中紅側(cè)溝繭蜂滯育生理生化指標(biāo)變化規(guī)律研究

李文香,郭會婧,郭 江,閆海燕,路子云,李建成,劉小霞,張青文

(1.河北北方學(xué)院農(nóng)林科技學(xué)院,河北張家口075000;2.河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所,河北農(nóng)業(yè)有害生物綜合防治工程技術(shù)中心,河北保定071000;3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院昆蟲系,北京100094)

中紅側(cè)溝繭蜂Microplitis mediator(Haliday)屬膜翅目,繭蜂科,小蜂繭蜂亞科,側(cè)溝繭蜂屬,廣泛分布于亞洲與歐洲[1,2].在我國河北、黑龍江、遼寧、內(nèi)蒙古、山東、山西、河南、陜西、新疆、江蘇等地均有分布[3].該蜂是一種寄主非常廣泛的內(nèi)寄生蜂,其寄主涉及到鱗翅目夜蛾科和尺蛾科40多種昆蟲[4],其中包括棉鈴蟲 Helicover pa armigera(Noctuidae)、粘蟲M ythimna separata(Walker)、甘藍(lán)夜蛾barathra brassicae等農(nóng)業(yè)上的重大害蟲[5],是田間害蟲生物控制的重要因子[6].目前,在明確該蜂生物學(xué)特性的基礎(chǔ)上,以粘蟲為寄主在室內(nèi)已經(jīng)能夠大規(guī)模人工繁殖.中紅側(cè)溝繭蜂與寄主粘蟲之間的生理調(diào)控關(guān)系,也一直是眾多學(xué)者關(guān)注、研究的熱點(diǎn)[7,8].但有關(guān)中紅側(cè)溝繭蜂滯育過程中各種生理指標(biāo)的含量變化卻至今未見報(bào)道,本文的研究為中紅側(cè)溝繭蜂滯育生理方面填補(bǔ)了空白.

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

寄主昆蟲為粘蟲Mythimna separate,3齡以下用新鮮玉米葉片飼養(yǎng),3齡以上用人工飼料飼養(yǎng),實(shí)驗(yàn)前已在本實(shí)驗(yàn)室繁殖飼養(yǎng)10代以上,本試驗(yàn)所用粘蟲均為玉米葉飼養(yǎng).中紅側(cè)溝繭蜂采自河北省保定地區(qū)棉田,將被寄生的棉鈴蟲采回室內(nèi)繼續(xù)用人工飼料飼養(yǎng),蜂羽化后,每天飼喂10%的蜂蜜水,然后在河北省植保所昆蟲天敵實(shí)驗(yàn)室以粘蟲為寄主進(jìn)行擴(kuò)繁10代以上.

寄生過程：挑選1齡末-2齡初的健壯粘蟲幼蟲,放入接蜂箱 (40 cm×30 cm×25 cm)底部的新鮮玉米葉上,用羽化后交配24 h的中紅側(cè)溝繭蜂雌蜂進(jìn)行寄生接蜂,將浸有10%蜂蜜水的脫脂棉球掛在蜂箱的側(cè)面做為成蜂的食源.24 h后去除中紅側(cè)溝繭蜂,把粘蟲分別轉(zhuǎn)入玻璃瓶內(nèi)用新鮮玉米苗繼續(xù)飼養(yǎng).

滯育條件：16℃和光周期L：D=10∶14;非滯育條件：26℃和光周期L：D=14∶10.將被寄生寄主分別置于兩條件的光照培養(yǎng)箱中,環(huán)境設(shè)置溫度誤差±1℃,光照強(qiáng)度5 000-6 000Lx,相對濕度RH∶65%±5%.每個處理重復(fù)3次.

1.2 中紅側(cè)溝繭蜂體內(nèi)生理指標(biāo)的提取與測定方法

生理指標(biāo)的提取方法如下：準(zhǔn)備試管并貼好標(biāo)簽.試驗(yàn)將蟲體 (60 mg)90℃加熱1 h.記錄蟲體干重,放置試管A中.-80℃保存,待用.向每個樣品中加入100μl飽和的Na2SO4和200μl的甲醇.用玻璃棒將蟲體研磨.用100μl的水沖洗.再用1 ml的甲醇∶氯仿=1∶1沖洗,液體全部進(jìn)入試管A中即為糖原.攪拌,2500 rpm/min,離心5 min.將上清液轉(zhuǎn)移至B1中.用1 ml的甲醇：氯仿=1∶1重復(fù)抽提A,上清液至B1.剩下的為A,將A置于冰中待用.

將B1中加入2.6 ml的氯仿,使液體體積達(dá)到5.0 ml,再加入0.5 ml的水,2 500 rpm/min,離心5 min.下層有機(jī)相轉(zhuǎn)移至B2中,水相留在B1.將B1也置于冰中待用.向B2中加入氯仿使體積至5.0 ml,再加入1.0 ml的水,攪拌后2 500 rpm/min,離心5 min.轉(zhuǎn)移下層有機(jī)相,先使有機(jī)相通過200 mg100網(wǎng)眼的硅膠,過濾至B3即為甘油三酯.再向硅膠中倒入8 ml的氯仿,每次1 ml.將B3低溫加熱氮?dú)?N2)吹干.將B1+B2,N2吹干.轉(zhuǎn)移水相,使之通過200 mg100網(wǎng)眼的硅膠,過濾至C1即為糖類.再向B1+B2中加入0.5 ml的水,使之再次過濾.

向試管A中加入1 ml66%的乙醇Na2SO4溶液.攪拌,2 500 rpm/min,離心5 min.上清液轉(zhuǎn)移至C即為海藻糖.記錄C的量.將試管A55℃加熱5 min.加入0.5 ml的30%的 KOH,攪拌,100℃加熱20 min.加入1 ml乙醇,攪拌,使液體再次分層.3 000 rpm/min,離心15 min.上清液轉(zhuǎn)移至D中即為蛋白質(zhì),用來測定蛋白質(zhì)含量.加入0.5 ml的水和1 ml乙醇.3 000 rpm/min,離心15 min.上清液也轉(zhuǎn)移至D中.再加入2.6 ml的氯仿.加入1 ml的水后,2 500 rpm/min,離心5 min.轉(zhuǎn)移下層液體至B3中.

糖類物質(zhì)的測定采用硫酸蒽酮法.以葡萄糖作標(biāo)準(zhǔn)曲線.每個濃度值重復(fù)3次.

海藻糖的測定采用硫酸蒽酮法.以海藻糖作標(biāo)準(zhǔn)曲線.每個濃度值重復(fù)3次.

脂類的測定采用香蘭素硫酸顯色法.以甘油三酸酯作標(biāo)準(zhǔn)曲線.每個濃度值重復(fù)3次.

蛋白的測定方法：溴酚藍(lán)顯色法.以牛血清蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線.每個濃度值重復(fù)3次.

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

本論文用SPSS分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 滯育與非滯育條件下中紅側(cè)溝繭蜂糖原含量比較

從圖1可以看出,兩種條件下糖原的含量變化趨勢基本相同,糖原的濃度均是由低逐漸增加.滯育條件下蛹期濃度達(dá)到155.73μg/mg,非滯育條件下第6 d濃度最大為70.62μg/mg.除滯育條件下發(fā)育第16 d與非滯育條件下發(fā)育第6 d糖原濃度差異不顯著外,其它發(fā)育時期的糖原濃度均是顯著差異 (P＜0.05)：滯育條件下中紅側(cè)溝繭蜂體內(nèi)糖原含量一直顯著高于非滯育條件下的濃度.

2.2 滯育與非滯育條件下中紅側(cè)溝繭蜂海藻糖含量比較

從圖2可以看出,兩種條件下寄生蜂體內(nèi)海藻糖含量變化趨勢均出現(xiàn)逐漸增加的趨勢,均在蛹期出現(xiàn)最高值.滯育條件下104.75μg/mg,非滯育條件下37.86μg/mg.兩種條件下中紅側(cè)溝繭蜂海藻糖含量從第16 d/6 d-蛹期濃度差異均顯著 (P＜0.05).由圖可以看出,不同發(fā)育條件決定寄生蜂的發(fā)育速度,同時影響生理指標(biāo)含量.中紅側(cè)溝繭蜂滯育條件下發(fā)育慢但海藻糖含量增加快,非滯育條件正好相反.

圖1 滯育與非滯育條件中紅側(cè)溝繭蜂不同發(fā)育時間糖原含量比較

圖2 滯育與非滯育條件中紅側(cè)溝繭蜂不同發(fā)育時間海藻糖含量比較

2.3 中紅側(cè)溝繭蜂滯育過程中糖原和海藻糖含量比較

從圖3可以看出,滯育繭冷藏過程中糖原含量變化總體趨勢為先增長后逐漸降低.但糖原濃度一直保持較高水平.保存第10 d、20 d和蛹期的糖原含量無顯著差異;保存20～60 d的過程中也無顯著差異 (P＞0.05).但10～20 d和蛹期與20～60 d的糖原濃度差異顯著 (P＜0.05).海藻糖含量在滯育繭冷藏過程中前期呈逐漸增加趨勢,后期即滯育即將結(jié)束時略有下降.在整個滯育過程中糖原含量一直處于較高水平,而海藻糖在滯育的中后期含量較高,滯育結(jié)束時,也就是蛹期含量顯著下降.

2.4 滯育與非滯育條件下中紅側(cè)溝繭蜂甘油三酯含量比較

由圖4可以看出,在整個發(fā)育過程中,除蛹期外,其他任何時期中紅側(cè)溝繭蜂的甘油三酯濃度在滯育條件下一直高于非滯育條件下,且差異均顯著.由此可見：低溫和短光照可誘導(dǎo)中紅側(cè)溝繭蜂甘油三酯的含量增加,有利于向滯育的方向發(fā)展.但兩種條件下甘油三酯的含量變化趨勢大體一致,均在3齡期達(dá)到最大值,滯育條件下濃度為9.52μg/mg,非滯育條件下為6.83μg/mg.

圖3 中紅側(cè)溝繭蜂滯育過程中糖原和海藻含量比較

圖4 滯育與非滯育條件是紅側(cè)溝繭蜂不同發(fā)育時間甘油三酯含量比較

2.5 滯育過程中中紅側(cè)溝繭蜂甘油三酯含量變化

從圖5可以看出,甘油三酯的含量在中紅側(cè)溝繭蜂整個滯育過程中沒有明顯變化,且含量一直較少.儲存10～20 d的時候含量較少3.74-3.41μg/mg,后逐漸增多,存50 d時達(dá)到最大值7.34μg/mg,蛹期略有降低為5.03μg/mg.

2.6 滯育與非滯育條件下中紅側(cè)溝繭蜂蛋白質(zhì)含量比較

由圖6可以看出,兩種條件下,中紅側(cè)溝繭蜂在發(fā)育過程中蛋白含量變化趨勢在前期大體相反,后期基本一致.在中紅側(cè)溝繭蜂進(jìn)入滯育之前,非滯育條件下蛋白質(zhì)含量較高-12 d/4d時：13.89μg/mg;14 d/5d：14.74μg/mg.滯育條件下分別為5.53μg/mg、5.66μg/mg.二者差異顯著.

圖5 中紅側(cè)溝繭峰滯育過程甘油三酯含量比較

圖6 滯育與非滯育條件下中紅側(cè)溝繭蜂不同發(fā)育時間蛋白質(zhì)含量比較

2.7 滯育過程中中紅側(cè)溝繭蜂蛋白含量變化

由圖7可以看出,中紅側(cè)溝繭蜂在滯育過程中蛋白質(zhì)含量變化一直很平緩,數(shù)值無顯著差異,且含量一直較低.滯育繭冷藏第60 d時達(dá)到最大值為8.47μg/mg.蛹期含量最少為5.05μg/mg.

圖7 中紅側(cè)溝繭蜂滯育過程中蛋白含量變化

3 討論與結(jié)論

昆蟲為了順利的越冬,一般可以通過越冬耐寒鍛煉提高其對低溫的耐受性.這種低溫鍛煉過程是通過抗凍保護(hù)性物質(zhì)在體內(nèi)的累積來靈活地調(diào)節(jié)蟲體的過冷卻點(diǎn)、體內(nèi)降溫速度等來達(dá)到安全越冬的目的[9-11].抗凍保護(hù)性物質(zhì)如糖原、甘油、海藻糖、山梨醇和肌醇等.

本研究表明：中紅側(cè)溝繭蜂滯育條件下的糖原和海藻糖含量均高于非滯育條件下濃度,表明中紅側(cè)溝繭蜂進(jìn)入滯育時糖原和海藻糖是主要的累積物質(zhì),為其向滯育方向發(fā)展奠定了物質(zhì)基礎(chǔ).在滯育過程中,糖原的含量從進(jìn)入滯育狀態(tài)到滯育解除 (蛹期)一直處于較高水平;而海藻糖滯育的前期10-30 d時含量較少,后期逐漸增加,滯育解除時又降低.此結(jié)果顯示：糖原在整個滯育過程中起主導(dǎo)作用,海藻糖在滯育后期起一定作用.同樣以糖原或海藻糖為主進(jìn)入滯育的昆蟲有：柞蠶Antheraea pernyi,其滯育蛹的血淋巴中所含糖類為海藻糖和葡萄糖[12];麥紅吸漿蟲在土中滯育的絕大部分時間,海藻糖含量一直維持在一個較高的水平[13];斑蛾 Zygaena trif olii,其滯育幼蟲糖原含量是非滯育幼蟲的兩倍多,糖原是其進(jìn)入滯育后最重要的能源[14].早在1982年Hayakawa和Chino就已經(jīng)提出滯育昆蟲的糖醇積累型至少可分為兩種類型：一類為糖原積累型;另一類為海藻糖積累型.由本試驗(yàn)結(jié)果可以看出：中紅側(cè)溝繭蜂屬于糖原積累型昆蟲.海藻糖在滯育后期雖出現(xiàn)上升趨勢,但其生理功能目前尚未清楚,有待于進(jìn)一步研究[15].

有些越冬昆蟲通常也利用甘油,山梨醇等來降低過冷卻點(diǎn),提高抗寒能力.許多昆蟲在進(jìn)入滯育前或中均調(diào)節(jié)血淋巴中甘油三酯的含量,以保證血淋巴不被凍結(jié)[16,17].可以看出,昆蟲的滯育與甘油三酯的含量有著密切關(guān)系[18,19],其中溫度和光周期的變化是甘油三酯增多或減少的主要影響因子[17,20].中紅側(cè)溝繭蜂在滯育過程中甘油三酯的含量一直高于非滯育條件下的含量,對其度過寒冷的冬季打下良好基礎(chǔ).可見滯育條件-低溫和短光照對中紅側(cè)溝繭蜂滯育前甘油三酯的積累有重要影響.在整個滯育過程中,滯育前期10-20 d時含量較低,中期30-60 d時含量較高,滯育結(jié)束-蛹期時含量又降低.此結(jié)果與仵鈞祥[13]報(bào)道的小麥吸漿蟲 (Sitodiplosis mosellana Gehin)滯育時甘油三酯的變化一致.

在滯育過程中,中紅側(cè)溝繭蜂的蛋白質(zhì)含量一直較低,且不同階段并無顯著差異.在滯育后期蛋白質(zhì)含量略高于非滯育條件下含量.這與趙章武等人研究結(jié)果一致即非滯育昆蟲脂肪體或血淋巴中的可溶性蛋白質(zhì)含量低于滯育昆蟲脂肪體或血淋巴中的可溶性蛋白質(zhì)含量[21].

在中紅側(cè)溝繭蜂整個滯育發(fā)育及滯育過程中,比較幾種生理指標(biāo)數(shù)值,糖原含量一直高于海藻糖、甘油三酯、蛋白質(zhì)的含量,故此研究結(jié)果表明中紅側(cè)溝繭蜂滯育時的主要抗寒物質(zhì)是糖原.

[1] Tobias VI.Brakonidy kavkaza(Hemenoptera：braconidae)[M].Nauka：Leningrad,1976：287

[2] Said M K,Mustafaǒ.Biology of Microplitis mediator(Hym：Braconidae)a gregarious endoparasite of Agrotis Segetum(Lep：Noctuidae)[J].Bio Control,1988,33(02)：211-217

[3] 何俊華,王德安.中紅側(cè)溝繭科新記錄種：中紅側(cè)溝繭蜂 [J].華北農(nóng)學(xué)報(bào),1992,7(03)：123

[4] Shenefelt RD.Part 9.Braconidae;5.Macrogasterinae and Ichneutinae[A]Vecht J,Shenefelt RD.Hymenopterum catalogus nova edito[C].WJunk,Gravenhage：The Netherlands,1973：750-751.

[5] Arthur AP,Mason PG.Life history and immature stages of the parasitoid Microplitis mediator(Hymenoptera：Braconidae),reared on the bertha armyworm Mamestra configurata(Lepidoptera：Noctuidea)[J].Can Entom,1986,118(05)：487-491

[6] 王德安,南留柱,孫洗,等.棉鈴蟲低齡幼蟲寄生蜂-側(cè)溝繭蜂生物學(xué)研究 [J].昆蟲天敵,1984,6(04)：211-216

[7] Vinson SB,Pennacchio F,Lanzrein B.Interactions between parasitoids and their hosts an introduction and perspective[J].J Insect Physiol,1998,44：701-702

[8] Blumberg D,Navon A,Goldenberg S,et al.Interactions among Helicoverpa armigera(Lepidoptera：Noctuidae),its larval endoparasitoid Microplitis croceipes(Hymenoptera：Braconidae),and Bacillus thuringiensis[J].J Econom Entom,1997,90(05)：1181-1186

[9] Salt RW.Role of glycerol in the cold-harding of Bracon cephi(Gahan)[J].Can J Zool,1959,37：59-69

[10] Zachariassen KE.The mechanism of the cryo-protective effect of glycerol in beetles tolerant to freezing[J].J Insect Physiol,1979,25(01)：29-32

[11] Liu HX,Li G,Wu WJ.Entomological Biochemical[M].Xi’an ：Science and Technology Press of Shanxi,1998 ：263

[12] Lu MX.Effect of temperature and p hotoperiod on dynamics of carbohydrate contents in haemolymph and fatty body of pupa of Antheraea pernyi[J].Acta Entomol Sinic,1992,35(01)：1-7

[13] 仵均祥,袁峰,蘇麗.麥紅吸漿蟲幼蟲滯育期間糖類物質(zhì)變化 [J].昆蟲學(xué)報(bào),2004,47(02)：178-183

[14] Wipking W,Viebahn M,Neumann D.Oxygen consumption,water,lipid and glycogen content of early and late diapause and non-diapause larvae of the burnet moth Zygaena trifolii[J].J Insect Physiol,1995,41(01)：47-56

[15] Hayakawa Y.Growth-blocking peptide：an insect biogenic peptide that prevents the onset of metamorphosis[J].J Insect Physiol,1982,41：1-6

[16] Asahina E.Freezing and frost resistance in insects[A].Meryman HT.Crybiology[C].New York：Academic press 1966,6(05)：425-482

[17] Asahina E.Frost resistance in insects[J].Adv Insect Physiol,1969,6：1-50

[18] Wyatt GR.The biochemistry of sugars and polysaccharides in insects[J].Adv Insect Physiol,1967,4：287-360

[19] Mansingh A.Studies on insect dormancy.Ⅱ.Relationship of cold-hardiness to diapause and quiescence in the Eastern tent caterpillar,Malacosoma americanum(Fab.),(Lasiocamnidae：Lepidoptera)[J].Can J Zool,1974,52：629-637

[20] Danks HV.Insect Dormancy：an Ecological Perspective[J].Bio Survey Can(Terrestrial Arthropods),Ottawa,1987,336-339

[21] 趙章武,黃永平.昆蟲滯育關(guān)聯(lián)蛋白的研究進(jìn)展 [J].昆蟲知識,1996,33(03)：187-191