑檢測(cè),TaqMan探針為5’-FAM 2 TGACA TCCT A CA TGA CTGTGAAC2 ECL IPSE2-3’,使用熒光 PCR儀為 App lied Biosystem L td AB I7500,熒光采集通道為 FAM 490nm。tdh引物正向序列為5’-CGAAGA TGTT TA TGG TCAA T C-3’,反向序列為 5’-ACCGC TGCCA TTGTA TA GTC T-3’,目的片段長(zhǎng)度為105bp。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 兩組數(shù)據(jù)比較采用Fisher’s exact 2-tailed test,在網(wǎng)站 http://www.langsrud.com/fisher.htm提供的計(jì)算頁面上進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié) 果

副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株A TCC17802及VPJ33為生化陽性對(duì)照,與無菌含3.5%氯化鈉的蛋白胨水做為陰性對(duì)照,對(duì)照標(biāo)本均無溶血現(xiàn)象,小鼠腹腔注射或灌胃都未死亡,未檢出tdh基因。

多數(shù)小鼠在灌胃或腹腔注射后,出現(xiàn)不同程度的中毒癥狀,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),存活小鼠表現(xiàn)出的中毒癥狀逐漸緩解。主要中毒癥狀有豎毛、嗜睡、少動(dòng)、厭食呼吸困難。

由于試驗(yàn)容量的限制,隨機(jī)選取一定數(shù)量的菌株分別做小鼠腹腔注射、灌胃試驗(yàn)、神奈川溶血試驗(yàn)、以及tdh基因檢測(cè),陽性結(jié)果比率以及檢測(cè)的菌種數(shù)量匯總于表1。

表1 三類來源副溶血性弧菌的毒性試驗(yàn)結(jié)果Table1 Tests on vibrio parahaemolyticus isolates from patients,sea-fishery products or fresh water samples

3 討 論

理論上,從腹瀉者中分離獲得的副溶血性弧菌應(yīng)主要為致病性菌群。從水體中分離的弧菌應(yīng)根據(jù)環(huán)境分布,具有相應(yīng)的致病性菌群的檢出率。動(dòng)物毒性試驗(yàn)曾作為副溶血性弧菌是否具有致病性判斷的金標(biāo)準(zhǔn)。但是,由于高劑量的非致病性弧菌也能引起小鼠的毒性反應(yīng),而且,這種反應(yīng)沒有特異性的表型分布特征可與致病性副溶弧菌的反應(yīng)相區(qū)分,因此,在本研究中,水產(chǎn)品來源的副溶血性弧菌腹腔注射致鼠死率(32/43)甚至高于腹瀉者來源株(29/44),P=0.74(Fisher’s exact 2-tailed test)。該結(jié)果與一般常識(shí)相悖。推測(cè)為水產(chǎn)品來源的副溶血性弧菌有其它對(duì)小鼠有致死性的有害成分的存在。還可能是小鼠毒性致死試驗(yàn)不能分辨副溶血性弧菌對(duì)人致瀉的毒性差異,而是反映菌體本身在小鼠腹腔內(nèi)的對(duì)小鼠的有害特性。副溶血性弧菌通過小鼠毒性試驗(yàn)的腹腔注射法,對(duì)小鼠的致死率較高,在兩組之間沒有顯著檢出差異。通過灌胃法,則對(duì)小鼠的致死率較低,但是在水產(chǎn)品來源(6/45)以及腹瀉者來源(3/40)各組間仍是不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P=0.50(Fisher’s exact 2-tailed test)。因此,兩種類型的小鼠毒性試驗(yàn)均不能反映致病性副溶血性弧菌。

神奈川反應(yīng)以副溶血性弧菌的溶血性來反映其致病能力。根據(jù)上世紀(jì)八十年代日本學(xué)者研究報(bào)道,來自腹瀉者和水產(chǎn)品分離株的溶血率存在顯著性差異,分別為96.5%與1.1%,據(jù)此把溶血率作為致病性判斷依據(jù)〔4〕。但是實(shí)際操作中,溶血實(shí)驗(yàn)受采用兔血漿新鮮程度、批次、血漿比例波動(dòng)性以及p H值、鹽濃度的影響,重現(xiàn)性較低。本研究,水產(chǎn)品來源的菌株的46.2%的溶血率(24/52),自然水體來源菌株的74.1%溶血率(20/27),或腹瀉者來源菌株的87.7%溶血率(143/163)與文獻(xiàn)報(bào)道值差異大〔4〕,來自腹瀉者和其他分離株間不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 ,P=0.64(Fisher’s exact 2-tailed test)。其原因有時(shí)間和區(qū)域差別,近年上海市水體中致病性副溶血性弧菌的比率大幅度飆升,另一解釋為神奈川反應(yīng)由于溶血實(shí)驗(yàn)的不穩(wěn)定性,該指標(biāo)已無法判斷菌株的致病性。

學(xué)者研究副溶血性弧菌主要毒力因子為TDH〔5〕。可采用 tdh基因檢測(cè)的方法來反映該菌株中的致病性菌群。我們采用已建立的熒光PCR方法〔6〕對(duì)現(xiàn)有菌株進(jìn)行了測(cè)定。以 tdh基因反映的致病菌株,在腹瀉者來源中占90%(162/180),與水產(chǎn)品中分離的9.62%(5/52)顯示出顯著差異,P<0.001(Fisher’sexact 2-tailed test)。水產(chǎn)品中分離的比率與自然水體中分離的7.32%(3/41)的比率沒有顯著差異,P=1(Fisher’s exact 2-tailed test)。腹瀉者來源菌株有10%未檢出 tdh,其致瀉性可能來自 trh、脲素酶〔5〕。

結(jié)合本研究各項(xiàng)數(shù)據(jù)說明,在實(shí)際操作中,曾被作為金標(biāo)準(zhǔn)的小鼠毒性試驗(yàn)以及神奈川溶血實(shí)驗(yàn)由于方法檢測(cè)的局限性與波動(dòng)性的原因,并不適合應(yīng)用于致病性副溶血性弧菌的實(shí)驗(yàn)室測(cè)定,而熒光tdh基因 PCR反應(yīng)〔6〕可應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)室檢疫使用。

〔1〕劉秀梅,陳艷,王曉英,等.1992-2001年食源性疾病爆發(fā)資料分析-國(guó)家食源性疾病監(jiān)測(cè)網(wǎng)〔J〕.衛(wèi)生研究,2004,33(6):725-727.

〔2〕何浙生,王滿琴,潘幸福,等.浙江沿海魚貝類及外環(huán)境中副溶血性弧菌檢出頻度及菌群分布〔J〕.中國(guó)公共衛(wèi)生雜志,1989,1(10):6-7.

〔3〕廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局編譯.國(guó)內(nèi)外技術(shù)法規(guī)及標(biāo)準(zhǔn)中食品微生物限量〔J〕.北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2002年,47-54.

〔4〕孟昭赫,劉宏道,何曉青,等.食品衛(wèi)生檢驗(yàn)方法注解微生物學(xué)部分〔J〕.1版.北京:人民衛(wèi)生出版社.179.

〔5〕寧喜斌,劉代新,張繼倫.副溶血性弧菌的致病性及其快速檢測(cè)〔J〕.微生物與感染,2008,35(3):53-55.

〔6〕王宏萍,周曉明,張繼倫,等.副溶血性弧菌致病性標(biāo)志基因 tdh的實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的建立〔J〕.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2008,29(24):2232-2235.

Validity comparison on pathogen ic Vibrio parahaemolyticus identification methods of m icemodels,Kanagawa hemolytic test,and tdh gene test

CHEN M ing-huan,L IU Jun-ping,WANG Qing-zhong,WANG Hong-ping,L IU Guo-gang,ZHANG Ji-lun
(Zhoushan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Zhoushan 316000,China)

The aim of this study was to evaluate the applicability of four lab methodson the identification of pathogenic Vibrio parahaemolyticus.Four methods under evaluation includeof intraperitoneally injected micemodel,mice fed model,Kanagawa hemolytic test and fluorescence tdh quantitative PCR.Three populationsof V ibrio parahaemoly ticus isolateswere isolated from three independent sources including diarrhea patients,sea-fishery products and fresh water pool.Both mice models and Kanagawa hemolytic test had reached consensus positive results on identifying pathogenic V ibrio parahaemolyticus strains from sources of patients or sea-fishery products.For florescence tdh quantitative polymerase chain reaction,90.0%isolates from patients but 9.62%isolates from sea-fishery products were positive(P<0.001).The 7.32%isolates from fresh-water were also tdh positive.Thus,florescence tdh quantitative PCR was app rop riate for identifying pathogenic V ibrio parahaemolyticus isolates in routine app lication instead of mice models and Kanagawa test.

Vibrio parahaemolyticus;pathogenicity;tdh;diarrhea;sea-fishery

R378.3

A

1002-2694(2010)11-1025-03

＊國(guó)家傳染病重大專項(xiàng)2009ZX10004-104,科技部國(guó)家支撐計(jì)劃科技專項(xiàng)(2009BAK43B31)和上海市科委標(biāo)準(zhǔn)化基金(09DZ0503200)聯(lián)合資助

張繼倫,Email:zhangjl@shciq.gov.cn

1.浙江舟山出入境檢驗(yàn)檢疫局,舟山 316000;2.上海出入境檢驗(yàn)檢疫局;3.上海市臨床檢驗(yàn)中心;4.上海市臨床公共衛(wèi)生中心;5.上海金山技術(shù)監(jiān)督局

2010-04-20;

2010-09-16