混合培養(yǎng)提高菌株解磷解鉀能力的探討

韓 梅,李麗娜,魏 冉,彭 帥,韓曉日

(沈陽農(nóng)業(yè)大學土地與環(huán)境學院,遼寧沈陽 110161)

微生物是土壤肥力的核心,土壤中的微生物不僅數(shù)量巨大,而且種類極多,許多微生物對土壤氮、磷和鉀等養(yǎng)分的轉化和供給起非常重要的作用[1]。氮、磷和鉀均是作物生長發(fā)育必需的大量元素。根瘤菌可以與豆科植物共生固氮,在生物固氮中占有重要的地位[2]。溶磷菌、硅酸鹽細菌(又名鉀細菌)能夠分解土壤中的固定態(tài)磷、固定態(tài)鉀轉化為作物可以直接吸收利用的有效磷、有效鉀。同時根瘤菌、溶磷菌、硅酸鹽細菌可分泌促生長活性物質(zhì)促進植物的生長,因此是理想的生物肥料。微生物之間存在著協(xié)同、競爭、拮抗、捕食等作用,探討其具體關系有助于進一步開發(fā)微生物單一菌劑及復合菌劑[3]。本試驗將所得到的根瘤菌、溶磷菌和硅酸鹽細菌3株細菌混合培養(yǎng),試圖了解它們的相互作用效果。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌種 根瘤菌S-2、磷細菌P-3和硅酸鹽細菌K-5,沈陽農(nóng)業(yè)大學土壤與環(huán)境學院微生物實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 菌株拮抗試驗 ①培養(yǎng)基(Y MA培養(yǎng)基)：甘露醇10 g,NaCl 0.1 g,酵母膏1 g,K2HPO40.5 g,Rh溶液4 mL,蒸餾水1 000 mL,pH值為6.8～7.0(Rh溶液：H3BO45 g,Na2Mo45 g,蒸餾水1 000mL,pH值為3.0)[4];②拮抗反應測試：將活化后的根瘤菌、溶磷菌、硅酸鹽細菌兩兩交叉劃線到同一Y MA培養(yǎng)基上,置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d,每天觀察交叉點的細菌生長情況,判斷有無抑制情況。若交叉點細菌不生長或生長比較差,說明各細菌間有拮抗作用,若交叉點細菌生長良好,則說明各細菌可以共存,相互之間沒有拮抗作用,不發(fā)生拮抗反應的各菌株可以混合培養(yǎng)。

1.2.2 菌株溶解磷礦粉以及溶解鉀長石特性①培養(yǎng)基：甘露醇10 g,NaCl 0.1 g,(NH4)2SO40.5 g,酵母膏1 g,K2HPO40.5 g,KCl 0.2 g,MgSO4·7H2O 1 g,MnSO40.004 g,CaCO35 g,FeSO4·7H2O 0.003 g,CaCl 0.1 g,鉀長石粉2.0 g,磷礦粉5.0 g,卵磷脂2.0 g,Rh溶液4 mL,蒸餾水1 000 mL,pH值為6.8～7.0;②試驗方法：于250 mL三角瓶中注入100 mL的液體培養(yǎng)基,121℃高壓滅菌20 min備用。將在各自培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h的3株菌,分別制成菌懸液(調(diào)節(jié)OD660值,使含菌數(shù)在同一水平)接種于Y MA液體培養(yǎng)基。試驗共設8個處理：(A)對照(不接種);(B)接種根瘤菌菌液5 mL;(C)接種溶磷菌菌液5 mL;(D)接種硅酸鹽細菌菌液5 mL;(E)接種根瘤菌與溶磷菌菌液各5 mL;(F)接種根瘤菌與硅酸鹽細菌菌液各5 mL;(G)接種溶磷菌與硅酸鹽細菌菌液各5 mL;(H)接種3株菌菌液各5 mL。每個處理3次重復,搖床培養(yǎng)(28℃,160 r/min)3、7、10、15、20 d。4℃(10 000 r/min)離心15 min,離心后取上清液,取5 mL進行有效磷含量測定,取1 mL進行消煮,測定可溶性鉀含量。有效磷含量用鉬銻抗比色法測定,可溶性鉀含量用H2SO4-H2O2消煮后火焰光度計測定。溶磷量及溶鉀量均以扣除對照值表示(μg/mL)[3]。

2 結 果

2.1 拮抗

菌株拮抗測試顯示：3株菌相互之間均無拮抗反應。

2.2 溶解磷礦粉特性

根瘤菌S-2不具有溶磷能力。溶磷菌P-3和硅酸鹽細菌K-5均有溶磷特性,但其溶磷能力有一定的差別。根瘤菌、溶磷菌、硅酸鹽細菌單獨培養(yǎng)或混合培養(yǎng)后培養(yǎng)液有效磷含量測定結果見表1和圖1。

表1 培養(yǎng)液有效磷含量(μg/mL)Table 1 P content in solution(μg/mL)

圖1 10 d各處理培養(yǎng)液中有效磷含量Fig.1 Pcontent in solution of different Treatment in the 10th day

將試驗中8種處理搖瓶培養(yǎng)3、7、10、14、20 d,分別進行鉬銻抗比色,測定磷含量。標準曲線回歸方程：y=661.37x-0.012 3,R2=0.998 8。結果表明：橫向比較：從接種到第10天隨著培養(yǎng)時間的增加P-3的溶磷能力逐漸增強,可溶性磷含量增加了79.02%。10 d后溶磷能力下降,可溶性磷含量下降了36.97%,可見P-3在第10天時發(fā)揮最大功效。K-5同樣在第10天的時候溶磷能力最強,10 d前的可溶性磷含量增加了73.53%,10 d后下降了25.65%?？v向比較：第10天時S-2、P-3、K-5單獨培養(yǎng)或混合培養(yǎng)后培養(yǎng)液有效磷含量。S-2與P-3混合培養(yǎng)溶解磷礦粉的能力增強,組合有效磷含量較溶磷菌株單獨培養(yǎng)時顯著升高,S-2與P-3大于2菌株分別單獨培養(yǎng)時的有效磷含量之和,較P-3單獨培養(yǎng)時提高了25.50%。S-2與K-5大于2菌株分別單獨培養(yǎng)時的有效磷含量之和,較K-5單獨培養(yǎng)時提高了51.54%。然而P-3與K-5其有效磷含量雖較各菌株單獨培養(yǎng)時高,較P-3單獨培養(yǎng)時提高了26.99%。但未表現(xiàn)出1+1＞2的溶磷效果。這可能與菌體過多,其在空間和營養(yǎng)上存在競爭有關。S-2、P-3與K-5 3菌混合培養(yǎng)時具有1+1+1＞3的溶磷效果,這主要源于3菌株間的協(xié)同作用。

2.3 溶解鉀長石特性

硅酸鹽細菌、根瘤菌和溶磷菌都具有一定的解鉀效果,但其解鉀能力有一定的差別。根瘤菌、溶磷菌、硅酸鹽細菌單獨培養(yǎng)或混合培養(yǎng)后培養(yǎng)液可溶性鉀含量測定結果見表2、圖2。

將試驗中的8種處理搖瓶培養(yǎng)3、7、10、14、20 d,分別進行H2SO4-H2O2消煮,火焰光度計測定鉀含量。y=8 285.7x+1.071 4,R2=0.999 6。結果表明：橫向比較：從接種到第10天隨著培養(yǎng)時間的增加S-2的溶鉀能力逐漸增強,可溶性鉀含量增加了65.03%。10 d后溶鉀能力下降,可溶性鉀含量下降了53.31%,可見S-2在第10天發(fā)揮最大功效。P-3同樣在第10天的時候溶鉀能力最強,10 d前的可溶性鉀含量增加了58.15%,10 d后下降了55.34%。K-5也同樣在第10天時溶鉀能力最強,10 d前的可溶性鉀含量增加了89.39%,10 d后下降了39.96%。縱向比較：第10天時S-2、P-3、K-5單獨培養(yǎng)或混合培養(yǎng)后培養(yǎng)液可溶性鉀含量。S-2與P-3混合培養(yǎng)溶解鉀長石的能力增強,組合可溶性鉀含量較硅酸鹽細菌菌株單獨培養(yǎng)時顯著升高,但未表現(xiàn)出1+1＞2的解鉀效果。S-2與K-5大于S-2單獨培養(yǎng)時可溶性鉀含量,但與K-5的可溶性鉀含量持平,并無明顯的促進作用。同樣P-3與K-5的組合也無明顯的促進作用。S-2、P-3與K-5 3菌組合雖較各菌株單獨培養(yǎng)時高,但未表現(xiàn)出1+1+1＞3解鉀效果。這可能與菌體過多,其在空間和營養(yǎng)上存在競爭有關。

表2 培養(yǎng)液可溶性鉀含量(μg/mL)Table 2 K content in solution(μg/mL)

圖2 10 d各處理培養(yǎng)液中可溶性鉀含量Fig.2 K content in solution of different Treatment in the 10th day

3 討 論

根瘤菌S-2、溶磷菌P-3、硅酸鹽細菌K-5解磷解鉀能力存在一定差異,但大體均在第10天時解磷解鉀效果最好。根瘤菌S-2不具有解磷能力,然而S-2與P-3、K-5兩兩組合時表現(xiàn)出強大的促進作用,可能是S-2其生長代謝過程中的代謝物具有促進P-3、K-5解磷能力的作用。P-3與K-5的組合未體現(xiàn)出1+1＞2的解磷效果,3菌組合時也并未體現(xiàn)出1+1+1＞3解磷效果,這可能是由于營養(yǎng)及空間上的限制,導致互相之間產(chǎn)生一定的抑制作用,但是仍然是3菌組合時體現(xiàn)出的解磷效果最為明顯。根瘤菌S-2、溶磷菌P-3、硅酸鹽細菌K-5都具有不同程度的解鉀能力。解鉀能力：K-5＞S-2＞P-3。S-2與P-3的組合溶解鉀長石的能力較這2株菌分別培養(yǎng)時強,但并未體現(xiàn)出1+1＞2的效果。S-2與K-5以及P-3與K-5的組合中S-2與P-3并沒有體現(xiàn)出對K-5的促進作用,與K-5單獨培養(yǎng)時可溶性鉀含量相當。3菌混合培養(yǎng)時也并未體現(xiàn)出1+1+1＞3解鉀效果,可能是由于菌體過多在營養(yǎng)和空間上的不足導致的,但總體來說3菌混合培養(yǎng)時解鉀效果最為顯著。

[1] 孫焱鑫,姚軍刑,禮軍.解鉀菌與解磷菌及固氮菌的相互作用[J].生態(tài)學雜志,2001,21(2)：71-73.

[2] 張希濤,康麗華,馬海濱.具有解磷能力的相思根瘤菌的篩選[J].林業(yè)科學研究,2008,21(5)：619-624.

[3] 孫麗娜.苜蓿根瘤菌與溶磷菌互作及其菌肥對苜蓿生長和品質(zhì)影響研究[D].蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學,2008.

[4] 徐廣.西寧地區(qū)三葉草根瘤菌生物學特性及共生固氮效應的研究[D].西寧：青海師范大學,2009.