釀酒酵母W5及休哈塔假絲酵母20335原生質(zhì)體制備條件的確定

張麓巖,張夢(mèng)云,葛菁萍

(黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物黑龍江省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱 150080)

自1974年匈牙利學(xué)者Ferenczy報(bào)道了白地霉(Geotrichum candidum)營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株的原生質(zhì)體融合后[1],微生物原生質(zhì)體融合技術(shù)迅速發(fā)展。融合的種屬范圍逐漸擴(kuò)大,融合的親緣關(guān)系由最初的種內(nèi)株間融合,發(fā)展到種間、屬間,甚至科間的遠(yuǎn)源融合,融合的技術(shù)也由最初的化學(xué)融合法擴(kuò)展到電細(xì)胞融合法、電磁融合法、激光融合法等[2]。發(fā)展至今,原生質(zhì)體融合技術(shù)已成為一種系統(tǒng)、成熟的微生物育種手段,在微生物工業(yè)育種中發(fā)揮著重要的作用。木質(zhì)纖維素原料是地球上最豐富、最廉價(jià)的可再生資源,但目前大部分木質(zhì)纖維素資源尚不能夠被人類利用。隨著石油等不可再生資源的日漸匱乏以及糧食危機(jī)的繼續(xù)存在,如何以豐富的木質(zhì)纖維素類資源為原料,代替糧食進(jìn)行可再生清潔能源—生物乙醇的發(fā)酵成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)[3]。由于木糖是木質(zhì)纖維素水解物中含量?jī)H次于葡萄糖的一種單糖[4],因此如何有效地利用木糖,成為木質(zhì)纖維素生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)乙醇的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。釀酒酵母(Saccharom yces cerevisiae)具有細(xì)胞大、細(xì)胞壁厚、乙醇耐受性好、耐高糖、耐抑制物、代謝副產(chǎn)物少且在發(fā)酵過程中不易污染雜菌等特點(diǎn)[5],成為生物乙醇發(fā)酵的首選微生物。但由于釀酒酵母本身缺少木糖代謝途徑中的關(guān)鍵酶,從而不能利用木糖生產(chǎn)乙醇。休哈塔假絲酵母(Candida shehatae)具有木糖代謝流,能較好地利用木糖產(chǎn)生乙醇[6]。利用原生質(zhì)體融合的方法,構(gòu)建釀酒酵母與休哈塔假絲酵母融合株,避免了其他常規(guī)育種手段的冗繁環(huán)節(jié),可在較短的時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)雙親株遺傳物質(zhì)較大程度上的重組,獲得優(yōu)良性狀的融合子。本文旨在確定釀酒酵母W5、休哈塔假絲酵母20335原生質(zhì)體制備的條件,為雙親株原生質(zhì)體融合工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 釀酒酵母W5,原養(yǎng)型,由本實(shí)驗(yàn)室保存;休哈塔假絲酵母20335,原養(yǎng)型,由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①YEPD液體培養(yǎng)基：酵母膏1%,蛋白胨2%,葡萄糖2%;②YEPDS液體培養(yǎng)基：在YEPD液體培養(yǎng)基中加入17%的蔗糖;③YEPD、YEPDS固體培養(yǎng)基均在對(duì)應(yīng)液體培養(yǎng)基中添加2%的瓊脂粉。以上培養(yǎng)基于108℃,滅菌20 min。

1.1.3 試劑 ①脫壁預(yù)處理劑：0.1 mol/L pH 5.8檸檬酸-磷酸鹽緩沖液(CPB)中含0.2%β-巰基乙醇(體積比)及0.06 mol/L EDTA;②原生質(zhì)體制備液：0.1 mol/L pH 5.8檸檬酸-磷酸鹽緩沖液(CPB)中含0.8 mol/L山梨醇和0.01 mol/L EDTA;③2%蝸牛酶液：用0.1 mol/L pH 5.8檸檬酸-磷酸鹽緩沖液配置,0.22μm細(xì)菌濾器過濾除菌;④高滲溶液：15%的蔗糖溶液。

1.2 方法

1.2.1 雙親株對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的測(cè)定 取4℃保藏的雙親株斜面菌種,活化1～2代。挑取活化后的菌體,接種于100 mL/250 mL YEPD培養(yǎng)基中,30℃、140 r/min搖瓶培養(yǎng)14 h。吸取菌懸液,按5%接種量轉(zhuǎn)接于100 mL/250 mL YEPD培養(yǎng)基中,30℃、140 r/min搖瓶培養(yǎng)。每隔1 h取菌液,于600 nm下測(cè)定其OD值,并繪制曲線。

1.2.2 雙親株原生質(zhì)體制備及再生 菌體培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中期,4 500 r/min離心10 min收集菌體沉淀。無菌水洗滌菌體沉淀2次,并調(diào)整細(xì)胞數(shù)為108個(gè)/mL,吸取6 mL調(diào)整細(xì)胞數(shù)后的菌懸液,4 500 r/min離心10 min。向得到的菌體沉淀中加入3 mL脫壁預(yù)處理劑,30℃、100 r/min處理30 min,4 500 r/min離心收集菌體沉淀。用原生質(zhì)體制備液洗滌菌體沉淀,并用4 mL制備液重懸菌體沉淀于50 mL三角瓶?jī)?nèi)。向三角瓶?jī)?nèi)加入預(yù)先用2 mL CPB溶解的0.12 g蝸牛酶,使得酶的終濃度為2%,30℃、100 r/min酶解處理30 min。吸取酶解處理后的菌液,分別用高滲溶液和無菌水進(jìn)行梯度稀釋,依次涂布YEPDS及YEPD平板,30℃培養(yǎng)36～48 h,計(jì)數(shù)再生菌落數(shù)(B)及裂解計(jì)數(shù)(C)。

以未經(jīng)酶解的菌懸液作為對(duì)照組,無菌水梯度稀釋后涂布YEPD平板,記錄為總菌數(shù)(A)。根據(jù)A、B、C值計(jì)算原生質(zhì)體的制備率及再生率。

式中：A—蝸牛酶處理前的活菌數(shù)(個(gè)/mL)

B—酶處理組高滲溶液稀釋后再生菌落數(shù)(個(gè)/mL)

C—蝸牛酶處理后,經(jīng)無菌水裂解處理,在YEPD平板上長(zhǎng)出的菌落數(shù)(個(gè)/mL)

1.2.3 脫壁預(yù)處理時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體制備率的影響 將脫壁預(yù)處理時(shí)間調(diào)整為20、30和40 min,其他條件按照1.2.2的過程制備雙親株原生質(zhì)體,研究不同預(yù)處理時(shí)間對(duì)雙親株原生質(zhì)體制備率的影響。

1.2.4 酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體制備率及再生率的影響 將1.2.2中的酶解時(shí)間調(diào)整為15、30、45、60和75 min,制備雙親株原生質(zhì)體,計(jì)算原生質(zhì)體的制備率及再生率,研究不同酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體制備率及再生率的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙親株對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的測(cè)定

由于菌體的生理狀態(tài)不同,其細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)、代謝水平、菌體活力等均不相同。研究發(fā)現(xiàn)酵母菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞代謝活躍,生長(zhǎng)率高,群體細(xì)胞的化學(xué)組成、形態(tài)及生理特征比較一致[7]。因此,酵母菌原生質(zhì)體制備時(shí)一般取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。W5與20335在培養(yǎng)3 h后均進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,W5培養(yǎng)3～7 h時(shí)生長(zhǎng)較迅速,當(dāng)培養(yǎng)至8小時(shí)后生長(zhǎng)減慢,基本進(jìn)入穩(wěn)定期,選用培養(yǎng)4～5 h的菌體進(jìn)行原生質(zhì)體的制備;20335生長(zhǎng)較W5緩慢,培養(yǎng)3～10 h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,10 h后進(jìn)入穩(wěn)定期,選用培養(yǎng)6～7 h的菌體用于原生質(zhì)體的制備,見圖1。

圖1 雙親株生長(zhǎng)曲線Fig.1 The growth curve of the two parent strains

2.2 脫壁預(yù)處理時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體制備率的影響

原生質(zhì)體制備時(shí),所使用的脫壁預(yù)處理劑中含有β-巰基乙醇及EDTA,前者可以使細(xì)胞壁中蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵被還原,從而切開分子鏈,使酶更容易滲入,發(fā)揮更好的酶解作用[8]。EDTA則是一種金屬螯合劑,加入EDTA后,可以有效地去除反應(yīng)體系中金屬離子對(duì)酶的影響,從而提高酶的水解效率[9]。通過試驗(yàn)結(jié)果可以看出,在一定的預(yù)處理時(shí)間范圍內(nèi)對(duì)菌體進(jìn)行處理后,可以在較短時(shí)間內(nèi)獲得較高的原生質(zhì)體得率,但當(dāng)原生質(zhì)體制備率較高時(shí),繼續(xù)增加脫壁預(yù)處理時(shí)間,對(duì)原生質(zhì)體得率的影響并不顯著。當(dāng)預(yù)處理20 min時(shí),W5、20335原生質(zhì)體制備率均為90%左右,處理時(shí)間延長(zhǎng)10 min后,制備率分別上升為98.3%及94.4%,見表1。在此基礎(chǔ)上再延長(zhǎng)10 min后,雙親株原生質(zhì)體得率均沒有明顯的提高。鑒于脫壁預(yù)處理劑可能會(huì)損傷原生質(zhì)體膜,影響原生質(zhì)體的再生,因此,選擇30 min作為預(yù)處理的最佳時(shí)間。

表1 不同脫壁預(yù)處理時(shí)間對(duì)W5、20335原生質(zhì)體制備率影響Table 1 The effect of different preprocessing time to the protoplast preparation ratio of W5 and 20335

2.3 酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體制備率及再生率的影響

酶作用時(shí)間及體系中酶的終濃度是原生質(zhì)體制備過程中較為重要的影響因素。酶解時(shí)間過長(zhǎng),對(duì)于先形成的原生質(zhì)體膜有毒害作用,并且酶解時(shí)間過長(zhǎng),微生物細(xì)胞去壁太徹底,嚴(yán)重影響原生質(zhì)體的再生。但如果酶解時(shí)間太短,則導(dǎo)致原生質(zhì)體的形成率太低,也不利于原生質(zhì)體的融合[10]。同時(shí),酶用量過大,就會(huì)導(dǎo)致酶中帶有的對(duì)原生質(zhì)體有害的雜酶量增加,當(dāng)雜酶濃度達(dá)到一定值時(shí),必然會(huì)影響原生質(zhì)體的活性,從而影響原生質(zhì)體的融合與再生[11]。

本試驗(yàn)以體系中使用的固體酶量0.12 g為基準(zhǔn),分別研究了酶解15、30、45、60和75 min時(shí),W5和20335原生質(zhì)體制備率與再生率。由圖2和圖3可知,隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng),W5、20335原生質(zhì)體的制備率不斷升高,并且趨近于100%。原生質(zhì)體的再生率則隨著酶解時(shí)間的增加呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)。其中,酶解15 min時(shí),W5原生質(zhì)體的制備率為86.4%,再生率為9.4%,當(dāng)酶解時(shí)間為75 min時(shí),制備率增加為99.5%,再生率卻下降為1.4%。同樣,酶解15 min時(shí)20335原生質(zhì)體的制備率為97.1%,隨著酶解時(shí)間增加到75 min時(shí),制備率為99.9%,再生率卻由31.4%下降到5.2%。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果,選擇制備率與再生率乘積最大的酶處理時(shí)間為最佳的原生質(zhì)體制備時(shí)間。因此,確定W5、20335的酶解時(shí)間均以15 min為宜。

圖2 酶解時(shí)間對(duì)W5原生質(zhì)體制備率及再生率的影響Fig.2 The effect of different enzymolysis time to the protoplast preparation ratio and regeneration ratio ofW5

圖3 酶解時(shí)間對(duì)20335原生質(zhì)體制備率及再生率的影響Fig.3 The effect of different enzymolysis time to the protoplast preparation ratio and regeneration ratio of 20335

3 結(jié) 論

試驗(yàn)研究了脫壁預(yù)處理時(shí)間及酶解時(shí)間對(duì)W5、20335原生質(zhì)體制備率及再生率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),其他條件相同時(shí),經(jīng)過脫壁預(yù)處理的菌體更容易在較短的時(shí)間內(nèi)得到原生質(zhì)體,且原生質(zhì)體的得率與脫壁預(yù)處理時(shí)間有關(guān)。在一定時(shí)間范圍內(nèi),原生質(zhì)體的得率隨脫壁預(yù)處理時(shí)間的增加而上升,但達(dá)到一定制備率后,繼續(xù)延長(zhǎng)預(yù)處理時(shí)間原生質(zhì)體得率上升不明顯。綜合考慮預(yù)處理劑對(duì)原生質(zhì)體制備和再生的影響,最終確定30 min為最佳預(yù)處理時(shí)間。隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng),W5、20335原生質(zhì)體制備率呈現(xiàn)上升的趨勢(shì),再生率則呈下降趨勢(shì)。根據(jù)制備率與再生率乘積最大的原則,最終確定了W5、20335酶解處理時(shí)間均為15 min。綜上所述,最終確定W5、20335原生質(zhì)體制備的最佳條件為：選取W5、20335培養(yǎng)4～5 h及6～7 h的菌體,30℃、100 r/min預(yù)處理30 min,固體酶用量0.12 g,30℃、100 r/min酶解處理15 min,可以達(dá)到W5、20335原生質(zhì)體融合的較理想的制備率及再生率。

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