重組hIFN-α-2b-BCG的凍干制備及生物特性的研究*

孫二琳 趙 杰 范曉東 韓瑞發(fā)

重組hIFN-α-2b-BCG的凍干制備及生物特性的研究*

孫二琳 趙 杰 范曉東 韓瑞發(fā)△

目的：研究重組hIFN-α-2b-BCG真空冷凍干燥的制備工藝，研究凍干后生物特性的變化。方法：采用真空冷凍干燥法制備重組BCG（rBCG），篩選最佳工藝參數(shù)。平板計數(shù)法比較冷凍干前后的活菌數(shù)，計算存活率。比較凍干前后rBCG的抗酸染色特征與形態(tài)，連續(xù)測定OD值，繪制生長曲線，酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）IFN-α-2b表達水平。PCR和抗性培養(yǎng)分析凍干后的質粒穩(wěn)定性。結果：凍干后重組BCG為（6.51±0.33）×106CFU/mL，凍干前為（1.02±0.11）×107CFU/mL，存活率約65%，達到BCG生物免疫治療所需的活菌標準。凍干前后的菌落形態(tài)、生長曲線及抗酸染色特征無明顯差異。質粒插入基因穩(wěn)定率91.7%，丟失率為8.3%。凍干前后分泌IFN-α-2b水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0．05）。結論：成功制備了重組hIFN-α-2b BCG凍干制劑，活菌數(shù)達到生物免疫治療標準，其生物學特性和質粒穩(wěn)定性均可耐受冷凍、低溫與真空干燥過程中的不利影響。

干擾素α-2b 卡介苗 重組,遺傳 質粒 冷凍干燥法 酶聯(lián)免疫吸附測定

卡介苗（BCG）是一種牛型分枝桿菌減毒活疫苗，作為免疫佐劑在預防膀胱腫瘤復發(fā)及治療原位癌方面已取得較好療效[1]。利用基因工程技術構建分泌細胞因子的重組BCG可以提高其抗腫瘤活性并減少與劑量有關的不良反應，同時可通過重組BCG持續(xù)分泌的細胞因子來克服直接使用細胞因子灌注時半衰期短、水溶性易隨尿流失及需反復大量灌注等缺點，成為近幾年膀胱腫瘤治療研究的熱點[2]?；蛑亟MBCG因導入外源性質粒，其生物活性能否長期保存就尤為重要。本所已成功構建了分泌型的表達人干擾素（hIFN）－α－2b的重組BCG[3]。目前關于基因重組IFN-α-2b-BCG的冷凍干燥制備及凍干后其生物特性、外源基因表達穩(wěn)定性的研究少見報道，本文對此進行探討。

1 材料與方法

1.1材料 重組hIFN-α-2b BCG由本所基因工程室自行構建保存，由hIFN-α-2b片段定向克隆至pMAO-4穿梭質粒形成重組質粒phIFN-α-2b，在DH5α-E.coli富集后提取電轉導至BCG構建成，步驟詳見參考文獻[4]。主要試劑：谷氨酸鈉（上海天蓮精細化工有限公司），蔗糖（北方天醫(yī)化學試劑廠），明膠（天津市用大化學試劑開發(fā)中心）；Middlebrook 7H9 Broth和7H10 Agar購自美國DIFCO；Kanamycin Sulfate為AMRESCO分裝；hIFN-α-2b酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒購自美國Biosource公司。

1.2凍干制備 重組BCG（rBCG）在含卡那抗性的7H9液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)7～9 d，取對數(shù)生長末期（OD600值為0.85）菌液4 mL離心，雙蒸水洗滌，沉淀中加入1 mL保護液（10%蔗糖、1%明膠、1%氯化鉀、1%谷氨酸鈉），裝入西林瓶。在真空冷凍干燥機（Sublimator2-3-3/5）中，經(jīng)預凍-40℃ 5 h、第一階段干燥-30℃12 h、第二階段干燥20℃2 h，真空下壓塞制成凍干粉末。

1.3活菌計數(shù) 分別取凍前rBCG 1 mL（OD值0．85）、1/4瓶凍干rBCG加入1 mL 7H9溶解，各加入9 mL 7H9液體培養(yǎng)基，依次稀釋4、5次（即1:10 000和1∶100 000），各取0.1 mL，7H10固體培養(yǎng)基，2種稀釋濃度各接種3個培養(yǎng)皿。置37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，4～6周后讀取生長結果。取同一濃度3支培養(yǎng)基上生長菌落的平均數(shù)，計算出每毫升BCG中的活菌數(shù)。將凍干rBCG在4℃冰箱保存1個月后，重復上述操作。BCG 活菌數(shù)=（1∶10 000 的菌落數(shù)×10 萬）+（1∶100 000 的菌落數(shù)×1 000 000）/2；凍干rBCG存活率=凍后活菌數(shù)/凍前活菌數(shù)×100%。

1.4質粒穩(wěn)定性研究 挑取7H10固體培養(yǎng)基上生長的凍干后rBCG單菌落接種于2個24孔板中，每孔中有2 mL 7H9培養(yǎng)基（30 mg/L卡那霉素），37℃震搖培養(yǎng),1周后觀察結果。菌液沒有生長者為質粒脫失。隨機取10孔菌液抗酸染色。根據(jù)hIFN-α-2b序列設計引物，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。引物上游5′-CAAGGGATCCTGTGA TCTGCCTCAAACCCACAG-3′，下游 5′-GCCGGAATTCTCAT TCCTTACTTAAACTTTCTT-3′。取24孔板中擴增的菌液1 mL，離心去上清，洗滌沉淀。加入30 μL雙蒸水，煮沸10 min。離心取上清液20 μL作為模板進行PCR反應。PCR反應條件：94℃預變性5 min，94℃變性 30 s，55℃退火50 s，72℃延伸50 s，最后1次72℃延伸7 min，共25個循環(huán)。1%瓊脂糖凝膠電泳分析。上下游引物雙向測序。

1.5凍前與凍后rBCG生長曲線的繪制 將凍前rBCG和凍干rBCG分別接種到3瓶50 mL 7H9液體培養(yǎng)基中，每天取出2～3 mL，測定各瓶在600 nm處的OD值，3瓶測定結果取平均值作為OD值測定結果，至其停止生長為止。以時間為橫坐標，OD值為縱坐標，分別制作凍干前后的生長曲線。

1.6ELISA法檢測凍干前后hIFN-α-2b表達量 分別取1 mL rBCG（OD 值 0.85）、1/4瓶凍干前后 rBCG（各 3瓶）接種于30 mL 7H9液體培養(yǎng)基中（含有30 mg/L卡那霉素），每天測其OD值。測OD值后取菌液1 mL，10 000 r/min離心10 min，取上清為標本，-20℃凍存。按照ELISA試劑盒說明書測定分泌至上清中的IFN-α-2b。5 min內(nèi)450 nm處測定。每份樣品復孔檢測。根據(jù)標準曲線計算出樣品含量，取平均值作為最終結果。

1.7凍干前后rBCG進行抗酸染色比較 將被檢物涂于玻片晾干，加Ⅰ液（碳酸復紅液）覆蓋，加熱，放涼，用水沖洗；加Ⅱ液（3%鹽酸乙醇溶液）1 min，用水沖洗；加Ⅲ液（呂弗勒氏堿性美蘭液）2 min，用水沖洗。晾干后封片，油鏡下觀察。

1.8統(tǒng)計學方法 采用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件進行分析，所有數(shù)據(jù)采用±s表示。樣本均數(shù)間的比較采用獨立樣本t檢驗，多水平重復測量數(shù)據(jù)采用單個重復測量因素的方差分析；率的比較采用卡方檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 凍干rBCG外觀形態(tài) 凍干粉劑外觀為白色疏松粉末，加水后3 min內(nèi)快速溶解。凍干后rBCG的菌落外觀形態(tài)和抗酸染色與凍干前相比均無明顯變化，見圖1。

圖1 重組BCG菌落

2.2活菌計數(shù) 凍干前檢測活菌數(shù)為（1.02±0.11）×107CFU/mL（CFU為菌落形成單位,colony formation unit），凍干后為（6.51±0.33）×106CFU/mL；存活率為65%。保存1個月后，凍干rBCG活性菌為（6.04±0.26）×106CFU/mL，存活率 60%，1個月保存對凍干狀態(tài)的活菌數(shù)無明顯影響（t=0．465，P ＞ 0．05）。

2.3生長曲線 記錄生長1周內(nèi)的OD值，測量時間與組別（凍干前、后組）之間無交互作用（F=0.507，P=0.605）；各測量時間點之間的測量值差別存在統(tǒng)計學意義（F=1 684.54，P<0.001）；凍干前、后組rBCG的生長沒有明顯變化（F=4．102，P＝0．113），見圖 2。

2.4質粒穩(wěn)定性結果含卡那霉素的7H9培養(yǎng)基的48孔中，有4孔沒有生長，見圖3。質粒丟失率為8.3%。其余44孔抗酸染色證明均為抗酸桿菌特征。hIFN-α-2b片段的PCR反應凝膠電泳檢測結果顯示在500 bp出現(xiàn)目的條帶，見圖4。測序結果與插入片段序列一致。

圖2 凍干前后rBCG的生長曲線

2.5凍干前后hIFN-α-2b的表達 ELISA法測定凍干前后重組BCG表達hIFN-α-2b的情況，不同OD值測量點與組別之間無交互作用（F=1.249，P=0.326）；不同OD值測量時間點的測量值差別存在統(tǒng)計學意義（F=65 331.85，P<0.001)；對比培養(yǎng)生長至不同OD時相時，凍干前、后rBCG表達的IFN-α－2b 差異無統(tǒng)計學意義（F=3．084，P ＝ 0．272），見表1。

表1 凍干重組BCG生長過程中IFN-a-2b 的分泌表達

表1 凍干重組BCG生長過程中IFN-a-2b 的分泌表達

組別凍干前組凍干后組0.2 OD 97.5±2.6 93.6±2.1 0.4 OD 179.4±5.9 170.4±6.1 0.6 OD 368.3±8.7 356.6±7.9 0.8 OD 789.4±10.0 780.3±11.2 1.0 OD 1 226.3±14.7 1 210.3±16.3

3 討論

真空冷凍干燥系將藥物溶液在體系共熔點以下預凍成固體，然后在低溫低壓的條件下，從凍結狀態(tài)不經(jīng)過液態(tài)而直接升華除去水分的一種干燥方式，是長期保存菌種比較好的一種傳統(tǒng)方法。該法不適合于保存嬌嫩的菌種，因必須經(jīng)歷應激和DNA損傷，可導致微生物的完全死亡或者某些重要生物功能的喪失或生物突變體的產(chǎn)生。革蘭陽性菌凍干后活菌率為80%左右，革蘭陰性菌凍干后活菌率為50%左右，可能原因為菌膜結構不同造成的菌齡和細胞濃度對凍干后活菌數(shù)有重要影響[5-7]。保存菌種的基本目的是凍干保存后細菌的活菌數(shù)、保存時間、保存后生物學特性的變化，研究的中心是選擇合適的凍干保護劑配方以及篩選最佳冷凍干燥工藝參數(shù)。本試驗中涉及保存的菌種是重組卡介苗，含有人工轉導的重組質粒，不同于野生型卡介苗。雖然凍干皮內(nèi)接種的野生型卡介苗已廣泛應用于臨床，但關于重組卡介苗的冷凍干燥的方法保存，其活菌數(shù)、生長狀況有無變化，外源蛋白能否順利表達以及重組質粒能否耐受冷凍干燥的惡劣環(huán)境方面少見文獻報道，質粒有無脫失對維持良好的免疫原性至關重要。

冷凍干燥保存后細胞活力很高，但質粒編碼的生物學活性可能存在喪失現(xiàn)象。國內(nèi)學者研究了鼠疫桿菌、乳酸菌等冷凍干燥采用復蘇后提取質粒電泳或基因擴增的方法證實凍干前后質粒變化[5-6]，但未進一步研究質粒脫失率和突變情況?；蚬こ叹睦鋬龈稍锔匾氖侵亟M蛋白表達和功能的維持。鄧光存等[8]對基因工程菌株 BL21（DE3）（pECBST1）進行了冷凍干燥保存，其存活率和冷凍保存沒有明顯差別。Sidyakina等[9]對重組大腸桿菌HB101（含有重組質粒pHS35）保存2年發(fā)現(xiàn)：冷凍干燥（保存于4℃）后細菌存活率為2%～19%，深低溫保藏（-160℃）為 51%～100%，低溫保藏（-70℃）為60%～70%，各種方法保存后基因穩(wěn)定性均為100%。Yoon[10]進行了含自身質粒pKM10/pKM20假單胞菌和人工轉染包含pKM20/pKM10雙質粒的假單胞菌的冷凍干燥，發(fā)現(xiàn)質粒脫失比較嚴重；自然質粒和人工轉染質粒的脫失率無顯著差別，隨保存時間延長人工轉染的質粒更易脫失。最近關于重組BCG的研究大多數(shù)包括評價其穩(wěn)定性。通常通過評價rBCG保持卡那霉素抗性的百分比，作為質粒存在的指標。這種評價方法有其局限性，因為選擇標記的存在不能區(qū)別那些外源基因缺失而選擇性標記存在的突變體。應該通過卡那霉素抗性的保留和目的基因片段的存在雙重標準來評價質粒的完整性。

本研究結果顯示冷凍干燥能很好的保存基因工程菌hIFN-α-2b-rBCG,分析冷凍干燥過程對hIFN-α-2b-rBCG的影響發(fā)現(xiàn)，活菌數(shù)滿足免疫治療活菌數(shù)>100萬的要求。并且證明冷凍干燥后重組BCG仍能很好地表達外源性蛋白—人干擾素-α-2b，相同OD值下表達量與冷凍干燥前沒有顯著差別。冷凍干燥后的形態(tài)、生長情況沒有明顯變化。外源質?；究梢阅褪芾鋬龈稍镞^程中的不利環(huán)境，僅發(fā)現(xiàn)存在少量質粒脫失現(xiàn)象，質粒未缺失株均可檢測到IFN-α-2b完整目的片段，故不影響重組BCG的臨床應用。

[1] Lam JS,Benson MC,O’Donnell MA,et al.Bacillus Calmete-Guerin plus interferon-alpha2B intravesical therapy maintains an extended treatment plan for superficial bladder cancer with minimal toxicity[J].Urol Oncol,2003,21(5):354-360.

[2] Dennehya M,Williamson AL.Factors influencing the immune response to foreign antigen expressed in recombinant BCG vaccines[J].Vaccine,2005,23(10):1209-1224.

[3] 孫二琳,劉春雨,韓瑞發(fā),等.重組hIFN-α-2B-BCG的生物學特性的觀察[J].中華微生物和免疫學雜志,2010,30(1):46-51.

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[8] 鄧光存,呂玉玲,王玉炯.基因工程菌株BL21(DE3)(pECB-ST1)菌種的限定代次及保存條件試驗[J].寧夏農(nóng)學院學報,2002,23(2):24-26.

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Lyophilization-Preparation and Biological Characteristics of Recombinant hIFN-α-2b-BCG

SUN Erlin,ZHAO Jie,FAN Xiaodong,HAN Ruifa

Tianjin Institute of Urology,The second Hospital of Tianjin Medical University,Tianjin 300211,China

Objective:To explore the preparation process of lyophilization of recombinant hIFN-α-2b-BCG(rBCG),and the biological characteristics of lyophilized rBCG thereof.Methods:It was used to determine the optimum process parameters that preparation by vacuum freeze-drying recombinant rBCG.The number of viable cells was compared with the plate count before and after lyophilization to calculate the survival rate.The acid-fast staining characteristics and morphology of the lyophilized rBCG were analyzed.The OD value of freeze-dried rBCG was continuously measured for drawing the growth curve.The level of IFN-α-2b expression was determined by ELISA.The plasmid stability was analysed by PCR.Results:The number of viable rBCG reached （6.51±0.33）×106CFU/mL after lyophilization.The value was （1.02±0.11）×107CFU/mL before freeze-drying,and the survival rate was about 65%.The viable number achieved the required standard of bio-immunotherapy.There were no significant differences in morphology,growth rate and acid-fast staining characteristics of lyophilized rBCG compared with those of un-lyophilized.The stability rate of gene inserted(hIFN-α-2b)was 91.7%,loss rate 8.3%.There was no significant difference in the level of secretion of rIFN-α-2b by rBCG after lyophilization(P>0.05).Conclusion:Freezedried powder of hIFN-α-2b-rBCG was successfully prepared,which was without significant adverse effects on the hIFN-α-2b expression,plasmid insert and bio-characteristics.

interferon alfa-2b BCG vaccine recombination,genetic plasmids freeze drying enzyme-linked immunosorbent assay

*國家科技部“十一五”重大專項新藥創(chuàng)建課題（項目編號：2009ZX09103-699）；國家自然科學基金資助項目（項目編號：30872587）；天津市科技支撐計劃重大項目（項目編號：07ZCKFSH03200）

300211 天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院、天津市泌尿外科研究所

△通訊作者 E-mail:miyansuo@126.com

（2010-07-18收稿 2010-10-08修回）

（本文編輯 李國琪）