GADD45β和 survivin基因在人原發(fā)性肝癌組織中的蛋白表達(dá)及意義

朱志杰,黃修明,鄺繼孫,谷 淵,董 星,趙龍栓

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽胰脾外科,河南省高等學(xué)校肝膽胰外科與消化器官移植重點(diǎn)學(xué)科開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室,河南鄭州 450052）

GADD45β和 survivin基因在人原發(fā)性肝癌組織中的蛋白表達(dá)及意義

朱志杰,黃修明,鄺繼孫,谷 淵,董 星,趙龍栓

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽胰脾外科,河南省高等學(xué)校肝膽胰外科與消化器官移植重點(diǎn)學(xué)科開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室,河南鄭州 450052）

目的探討GADD45β和survivin基因在人原發(fā)性肝癌(HCC）組織中的蛋白表達(dá)及意義。方法收集不同分化程度的HCC組織標(biāo)本 68例,正常肝組織標(biāo)本 20例,采用免疫組化S-P法檢測(cè) GADD 45β和 survivin基因的蛋白表達(dá)。結(jié)果GADD 45β基因與survivin基因在 HCC組織中的蛋白表達(dá)率分別為 38.24%(26/68）和 75.00%(51/68）,兩者的表達(dá)均與 HCC的病理分化程度、臨床分期有關(guān)(P＜0.05）,survivin基因的表達(dá)還與門(mén)脈癌栓有關(guān)(P＜0.05）。隨著 survivin基因在 HCC組織中蛋白表達(dá)率的升高,GADD45β基因蛋白表達(dá)強(qiáng)度明顯下降,兩者的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.454,P＜0.05）。結(jié)論GADD 45β基因在HCC發(fā)生發(fā)展中起抑制作用,GADD 45β基因表達(dá)缺失是HCC發(fā)生發(fā)展的重要因素之一;survivin基因的異常表達(dá)在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起促進(jìn)作用。聯(lián)合檢測(cè) GADD 45β基因和survivin基因的蛋白表達(dá)有助于判斷 HCC的惡性程度和HCC患者的預(yù)后。

生長(zhǎng)阻滯和 DNA損傷誘導(dǎo)基因;survivin基因;原發(fā)性肝癌;免疫組化

人原發(fā)性肝癌(human hepatocellular carcinoma,HCC）的發(fā)生是一個(gè)多基因參與并通過(guò)不同基因在不同時(shí)相的差異性表達(dá)進(jìn)行調(diào)控的復(fù)雜過(guò)程[1]。細(xì)胞DNA損傷誘導(dǎo)生長(zhǎng)阻滯和 DNA損傷誘導(dǎo)基因(growth arrest DNA damage-inducible gene 45β,GADD 45β）表達(dá)使細(xì)胞發(fā)生 G2/M期阻滯,調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和存活等多條信號(hào)通路,GADD45β在決定細(xì)胞存活中發(fā)揮著重要作用[2]。survivin是1997年由 Ambrosini發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞凋亡抑制因子,在胚胎發(fā)育過(guò)程中出現(xiàn),在終末分化的成人組織中無(wú)表達(dá)(胸腺除外）,而在轉(zhuǎn)化細(xì)胞株和人體內(nèi)幾乎所有的惡性腫瘤組織中均有明顯表達(dá)[3]。本研究應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)正常肝組織和不同病理分化程度的HCC組織中GADD45β基因與survivin基因的蛋白表達(dá)水平,并探討兩者的關(guān)系及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 收集我院 2009年 1月至 2009年 8月手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)的 HCC 68例,術(shù)前均未接受化療及放療,其中男性 37例,女性 31例,年齡 31～79歲,平均年齡(46±7.2）歲。另取 20例正常肝組織作為對(duì)照,其中男性 12例,女性 8例,年齡 29～75歲,平均年齡 (49±4.7）歲。68例 HCC中,AFP≥400μg/L 43例 ,AFP＜400μg/L 25例 ;瘤徑≥5 cm 24例,瘤徑 ＜5 cm 44例;包膜完整 37例,包膜不完整或無(wú)包膜 31例;有脈管癌栓 21例,無(wú)脈管癌栓 47例;臨床分期Ⅰ ～Ⅱ期 33例,Ⅲ期 35例;病理分化程度低分化 29例,中高分化 39例。

1.2 試劑 GADD45β基因表達(dá)診斷試劑盒、survivin基因表達(dá)診斷試劑盒、S-P免疫組化試劑盒、DAB試劑盒及

陽(yáng)性參考切片均購(gòu)自北京中杉金橋生物工程有限公司。

1.3 方法 GADD45β基因與 survivin基因表達(dá)檢測(cè)均采用免疫組化 S-P法,標(biāo)本為 4μm石蠟標(biāo)本切片,嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明操作。陽(yáng)性對(duì)照為已知陽(yáng)性切片,滴加 PBS液代替一抗的切片作為陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定 顯微鏡下觀察免疫組化染色后的病理切片,兩者的陽(yáng)性反應(yīng)均為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)黃色、棕黃色顆粒,對(duì)每張病理切片隨機(jī)計(jì)數(shù) 5個(gè)視野(×200）中GADD 45β基因和 survivin基因的陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞比率。(-）為全部陰性表達(dá)或陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞比率 ＜5%;(+）為陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞比率 6%～20%;(++）為陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞比率 21%～50%;(+++）為陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞比率 ＞50%[4]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用 SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,率的比較采用 χ2檢驗(yàn)或 Fisher精確概率法,相關(guān)分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析法,檢驗(yàn)水準(zhǔn) α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 GADD45β基因與 survivin基因在 HCC及正常肝臟組織中的蛋白表達(dá) GADD45β基因表達(dá)在細(xì)胞漿,陽(yáng)性表現(xiàn)為彌漫性棕黃染色。HCC組織中 GADD45β基因的蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為 38.24%(26/68）,明顯低于正常肝組織的 85.00%(17/20）(P＜0.05）。survivin基因表達(dá)在細(xì)胞漿,偶可見(jiàn)于細(xì)胞核,陽(yáng)性表現(xiàn)為顆粒樣棕黃染色。HCC組織中 survivin基因的蛋白陽(yáng)性表達(dá)率 75.00%(51/68）,明顯高于正常肝組織的25.00%(5/20）(P＜0.05）。見(jiàn)表 1。

表 1 Gadd45β基因和 survivin在 HCC組織及正常肝組織中的蛋白表達(dá)(例）

2.2 GADD45β基因與 survivin基因的蛋白表達(dá)與HCC臨床病理參數(shù)的關(guān)系 GADD45β基因與 survivin基因在HCC組織中的蛋白表達(dá)均與腫瘤病理分化程度及臨床分期有關(guān)(P＜0.05）;survivin基因的蛋白表達(dá)還與門(mén)脈癌栓有關(guān)(P＜0.05）;兩者的表達(dá)與 HCC腫瘤大小、有無(wú)包膜、血清 AFP濃度均無(wú)關(guān)(P＞0.05）。見(jiàn)表 2。

表 2 Gadd45β基因和 survivin基因的蛋白表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 HCC組織中 GADD45β基因與 survivin基因的蛋白表達(dá)的關(guān)系 HCC組織中 GADD45β基因與 survivin基因蛋白表達(dá)均為陽(yáng)性者占 17.65%(12/68）。GADD45β基因蛋白表達(dá)陽(yáng)性者的 survivin基因蛋白表達(dá)陽(yáng)性率為 46.15%(12/26）,GADD 45β基因蛋白表達(dá)陰性者的 survivin基因蛋白表達(dá)陽(yáng)性率為92.86%(39/42）。survivin基因在 GADD 45β基因蛋白表達(dá)陰性者中的蛋白表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于GADD45β陽(yáng)性表達(dá)者(P＜0.05）。 GADD45β基因與survivin基因在 HCC組織中的蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.454,P＜0.05）。見(jiàn)表 3。

表 3 GADD 45β基因和survivin基因在 HCC組織中蛋白表達(dá)的相關(guān)性(例）

3 討論

人類(lèi) survivin基因定位于染色體 17q25,全長(zhǎng)14.7 kb,由 3個(gè)內(nèi)含子和 4個(gè)外顯子組成,其 mRNA長(zhǎng)約 1.9 kb,所編碼的蛋白包含了 142個(gè)氨基酸,作為IAP家族中相對(duì)分子質(zhì)量最小(僅16 500）的成員,survivin蛋白在結(jié)構(gòu)上具有眾多不同之處,包括氨基端的BIR序列、羧基末端的 α螺旋結(jié)構(gòu)及 BIR序列和 α螺旋結(jié)構(gòu)間的特殊性連接區(qū)域(該區(qū)域具有輸出信號(hào)功能而引起 survivin抗凋亡）[5]?；谄洫?dú)特的分子結(jié)構(gòu),survivin可以在抑制細(xì)胞凋亡,促進(jìn)細(xì)胞增殖分化,促進(jìn)新生血管形成及與其他腫瘤相關(guān)因子相互作用等多方面、多途徑促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[6]。本結(jié)果顯示,survivin基因在 HCC組織中的蛋白表達(dá)陽(yáng)性率為75.00%,明顯高于正常肝組織的 25.00(P＜0.05）;且病理分化程度低、臨床分期差、門(mén)脈內(nèi)癌栓者survivin基因蛋白表達(dá)陽(yáng)性率高(P＜0.05）。這提示 survivin基因與 HCC的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

GADD45基因家族是 DNA損傷修復(fù)的重要相關(guān)基因,在細(xì)胞凋亡和細(xì)胞生存中發(fā)揮作用。GADD45β的 mRNA全長(zhǎng)是 1 121 bp,位于 19p13.3,屬于核蛋白。GADD45β基因具有 GADD45基因家族的共有功能,即主要調(diào)節(jié)控制細(xì)胞的增生、監(jiān)測(cè)細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)控制細(xì)胞的負(fù)性生長(zhǎng)等 DNA損傷修復(fù)途徑相關(guān)的功能[7]。GADD45β主要通過(guò)調(diào)控抑癌基因 p53來(lái)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)及促進(jìn)細(xì)胞凋亡,GADD45β表達(dá)或功能異常導(dǎo)致 p53介導(dǎo)的 DNA損傷修復(fù)途徑異?；蜃钄?不能正確應(yīng)答 DNA損傷、抑制異常細(xì)胞的增生、控制細(xì)胞周期、促使凋亡的發(fā)生,致使損傷積累,是肝臟細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化及形成腫瘤的可能機(jī)制[8]。本研究結(jié)果顯示,HCC組織中 GADD45β的蛋白表達(dá)陽(yáng)性率為 38.24%,明顯低于正常肝組織的 85.00%(P＜0.05）,說(shuō)明 GADD45β基因缺失或蛋白表達(dá)異常對(duì) HCC發(fā)生發(fā)展有重要意義;且臨床Ⅲ期 HCC患者GADD45β基因蛋白表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于Ⅰ ～Ⅱ期(P＜0.05）,表明 GADD45β能很好的反應(yīng) HCC進(jìn)展情況及患者預(yù)后。

本組資料還顯示,GADD45β基因與 survivin基因在 HCC組織中的蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān),推測(cè)可能是在GADD45β基因缺失或不能正常表達(dá)的情況下,組織細(xì)胞不能正常修復(fù)各種內(nèi)外因素(電離輻射、紫外線、化學(xué)物質(zhì)、病毒感染等）造成的基因損傷或突變致使細(xì)胞增殖、分化等生長(zhǎng)調(diào)控機(jī)制紊亂,細(xì)胞出現(xiàn)異型性和惡性增殖,而 survivin基因的異常增加又使細(xì)胞的凋亡機(jī)制受阻導(dǎo)致機(jī)體清除變異細(xì)胞的能力下降。GADD45β缺失或不能正常表達(dá)與 survivin高表達(dá)同時(shí)存在的 HCC患者癌細(xì)胞增殖侵襲能力強(qiáng)、腫瘤分化差、惡性程度高、術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移概率大,因此聯(lián)合檢測(cè)GADD45β基因與 survivin基因的蛋白表達(dá)有助于篩選高?；颊呒芭袛囝A(yù)后。大多數(shù)抗腫瘤藥物都是通過(guò)損傷腫瘤細(xì)胞 DNA而發(fā)揮作用的,但現(xiàn)階段還沒(méi)有化療藥物對(duì) HCC敏感,survivin在 HCC組織中異常高表達(dá)為 HCC化療提供了新的靶點(diǎn),GADD45β在 HCC細(xì)胞中特異性缺失或低表達(dá)提示我們可通過(guò)基因轉(zhuǎn)染或其他可能的方法誘導(dǎo)上調(diào)肝細(xì)胞 GADD45β的表達(dá)而達(dá)到治療 HCC及預(yù)防 HCC發(fā)生的目的。

[1] Ozturk M.Genetic aspects of hepatocellular carcinogenesis[J].Sem in Liver Dis,1999,19(3）:235-242.

[2] 李云峰,錢(qián)海利,林晨,等.Gadd45a的表達(dá)調(diào)控與功能[J].醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志,2007,4(5）:434-438.

[3] Ambrosini G,Adida C,A ltieri DC.A novelanti-apoptosisgene,survivin,expressed in cancer and lymphoma[J].NatMed,1997,3(8）:917-921.

[4] Ito T,Shiraki K,Sugimoto K,et al.Survivin promotes cell proliferation in human hepatocellular carcinoma[J].Hepatology,2000,31(5）:1080-1085.

[5] Lens SM,Rodriguez JA,Vader G,et al.Uncoupling the central spindle-associated function of the chromosomal passenger complex from its role at centromeres[J].Mol Biol Cell,2006,17(4）:1897-1909.

[6] Nikolovska-Coleska Z,Meagher JL,Jiang S,et al.Interaction of a cyclic,bivalent smacm imetic with the x-linked inhibitor of apoptosis protein[J].Biochem istry,2008,47(37）:9811-9824.

[7] Qiu W,Zhou B,Zou H,etal.Hypermethylation of growth arrest DNA damage-inducible gene 45 beta promoter in human hepatocellular carcinoma[J].Am JPathol,2004,165(5）:1689-1699.

[8] 邱偉華,Binsen Zhou,Dana Darwish,等.GADD45β基因表達(dá)誘導(dǎo)對(duì)不同 p53狀態(tài)的肝癌細(xì)胞作用[J].外科理論與實(shí)踐,2005,10(2）:155-160.

The Expressions and Clinical Significances of Survivin and GADD45βGene in Human Hepatocellular Carcinoma

Zhu Zhijie,Huang Xium ing,Kuang Jisun,Gu Yuan,Dong Xing,Zhao Longshuan
(Department of Hepatobiliary and Pancreatic Surgery,the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University;

Key Laboratory of Hepatobiliary and Pancreatic Surgery＆Digestive Organ Transplantation at Henan Universities,Zhengzhou 450052,China）Abstract:Objective To study the expressions and clinical significances of GADD 45βand survivin gene in human hepatocellular carcinoma(HCC）.MethodsImmunohistochem icalmethod was used to detect the expressions ofGADD 45βand survivin in both HCC and normal liver tissues(68 cases of HCC and 20 cases ofnormal liver tissues）.ResultsThe positive rates of GADD45βand survivin expressions in HCC tissues were 38.24%(26/68）and 75.00%(51/68）respectively.The expressions ofGADD 45βand survivin were both closely correlated with the differentiation degree and clinical stage of HCC(P＜0.05）.The expressions of survivin in HCC tissueswere also related to tumor thrombus of portal vein.And the expressions of GADD45βhad negative correlation with the expressions of survivin in HCC tissues(r=-0.454,P＜0.05）.ConclusionGADD45β may inhibit the occurrence and development of HCC,but survivin may have the opposite effect.Combined detection of GADD45βand survivin expressionsmay be beneficial to determine themalignancy degreeand predict prognosis of HCC.

growth arrest DNA damage-inducible gene 45β;survivin;human hepatocellular carcinoma;immunohistochemistry

R 735.7;R 730.23

A

1673-5412(2010）05-0379-03

朱志杰(1985-）,男,在讀碩士,主要從事肝膽胰脾疾病的基礎(chǔ)與臨床研究。E-mail:zhuda1258@126.com

趙龍栓(1964-）,男,教授,主任醫(yī)師,主要從事肝膽胰脾疾病的診治研究。E-mail:zhaoruix@126.com

2010-07-07）