堿性木聚糖酶產(chǎn)酶菌株—芽胞桿菌M-26的選育

慕 娟,問清江,黨 永,吳小杰,李葉昕

(陜西省微生物研究所,陜西西安 710043)

木聚糖是以木吡喃糖為單位的由β-1,4鍵連接的半纖維素,富含于闊葉樹和大多數(shù)一年生植物體內(nèi),半纖維素在自然界中含量占生物量的30%,僅次于纖維素。木聚糖伴隨纖維素存在于造紙工藝過程的紙漿中,對白度等紙張性能產(chǎn)生不良影響。傳統(tǒng)的化學(xué)漂白法是采用含氯漂白劑,這會使造紙廢水中含多種含氯化合物、二惡英和呋喃等劇毒物質(zhì)。堿性木聚糖酶可以在堿性條件下降解木聚糖,將其用于紙漿生物漂白,可以減少化學(xué)藥品的用量,從而減少了釋放到環(huán)境中的有毒氯化物,有利于環(huán)境保護。要開發(fā)木聚糖酶制劑,首先要進行產(chǎn)酶菌株的選育,本研究從造紙企業(yè)的廢水采集樣品,選育出1株堿性木聚糖酶產(chǎn)酶菌株短小芽胞桿菌M-26,并對其酶學(xué)性質(zhì)和產(chǎn)酶條件進行了初步研究,為進一步開發(fā)木聚糖酶制劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 樺木木聚糖(brichwoodxylan),Sigma公司;3,5-二硝基水楊酸(DNS),化學(xué)純;其他試劑為市售分析純。

1.1.2 樣品 西安市蔡倫造紙廠堿處理廢水。

1.1.3 培養(yǎng)基(g/L) ①選擇性培養(yǎng)基：蛋白胨10,牛肉膏3,NaCl 5,木聚糖8,瓊脂20,pH 8.0;②LB培養(yǎng)基：蛋白胨10,酵母膏5,葡萄糖10,NaCl 5,pH 8.0;③基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基：麩皮40,蛋白胨10,MgSO40.1,K2HPO44,pH 8.0。

1.2 方法

1.2.1 菌種初篩 量取50 mL水樣置于300 mL三角瓶中煮沸5 min,靜置沉降;吸取上清液用無菌水進行10-1～10-5梯度稀釋,涂布于選擇培養(yǎng)基平板,37℃培養(yǎng)24 h,選擇生長狀況良好的單菌落挑出,接入選擇性培養(yǎng)基斜面培養(yǎng),作為復(fù)篩菌種。

1.2.2 菌種復(fù)篩 ①剛果紅透明圈染色法篩選：將初篩出的菌種在選擇性培養(yǎng)基平板劃線,37℃培養(yǎng)48 h;用0.1%的剛果紅溶液染色1 h(覆蓋整個平板),再用1 mol/L的NaCl溶液脫色1 h;菌落周圍出現(xiàn)透明圈的則為木聚糖酶產(chǎn)生菌株,根據(jù)透明圈大小及透明圈直徑與菌落直徑之比大小來確定產(chǎn)酶能力強弱,從而選擇產(chǎn)酶菌株;②搖瓶發(fā)酵篩選：將剛果紅法篩選的菌株接種于LB培養(yǎng)基中,300 mL三角瓶裝液量50 mL,37℃搖床培養(yǎng)24 h;以2%接種量接于基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中,37℃搖床培養(yǎng)48 h;將發(fā)酵液4 000 r/min離心15 min,取上清液檢測木聚糖酶活力,根據(jù)活力大小作為篩選依據(jù)。

1.2.3 木聚糖酶活力測定 采用DNS法測定木聚糖酶活力。配制1 mg/mL木糖標準溶液,分別量取0.2、0.25、0.3、0.35、0.4 mL木聚糖標準溶液,用蒸餾水補齊1 mL,再加入2 mL DNS,沸水浴2 min,流水冷卻后加蒸餾水至10 mL,在540 nm進行光吸收測定,繪制木糖標準曲線,得出回歸方程用于酶活測定。發(fā)酵液經(jīng)4 000 r/min離心15 min后取上清,即為粗酶液。將粗酶液經(jīng)適當稀釋后,取0.5 mL酶液加入0.5 mL 1%的木聚糖溶液,50℃準確反應(yīng)10 min,加入2 mL DNS終止反應(yīng),煮沸2 min顯色,然后流水冷卻至室溫,定容至10 mL,以蒸餾水為對照,540 nm測定吸光值,根據(jù)回歸方程得出水解液中木糖含量,從而確定酶活。酶活單位定義：上述條件下,每分鐘釋放1μmol還原糖(以木糖計)所需要的酶量定義為1個酶活力單位( IU)。

1.2.4 16S rDNA菌種鑒定 挑取斜面于無菌水中,取10μL,于95℃裂解20 min;擴增體系為10 μL：模版0.5μL;10×buffer 1μL;dNTP 1μL;Pr imer(+)0.5μL;Primer(-)0.5μL;Taq酶0.5μL;H2O 6μL;PCR條件：94℃預(yù)變性5 min,94℃變性30 s,40℃退火30 s,72℃延伸1 min,共40個循環(huán),最后72℃延伸10 min;將目的基因連接到T載體上,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞中,涂布在含有氨芐青霉素、IPTG、X-gal的LB平板上,37℃培養(yǎng)24 h;挑取白色克隆,接種于含氨芐LB液體培養(yǎng)中,37℃過夜培養(yǎng),提取質(zhì)粒,PCR或酶切鑒定。將陽性克隆子送華大基因測序;將序列進行比對和聚類分析,并構(gòu)建進化樹。1.2.5 酶學(xué)性質(zhì)分析 ①木聚糖酶反應(yīng)的最適pH：用不同pH值的緩沖液適當稀釋酶液,使酶反應(yīng)在不同pH值條件下進行反應(yīng),測定酶活力;②木聚糖酶反應(yīng)的最適溫度：適當稀釋酶液,分別在45、50、55、60、65℃溫度條件下進行反應(yīng),測定酶活力;③pH對木聚糖酶穩(wěn)定性的影響：分別用pH 7.6、8.0、8.6、9.0、9.6的緩沖液適當稀釋酶液,4℃,放置24 h,測定其殘余酶活力;④溫度對木聚糖酶穩(wěn)定性的影響：酶液分別在50、55、60、65、70℃下放置1 h,并每隔10 min取樣,測定其殘余酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 剛果紅法平板篩選

將選擇培養(yǎng)基初篩菌株M-26在選擇培養(yǎng)基平板劃線,37℃培養(yǎng)48 h,用0.1%的剛果紅溶液染色1 h(覆蓋整個平板),再用1 mol/L的NaCl溶液脫色1 h,菌落周圍有透明圈,測定菌落直徑和透明圈直徑,由透明圈的大小及兩徑比可以初步判斷菌株的產(chǎn)酶能力,結(jié)果見表1。由表1可見,M-26平板上透明圈直徑約20 mm,菌落直徑約4 mm,兩徑比約5。這只是平板篩選對菌株產(chǎn)酶活力的粗略的衡量,M-26的產(chǎn)酶能力需要搖瓶進一步的定量確定。

2.2 基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基液體發(fā)酵篩選

將M-26接種于LB培養(yǎng)基中,300 mL三角瓶裝液量50 mL,37℃搖床培養(yǎng)24 h;以2%接種量接于基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中,37℃搖床培養(yǎng)48 h;將發(fā)酵液4 000 r/min離心15 min,取上清液檢測木聚糖酶活力。進行數(shù)批次試驗,結(jié)果見表2。M-26經(jīng)過搖瓶篩選,基礎(chǔ)培養(yǎng)基產(chǎn)酶活力可達420 IU/mL。

表1 M-26剛果紅法平板選育結(jié)果Table 1 The congo-red flat breeding result ofM-26

表2 M-26基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基發(fā)酵選育結(jié)果Table 2 The basal medium fermentation breeding result ofM-26

2.3 M-26產(chǎn)木聚糖酶條件優(yōu)化

對基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基進行改良,碳源、氮源、無機鹽條件試驗。以麩皮(4%、5%、6%)、酵母膏(0.3%、0.5%、0.7%)、氯化銨(0.5%、0.7%、0.9%)、氯化鈉(1、3、5 mmol/L)、氯化鈣(3、5、7 mmol/L)、硫酸鎂(1、3、5 mmol/L)進行6因素3水平的正交試驗,結(jié)果見表3。從結(jié)果極差分析可知,A＞B＞E＞C＞D＞F,最好的結(jié)果為A3B2C3D1E3F1。由于該結(jié)果不在表中之列,所以進行驗證試驗。將表中最高試驗號7(A3B1C2D1E3F2)、8(A3B2C3D2E1F3)和A3B2C3D1E3F1進行比較,結(jié)果表明：8(A3B2C3D2E1F3)為最佳,產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基：麩皮6%,MgSO43 mmol/L,氯化鈉3 mmol/L,氯化鈣7 mmol/L,氯化銨0.9%,K2HPO40.4%,酵母膏0.3%,pH調(diào)節(jié)至8.0。

表3 正交實驗結(jié)果Table 3 The result of orthogonal experiment

將M-26接種于LB培養(yǎng)基中,300 mL三角瓶裝液量50 mL,37℃搖床培養(yǎng)24 h;以2%接種量接于產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中,37℃搖床培養(yǎng)48 h;將發(fā)酵液4 000 r/min離心15 min,取上清液檢測木聚糖酶活力。進行數(shù)批次試驗,結(jié)果見表4。經(jīng)過發(fā)酵條件優(yōu)化后,M-26產(chǎn)酶活力可達625 IU/mL。

2.4 堿性木聚糖酶產(chǎn)酶菌株M-26的16S rDNA鑒定

利用通用引物從M-26染色體DNA中擴增出2.0 kb的rDNA基因片段(圖1),將其克隆到pGEM-T Easy載體上,進行序列測定。M-26的16S rDNA基因序列與GenBank中的參考序列進行對比,查找出相關(guān)序列,用生物學(xué)聚類軟件MEGA生成系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。發(fā)現(xiàn)M-26的序列與Bacillus pum ilus具有極高的同源性,結(jié)合培養(yǎng)特征、形態(tài)特征和生理生化幾方面特征,基本可以確定M-26為短小芽胞桿菌(Bacillus pum ilus)。

表4 M-26發(fā)酵條件研究結(jié)果Table 4 The fer mentation condition result ofM-26

圖1 M-26 16S rDNA擴增產(chǎn)物Fig.1 PCR product of 16S r DNA

圖2 根據(jù)16S rDNA部分基因序列構(gòu)建的M-26的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strainM-26 and related strains based on 16S r DNA

2.5 木聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)分析

2.5.1 最適作用溫度及溫度穩(wěn)定性 將粗酶液稀釋一定的濃度,在不同溫度條件下酶促反應(yīng),檢測木聚糖酶活力,結(jié)果見圖3。由圖3可知,木聚糖酶的最適反應(yīng)溫度為55℃。將粗酶液在不同溫度條件下,保溫20 min,檢測剩余木聚糖酶活力,未經(jīng)處理酶活力為100,結(jié)果見圖4。由圖4可知,50℃處理剩余酶活達95%以上,55℃處理剩余酶活為80%,60℃處理剩余酶活70%,65℃和70℃剩余酶活均為10%。

2.5.2 最適作用pH及pH穩(wěn)定性 用不同pH值的緩沖液適當稀釋酶液,使酶反應(yīng)在不同pH值條件下進行反應(yīng),測定酶活力,結(jié)果見圖5。由圖5可知,木聚糖酶的最適反應(yīng)pH為8.0。將粗酶液用不同pH緩沖液適當稀釋,4℃,放置24 h,測定其殘余酶活力,結(jié)果見圖6。

圖3 木聚糖酶的最適溫度Fig.3 Effect of temperature on the activity of xylanase

圖4 木聚糖酶的溫度穩(wěn)定性Fig.4 Temperature stability of xylanase

圖5 木聚糖酶的最適作用pHFig.5 Effect of pH on the activity of xylanase

圖6 木聚糖酶的pH穩(wěn)定性Fig.6 pH stability of xylanase

由圖6可知,酶液于pH 8.0下,幾乎沒有酶活損失;在pH 8.6下的殘余酶活力約50%;在pH 9.0下,殘余酶活力約40%;pH 9.6下,殘余酶活力不足10%。結(jié)果表明該木聚糖酶為堿性木聚糖酶,且具有一定的耐堿性。

3 討 論

利用剛果紅平板法從造紙企業(yè)紙漿堿處理廢水中篩選到1株堿性木聚糖酶菌株M-26,對其進行培養(yǎng)特征、生理生化特征及16S r DNA序列分析,初步確定為短小芽胞桿菌。酶學(xué)性質(zhì)研究表明,55℃的最適作用溫度,pH 8.0的最適作用pH,一定的耐堿性為M-26所產(chǎn)堿性木聚糖酶的紙漿生物漂白應(yīng)用提供了技術(shù)保障。進行液體發(fā)酵條件優(yōu)化,使其最高產(chǎn)酶活力達到620 IU/mL,傳統(tǒng)選育條件下,M-26產(chǎn)酶活力為國內(nèi)最高水平。M-26發(fā)酵制成的酶制劑,酶活可達10 000 IU/g,經(jīng)檢測中無纖維素酶活力;堿性木聚糖酶制劑已進行了紙漿生物漂白條件試驗,酶用量為20 IU/g絕干漿,在保證漂白工藝達標的情況下,氯用量可減少30%左右,M-26所產(chǎn)堿性木聚糖酶應(yīng)用具有良好的前景。

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