喹那普利對單側(cè)輸尿管結(jié)扎大鼠腎纖維化拮抗作用的研究

高曉潔 李永柏 谷澤隆邦

腎間質(zhì)纖維化是各類慢性腎臟疾病進(jìn)展到終末期的主要病理特征。無論腎臟病原發(fā)病因和部位在腎小球、腎小管抑或腎血管，幾乎所有的進(jìn)展性腎病均可見到腎小管間質(zhì)纖維化。大量研究表明，腎間質(zhì)纖維化的程度與腎功能的相關(guān)性較腎小球硬化與腎功能的相關(guān)性更為密切[1～3]。積極探索阻抑腎間質(zhì)纖維化發(fā)生、發(fā)展的治療手段，對改善腎臟病的預(yù)后至關(guān)重要。因此，近年來圍繞腎小管間質(zhì)損傷的發(fā)病機(jī)制和防治措施方面的研究逐漸受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛重視。

血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)是腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)最主要的活性物質(zhì)，已證實(shí)在梗阻性腎病中，AngⅡ表達(dá)明顯增加[4]。在AngⅡ的AT1受體基因敲除后，梗阻早期即可抑制巨噬細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)mRNA及Ⅲ型膠原的表達(dá)，而腎間質(zhì)容積在梗阻后2～5 d顯著下降[5]。由此可見，AngⅡ參與了梗阻性腎病腎間質(zhì)纖維化的形成和發(fā)展。Klahr等[6]應(yīng)用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)及AT1受體拮抗劑抑制AngⅡ生成、表達(dá)和活化后，可顯著減少細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的沉積及成纖維細(xì)胞的增殖，提示AngⅡ是對腎間質(zhì)纖維化影響最為明顯的血管活性物質(zhì)。

喹那普利是1989年在美國上市的含羧基類ACEI，具有安全劑量范圍大，毒性作用和不良反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)。近年來，國外許多學(xué)者已將喹那普利廣泛應(yīng)用于治療鏈脲佐菌素誘發(fā)的糖尿病腎病，腎大部切除誘發(fā)的慢性腎功能不全和持續(xù)性不臥床腹膜透析(CAPD)并發(fā)的腹膜硬化等[7～9]，在上述研究中喹那普利均被證實(shí)有顯著的抗增殖和抗纖維化作用。目前，國內(nèi)關(guān)于喹那普利干預(yù)單側(cè)輸尿管結(jié)扎(UUO)腎小管間質(zhì)纖維化進(jìn)程的研究尚未見報(bào)道。本研究通過分析喹那普利對大鼠腎組織TGF-β1mRNA表達(dá)、腎間質(zhì)容量、腎組織α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)及TGF-β1蛋白水平的影響，為探索喹那普利保護(hù)腎臟功能的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物分組及處置 5周齡雄性SD大鼠30只(體重150～180 g，日本兵庫醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供)，以隨機(jī)數(shù)字法分為3組：假手術(shù)組6只，UUO組及喹那普利組各12只。模型建立方法[10]簡述如下：以戊巴比妥50 mg·kg-1腹腔注射麻醉后，在無菌條件下分離出左側(cè)輸尿管，上下兩端結(jié)扎后離斷。假手術(shù)組除不結(jié)扎離斷輸尿管外，余步驟同UUO組。喹那普利組在UUO前1 d予喹那普利10 mg·kg-1·d-1灌胃，假手術(shù)組及UUO組予同等體積生理鹽水灌胃。各組的半數(shù)大鼠分別于術(shù)后14及28 d處死，取左腎組織，部分置于4%多聚甲醛液中固定，用于Masson染色和免疫組化實(shí)驗(yàn)；部分速凍于-80℃液氮中備用于原位雜交實(shí)驗(yàn)。動物實(shí)驗(yàn)在日本兵庫醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)室完成，并得到該校實(shí)驗(yàn)動物關(guān)愛委員會的批準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)動物在清潔恒溫(22℃)環(huán)境下飼養(yǎng)，予普通飼料喂養(yǎng)，進(jìn)食、水的量不限。

1.2 主要藥品與試劑 喹那普利(每片10 mg，日本田邊三菱制藥株氏會社提供)，鼠TGF-β1cDNA (498 bp ,818-1315)探針(日本兵庫醫(yī)科大學(xué)提供)；DIG RNA Labeling Kit (Boehringer Mannheim公司，德國)；兔抗DIG/HRP 抗體 (Dako, 美國)；兔抗TGF-β1多克隆抗體(Santa Cruz，美國)；鼠抗α-SMA單克隆抗體(Novo Castra，英國)；羊抗兔或鼠IgG (Envision+TM, Peroxidase, Dako，美國)。

1.3 大鼠腎組織TGF-β1mRNA表達(dá)檢測 采用原位雜交法檢測，按DIG RNA labeling kit操作說明書進(jìn)行合成和標(biāo)記TGF-β1cRNA 探針。原位雜交主要步驟：冰凍切片(厚6～8 μm)以4%多聚甲醛液(pH 7.2)固定，經(jīng)0.2 mmol·L-1HCl處理后予蛋白酶K 10 ng·L-1消化30 min，每張切片滴加預(yù)雜交液預(yù)雜交1 h，然后加入1 mg·L-1DIG-labeled TGF-β1cRNA 探針，50℃雜交16 h，充分洗滌后滴加兔抗DIG/HRP 抗體(1∶250) 室溫孵育30 min。緩沖液洗滌后滴加生物素化過氧化物酶，經(jīng)DAB顯色加蘇木精復(fù)染后脫水封片。

1.4 大鼠腎組織α-SMA和TGF-β1蛋白水平的檢測 2 μm厚石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，用Target retrieval 試劑 (pH 6.0; Dako, 美國) 115～121℃微波6～10 min進(jìn)行抗原熱修復(fù)，浸入1% H2O2液20 min消耗內(nèi)源性過氧化酶，分別滴加兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗體(1∶100)和鼠抗大鼠α-SMA單克隆抗體4℃過夜，清洗后滴加相應(yīng)二抗(羊抗兔或鼠IgG)室溫靜置30 min，以DAB 底物顯色并加蘇木精輕度復(fù)染后常規(guī)脫水封片。

1.5 腎小管間質(zhì)損害病理學(xué)檢查 按常規(guī)方法進(jìn)行Masson染色，光鏡下觀察腎小管間質(zhì)的病理改變。

1.6 實(shí)驗(yàn)結(jié)果半定量分析 對各組大鼠腎組織TGF-β1mRNA表達(dá)、腎小管間質(zhì)容量、α-SMA和TGF-β1蛋白水平進(jìn)行半定量分析。對實(shí)驗(yàn)分組不知曉的2名觀察者采用經(jīng)典的point-counting 法[10～12]進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)數(shù)。具體方法：以帶有11×11等距網(wǎng)格線測微尺的目鏡觀察，400倍鏡下隨意選取20個連續(xù)但不重疊視野(含有腎小球及大血管的視野不納入觀察視野)，網(wǎng)格交叉點(diǎn)陽性染色者計(jì)數(shù)并求其平均值。

2 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)過程中3組大鼠均無死亡。假手術(shù)組術(shù)后2和4周的實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故將其合并作為對照組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析。

2.1 各組大鼠腎組織TGF-β1mRNA表達(dá)的比較 假手術(shù)組可見TGF-β1mRNA廣泛存在于腎小球系膜細(xì)胞，腎小管上皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞中(圖1A、B)，在正常情況下雜交信號散在而微弱。UUO組腎組織中TGF-β1mRNA表達(dá)水平劇增，尤其在擴(kuò)張或萎縮腎小管上皮細(xì)胞及增生的間質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)更為明顯(圖1C)，梗阻終末期腎小管間質(zhì)細(xì)胞中TGF-β1mRNA的雜交信號已呈現(xiàn)堆積現(xiàn)象(圖1D)；相對而言，腎小球中TGF-β1mRNA表達(dá)水平增加并不明顯。喹那普利組腎小管間質(zhì)TGF-β1mRNA的表達(dá)較同時期UUO組明顯減少(圖1E、F，表1)。

GroupsTGF?β1mRNARenalinterstitialvolumeTGF?β1proteinα?SMASham8．6±2．34．7±1．23．7±0．82．3±0．6Quinapril(2weeks)35±61，2)19±51，3)14±41，3)15±41，2)UUO(2weeks)62±81)30±61)25±71)22±51)Quinapril(4weeks)39±61，2)43±71，3)30±41，3)30±61，2)UUO(4weeks)69±71)55±61)39±61)44±91)

Notes 1)P<0.01,vssham group; 2)P<0.01, 3)P<0.05, Quinapril groupvsUUO group at the same time.n=6 for each group

2.2 各組大鼠腎小管間質(zhì)病理改變 假手術(shù)組顯示正常的腎小管間質(zhì)形態(tài)(圖2A)。UUO組術(shù)后2周時腎小管上皮細(xì)胞腫脹，小管明顯萎縮或擴(kuò)張，伴有不同程度的間質(zhì)增生和膠原形成(圖2B)；UUO組術(shù)后4周時萎縮塌陷的腎小管明顯增加，腎間質(zhì)纖維化程度亦明顯加重(圖2C)。喹那普利組與同時期的UUO組比較，腎小管萎縮塌陷、小管上皮細(xì)胞腫脹及間質(zhì)擴(kuò)張的情況明顯減少(圖2D)，尤其在4周時腎間質(zhì)纖維組織增生程度明顯抑制(圖2E，表1)。

圖1 各組大鼠腎組織TGF-β1mRNA的表達(dá)(原位雜交，×200)

Fig 1 Expression of TGF-β1mRNA in the experimental rat renal tissues in different groups(in situ hybridization, ×200)

Notes A: sham group at 2 weeks time point; B:sham group at 4 weeks time point;C:UUO group at 2 weeks time point; D:UUO group at 4 weeks time point; E: Quinapril group at 2 weeks time point; F:Quinapril group at 4 weeks time point.TGF-β1mRNA positive signals were detected in glomerular mesangeal cells, tubular epithelial cells and interstitium. The hybridized signals were weak in sham kidney, much stronger in renal tissues both 2 weeks and 4 weeks after UUO operation, no increasing expression of TGF-β1mRNA was found in glomeruli of UUO kidney

圖2 各組大鼠腎小管間質(zhì)病理改變(Masson染色，×200)

Fig 2 Morphological changes of relative interstitial volume in each group(Masson's trichrome stain,×200)

Notes A: sham group at 2 weeks time point; B:UUO group at 2 weeks time point; C:UUO group at 4 weeks time point; D: Quinapril group at 2 weeks time point; E:Quinapril group at 4 weeks time point. Tubular atrophy or dilation and interstitial fibrosis were obvious in renal tissues of UUO group, especially at 4 weeks time point post-operation. Compared with UUO group, tubulointerstitial fibrosis hallmarked by interstitial volume was markedly decreased in quinapril group

2.3 各組大鼠腎組織TGF-β1蛋白和α-SMA水平 假手術(shù)組腎小球系膜細(xì)胞，腎小管上皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞中可見極少量TGF-β1蛋白陽性染色(圖3A)。UUO組腎小管上皮細(xì)胞中可見強(qiáng)陽性染色的TGF-β1蛋白表達(dá)，在萎縮塌陷的腎小管上皮細(xì)胞中其表達(dá)尤為明顯(圖3B)。UUO組術(shù)后4周時腎臟中TGF-β1蛋白在小球系膜、極度擴(kuò)張及萎縮的腎小管及間質(zhì)細(xì)胞中均呈現(xiàn)強(qiáng)陽性表達(dá)(圖3C)，提示TGF-β1蛋白在腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)程中可能具有非常重要的促進(jìn)作用。喹那普利組腎小管間質(zhì)中TGF-β1蛋白的表達(dá)明顯受抑，間質(zhì)增生及腎小管萎縮現(xiàn)象亦明顯減輕(圖3D、E，表1)。

假手術(shù)組α-SMA僅在腎小血管壁肌細(xì)胞和極少量間質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)(圖4A)。UUO組α-SMA主要存在于腎間質(zhì)細(xì)胞及小血管壁，隨著腎纖維化的逐漸加重，腎間質(zhì)細(xì)胞增生，成纖維細(xì)胞堆積，α-SMA呈強(qiáng)陽性染色(圖4B、C)；喹那普利組由于腎間質(zhì)增生明顯受抑，α-SMA表達(dá)亦相應(yīng)明顯減少(圖4D、E，表1)。

圖3 各組大鼠腎組織TGF-β1蛋白的表達(dá)(免疫組化，×200)

Fig 3 Expression of TGF-β1protein immunohistochemically in renal tissues of each group(×200)

Notes A: sham group at 2 weeks time point; B:UUO group at 2 weeks time point; C:UUO group at 4 weeks time point; D: Quinapril group at 2 weeks time point; E:Q+UUO group at 4 weeks time point. TGF-β1protein was mainly expressed in tubular cells, and also found in interstitium of kidney at 4 weeks time point afer UUO operation. More positive staining of TGF-β1protein was detected in UUO group than quinapril group

圖4 各組大鼠腎組織α-SMA的表達(dá)(免疫組化，×200)

Fig 4 Expression of α-SMA immunohistochemically in renal tissues of each group(×200)

Notes A: sham group at 2 weeks time point; B:UUO group at 2 weeks time point; C:UUO group at 4 weeks time point; D: Quinapril group at 2 weeks time point; E:Quinapril group at 4 weeks time point. α-SMA was expressed mainly in interstitium and small vessles. α-SMA positive staining was much stronger in UUO group than quinapril group

3 討論

自20世紀(jì)80年代中期以來，動物實(shí)驗(yàn)已證實(shí)ACEI比其他類降血壓藥可更有效地保護(hù)腎臟，減輕腎臟損傷。在腎小球腎炎和腎間質(zhì)纖維化中，不論是否伴有高血壓，均可見腎組織中RAS活性增強(qiáng)?？梢夾ngⅡ不僅通過增加腎小球毛細(xì)血管內(nèi)壓的單一途徑造成腎臟損傷，且據(jù)推測AngⅡ具有直接調(diào)控多種血管活性因子、細(xì)胞因子、生長因子及炎癥細(xì)胞的作用[13,14]，但迄今為止其作用機(jī)制尚未闡明。

ACEI種類繁多，與貝那普利、雷米普利、培哚普利、依那普利和卡托普利相比較，喹那普利具有最小的半數(shù)抑制量(ID50)值，且具有較強(qiáng)的脂溶性和組織親和性，故喹那普利與組織中的血管緊張素抑制酶(ACE)親和力極高，ACE抑制作用相對較強(qiáng)[15]。Wadworth等[16]證實(shí)喹那普利的不良反應(yīng)發(fā)生率低于依那普利和卡托普利，同時由于喹那普利不含巰基，故過敏反應(yīng)及腎毒性均罕見，提示喹那普利具備了高效低毒的特性。

本研究采用經(jīng)典的慢性腎間質(zhì)纖維化UUO模型，并選擇長期觀察(梗阻后2和4周)直至終末腎狀態(tài)，觀察隨著腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)行性加重，可疑致纖維化因子的變化及喹那普利的拮抗作用是否持續(xù)有效。

作為一種多功能的多肽生長因子，TGF-β1是目前公認(rèn)的最重要的致纖維化關(guān)鍵因子之一。如圖1、3所示，TGF-β1廣泛分布于腎小管上皮細(xì)胞、間質(zhì)成纖維細(xì)胞和小球系膜細(xì)胞的胞質(zhì)中。UUO組腎小管上皮及間質(zhì)細(xì)胞中TGF-β1分泌明顯活躍，原位雜交結(jié)果更明確顯示隨著梗阻時間的延長，TGF-β1mRNA在擴(kuò)張或萎縮的腎小管上皮細(xì)胞及增生的腎間質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)逐漸增多，提示TGF-β1在UUO所致慢性腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)程中具有重要的作用。

TGF-β1致纖維化作用的主要環(huán)節(jié)為[17～20]：①激發(fā)小管上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞向成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化；②抑制多種ECM降解酶(如PIA-1和TIMPs等)的活性，發(fā)揮抑制ECM降解的作用；③促進(jìn)膠原蛋白(Ⅰ、Ⅲ及Ⅳ型膠原等)合成，從而刺激ECM沉積；④激活單核/巨噬細(xì)胞系統(tǒng)間質(zhì)浸潤基質(zhì)蛋白沉積，導(dǎo)致間質(zhì)纖維化。腎小管上皮細(xì)胞和系膜間質(zhì)細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化而成為肌纖維母細(xì)胞，而α-SMA陽性標(biāo)記的肌纖維母細(xì)胞喪失上皮黏附性，重新組合肌動蛋白，破壞腎小球基底膜，同時肌纖維細(xì)胞可產(chǎn)生大量的Ⅰ、Ⅲ型膠原。因此，腎組織纖維化最顯著的特征是肌纖維母細(xì)胞的增生和ECM的過度沉積。

以α-SMA為陽性標(biāo)記的肌纖維母細(xì)胞是產(chǎn)生ECM的主要細(xì)胞。本研究結(jié)果顯示，UUO組大鼠腎間質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)α-SMA強(qiáng)陽性染色，且隨著梗阻時間的延長,α-SMA的表達(dá)愈加明顯，證實(shí)了α-SMA是促進(jìn)梗阻腎ECM沉積的主要因子或主要因子之一。喹那普利的干預(yù)明顯阻抑了肌纖維母細(xì)胞的形成，有效減少了ECM的沉積，從而延緩了腎間質(zhì)纖維化的發(fā)展過程。

有學(xué)者提出[21,22]，在治療腎臟疾病時，TGF-β1應(yīng)被視為除高血壓外的重要的治療靶點(diǎn)。ACEI可能會阻斷AngⅡ誘導(dǎo)的TGF-β1高表達(dá)，從而干擾腎纖維化的進(jìn)程，起到腎保護(hù)作用。本研究結(jié)果表明喹那普利可明顯抑制UUO大鼠腎組織中TGF-β1mRNA和蛋白水平的表達(dá)，使病變腎組織中成纖維細(xì)胞明顯減少，進(jìn)而降低腎間質(zhì)容量，并通過4周觀察證實(shí)了ACEI通過抑制TGF-β1高表達(dá)的抗腎纖維化作用在終末期腎臟損害中亦持續(xù)有效。

本研究的不足之處和局限性：①僅對喹那普利拮抗腎纖維化的作用進(jìn)行了觀察，未與其他ACEI藥物在抑制腎纖維化效應(yīng)方面進(jìn)行比較；②對喹那普利通過何種途徑抑制了TGF-β1表達(dá)亦未涉及。均有待于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

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