合成聚-β-羥基丁酸芽孢桿菌的篩選、鑒定及碳氮源優(yōu)化*

周 琴， 蔣冬花， 楊 葉， 嵇 豪

(浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江 金華 321004)

聚-β-羥基丁酸(PHB)是細胞內(nèi)的一類生物聚酯，其力學(xué)性質(zhì)與一些熱塑性材料如聚丙烯相似，并且可以被微生物完全降解，因而被稱之為“生物可降解塑料”，是真正的環(huán)境友好型產(chǎn)品[1-2].研究生物可降解塑料以替代化學(xué)合成塑料，可以幫助我們解決塑料污染問題，節(jié)約能源，實現(xiàn)資源與環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展[3].PHB是微生物在碳、氮等營養(yǎng)失衡的條件下合成的碳源與能源的高分子儲存物(分子量為50 000～1 000 000)[4-5].作為微生物合成的可降解材料，PHB除了具有與化學(xué)合成高分子相似的理化性質(zhì)外，還具有一般化學(xué)合成高分子所沒有的性質(zhì)，如光學(xué)活性、低透氧性、抗紫外輻射、生物可降解性、生物相容性、壓電性和抗凝血性等[6-7]，在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、環(huán)保、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域具有十分廣闊的應(yīng)用前景.如在醫(yī)療領(lǐng)域，PHB可以作為藥物基質(zhì)植入人體，以控制藥物的釋放，且最終降解產(chǎn)物為β-羥基丁酸，沒有任何毒副作用[8-9].目前,PHB生產(chǎn)菌株主要有真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌(Alcaligeneseutrophus)，肥大產(chǎn)堿桿菌(Alcaligeneslatus)，巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)，極端嗜鹽菌(Halobacterium)，等等[10].其中真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌是研究最多的PHB生產(chǎn)菌種，轉(zhuǎn)基因大腸桿菌(Escherichiacoli)將成為PHB生產(chǎn)的重要工程菌種[11].

盡管PHB具有代替石油衍生物生產(chǎn)塑料的優(yōu)勢，但是利用PHB生產(chǎn)可降解塑料的方法受到了限制，原因在于其價格昂貴[12-13].降低PHB生產(chǎn)成本的主要途徑有2條:一是通過微生物如巨大芽孢桿菌、重組大腸桿菌的菌體量的提高,以及菌體PHB含量的提高，使提取PHB的成本降低；二是通過降低培養(yǎng)基原料的成本，使PHB生產(chǎn)成本降低.不同的培養(yǎng)基會使PHB積累量不同[14]，并且PHB的合成受到了環(huán)境中C、N等的限制[15].因此,人們對這類微生物碳氮源優(yōu)化做了一系列實驗研究.一般產(chǎn)物產(chǎn)量的持續(xù)提高證明了發(fā)酵條件優(yōu)化的成功性[16].

本實驗從環(huán)境比較惡劣的污泥中篩選具有良好抗逆性的芽孢桿菌菌株，主要依據(jù)是PHB可用作碳源和能源的儲備物，并且PHB的存在可以增強細胞對逆境的抵抗力， PHB可以作為碳源被細胞利用，以防止細胞自溶和死亡[5].由于PHB存在的特殊意義，一般抗逆性較強的菌株中PHB比較容易積累，這為篩選得到高產(chǎn)PHB的菌株奠定了一定的基礎(chǔ).本實驗通過篩選菌株，得到較高產(chǎn)PHB的菌株；并且通過培養(yǎng)基碳氮源優(yōu)化，希望能使產(chǎn)PHB的菌株大量生長，PHB含量提高，同時考慮培養(yǎng)基原料成本，以降低PHB生產(chǎn)成本.

1 實驗部分

1.1 實驗材料

芽孢桿菌菌株分離篩選自浙江省各地(紹興、寧波、金華、杭州、臺州、麗水、溫州、嘉興、嵊州、義烏)采集的土壤.土壤主要來源有河底淤泥、花壇土壤、菜地土壤、排污口岸泥土等.高產(chǎn)聚-β-羥基丁酸的芽孢桿菌從金華排污口岸泥土分離得到.

1.2 主要儀器和試劑

聚-β-羥基丁酸(Sigma公司)，蘇丹黑(上海生工生物工程有限公司).LRH-280生化培養(yǎng)箱(廣東儀器設(shè)備廠)，C24KC搖床(美國New Brunswick公司)，MIKRO-22R離心機(德國Eppendorf公司)，PB-10 pH計(德國Sartorius公司)，UV-7504分光光度計(上海欣茂儀器有限公司)，電子顯微鏡(德國Leica公司).

1.3 培養(yǎng)基

1)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基[17]：牛肉膏3 g/L，蛋白胨5 g/L，NaCl 1 g/L，瓊脂20 g/L，pH 7.2～7.4.用于菌種分離.

2)種子培養(yǎng)基：牛肉膏25 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，pH 7.4.

3)發(fā)酵培養(yǎng)基[18]：蔗糖10 g/L，牛肉膏5 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，CaCl20.05 g/L，F(xiàn)eCl30.01 g/L，K2HPO40.04 g/L，KH2PO40.03 g/L，NaH2PO4·2H2O 0.05 g/L，H3BO30.005 g/L，pH 7.8.

1.4 菌株分離和培養(yǎng)方法

1.4.1 菌種分離純化和初篩

取0.2 g污泥土，加入5 mL蒸餾水，85 ℃加熱15 min，進行10-1～10-4梯度稀釋，選擇10-2濃度的溶液100 μL涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上，30 ℃培養(yǎng)24 h，出現(xiàn)圓形乳白色菌落；挑取單菌落，進一步分離、純化后，獲得純菌株.用蘇丹黑染色初步篩選產(chǎn)生PHB菌株，編號并保存.

1.4.2 種子培養(yǎng)

挑取蘇丹黑染色初篩得到的純菌株單菌落接種于150 mL錐形瓶(含30 mL種子培養(yǎng)基)中，30 ℃,200 r/min培養(yǎng)24 h，用作發(fā)酵種子.

1.4.3 發(fā)酵培養(yǎng)

將80 mL發(fā)酵培養(yǎng)基裝入250 mL錐形瓶中，按8%接種發(fā)酵種子，30 ℃,200 r/min培養(yǎng)40 h用于PHB的定量分析.

1.5 定量分析

1.5.1 PHB的初步定量

用蘇丹黑染色法[5,19].將少許細菌熱固定于載玻片上后，用3 g/L蘇丹黑乙二醇溶液染色10～15 min，二甲苯浸泡脫色，再用5 g/L番紅水溶液復(fù)染30 s.置油鏡下觀察，PHB顆粒呈藍黑色，菌體呈紅色.

1.5.2 PHB的精確定量

按Law和Slepecky法[20]對PHB進行定量分析.經(jīng)培養(yǎng)、離心獲得的菌體細胞用V(CHCl3)∶V(無水乙醇)=2∶1抽提液60 ℃抽提1 h后，用濃硫酸于100 ℃處理10 min，用紫外分光光度計在235 nm波長下測定吸光度值.

經(jīng)PHB標準品的標準曲線測定，得到標準曲線方程為

Y=0.173 4X，R2=0.998 7.

其中:Y代表吸光度;X代表PHB的質(zhì)量濃度，單位為μg/L.根據(jù)菌體中提取PHB的吸光度，計算菌體中PHB的含量.

1.5.3 菌體干質(zhì)量的測定

50 mL發(fā)酵培養(yǎng)液經(jīng)10 000 r/min離心5 min，沉淀的菌體用蒸餾水洗3遍，80 ℃烘箱烘干至恒重,之后轉(zhuǎn)化為每1 L發(fā)酵液中菌體的質(zhì)量.

1.6 菌株的鑒定

1.6.1 形態(tài)特征觀察

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上28 ℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落特征；培養(yǎng)24 h進行革蘭氏染色，觀察菌體形態(tài)及染色結(jié)果[21].

1.6.2 生理生化實驗

Methyl-Red(M. R.)實驗、Vagex-Proskauer(V. P.)實驗、淀粉水解實驗、明膠水解實驗、吲哚實驗、H2S實驗、硝酸還原實驗、卵磷脂水解實驗、碳源利用實驗和氮源利用實驗，分別參照文獻[21-22]的方法進行.

1.6.3 16S rRNA的PCR擴增、序列測定和系統(tǒng)發(fā)育分析

用UNIQ-10細菌基因組DNA抽提試劑盒提取樣品的基因組DNA.采用16S rDNA正反向通用引物[23]：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3和5-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3，用Pfu酶進行PCR擴增.PCR擴增程序為：98 ℃ 5 min，95 ℃ 35 s，55 ℃ 35 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 4 min.擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后連入克隆載體pMD18-T，由上海生物工程技術(shù)有限公司完成測序.將測得的基因序列通過Blast程序與GenBank中核酸數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)進行對比分析，并利用MEGA4以N-J法繪制系統(tǒng)發(fā)育樹.

2 結(jié) 果

2.1 產(chǎn)PHB芽孢桿菌菌株的分離、純化和篩選

通過分離、純化和初步鑒定,共獲得416株芽孢桿菌,經(jīng)蘇丹黑染色初步定量，得到產(chǎn)生PHB的量較高的48株芽孢桿菌，篩選得到的最高產(chǎn)PHB的芽孢桿菌Bm-10的蘇丹黑染色結(jié)果見圖1.將篩選出的各菌株接入發(fā)酵培養(yǎng)液中培養(yǎng)40 h后，用紫外分光光度計分析測定菌體細胞中PHB含量，每個地區(qū)取樣泥土中分離篩選得到的最高產(chǎn)PHB菌株中PHB含量的比較見圖2.從圖2可以看出，不同的芽孢桿菌菌株菌體產(chǎn)生PHB的能力有較大的差異，其中Bm-10菌株P(guān)HB產(chǎn)量最高達0.763 g/L.

圖1 芽孢桿菌Bm-10菌體的蘇丹黑染色

圖2 10株芽孢桿菌菌體中PHB含量

2.2 碳氮源對Bm-10菌株P(guān)HB產(chǎn)量的影響

2.2.1 氮源對Bm-10菌株P(guān)HB產(chǎn)量的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)液中加入不同的氮源，30 ℃搖瓶培養(yǎng)40 h，測定菌體生長量及PHB積累情況.實驗結(jié)果(見表1)表明:有機氮源有利于菌體生長，牛肉膏相對蛋白胨而言更有利于PHB的積累；一般無機氮源不利于菌體的生長，并且胞內(nèi)PHB含量相對較低，雖然硝酸鈉為氮源時菌體長勢良好，但極不利于PHB的積累.由于牛肉膏作為氮源時PHB產(chǎn)率顯著高于其他氮源，因此選擇牛肉膏作為該菌株積累PHB的氮源.

2.2.2 碳源對Bm-10菌株P(guān)HB產(chǎn)量的影響

碳源對Bm-10菌株菌體生長及PHB積累的影響見表2.由表2可見:以葡萄糖為碳源時菌體生長良好，PHB積累量相對較高;而以丁酸為碳源時，菌體生長最差，PHB積累量也較低.從表2可以看出,蔗糖也比較有利于Bm-10菌體的生長與PHB的積累，但是PHB在菌體中所占的比例較低.因此,選擇葡萄糖作為最佳碳源.

表1 氮源對Bm-10菌株菌體生長及PHB積累的影響

表2 碳源對Bm-10菌株菌體生長及PHB積累的影響

2.3 芽孢桿菌Bm-10菌株的鑒定

2.3.1 形態(tài)特征

Bm-10菌株在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)24 h后，菌落呈乳白色，表面和邊緣光滑，圓形不透明，直徑為0.2～0.4 cm(見圖3(a)).顯微鏡觀察菌體細胞呈桿狀或近橢圓形桿狀，粗大，長度為2.0～4.5 μm，寬度為1.0～1.2 μm,趨于扭曲的短鏈,周生鞭毛，具運動性(見圖3(b))，革蘭氏染色呈陽性.

2.3.2 生理生化特征

Bm-10菌株的生理生化特征和生長條件實驗結(jié)果見表3和表4.根據(jù)Bm-10菌株的表型特征、生長條件實驗和生理生化特性實驗，參考文獻[24]，初步鑒定Bm-10菌株屬于芽孢桿菌科.

2.3.3 16S rDNA基因序列

Bm-10菌株基因組DNA的提取結(jié)果見圖4(a).采用細菌的16S rDNA通用引物進行PCR擴增，獲得一長度為1 513 bp的基因(見圖4(b))，序列測定由上海生物工程技術(shù)公司完成.

基于16S rDNA 序列分析進行細菌鑒定是國際上通用的鑒定技術(shù).一般認為:16S rRNA序列同源性小于98%，可以認為種不同;同源性小于93%～95%，可以認為屬不同[25].將Bm-10菌株16S rDNA基因序列通過Blast比對分析，Bm-10菌株與巨大芽孢桿菌1431的遺傳距離最小，同源性高達99.7%.基于16S rDNA基因序列建立的芽孢桿菌屬系統(tǒng)發(fā)育樹見圖5.故將Bm-10菌株鑒定為巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium).

(a)菌落特征

(b)菌體細胞形態(tài)

表3 芽孢桿菌Bm-10菌株的生理生化特征

表4 芽孢桿菌Bm-10菌株的生長條件

圖4 Bm-10菌株電泳分析結(jié)果

3 討 論

從污泥中篩選高產(chǎn)聚-β-羥基丁酸菌株，得到了一株P(guān)HB生產(chǎn)能力較好的菌株——芽孢桿菌Bm-10.

在Bm-10菌株氮源優(yōu)化中，牛肉膏作為氮源時PHB產(chǎn)率顯著高于其他氮源，因此選擇牛肉膏作為該菌株積累PHB的氮源.牛肉膏作為有機氮源，相對無機氮源而言，含有多種營養(yǎng)成分，有利于菌體的生長及PHB的積累.碳源優(yōu)化實驗結(jié)果表明，葡萄糖是Bm-10菌株菌體生長和合成PHB的最適碳源.葡萄糖利于菌體生長和PHB積累的原因可能是葡萄糖容易被細菌利用進入TCA循環(huán)，在TCA循環(huán)中生成乙酰輔酶A，之后經(jīng)過PHB合成途徑形成PHB.

對Bm-10菌株進行了一般傳統(tǒng)方法的鑒定——形態(tài)鑒定及生理生化鑒定,并為了得到可靠的結(jié)果，對該菌株也進行了16S rDNA基因序列鑒定.經(jīng)過雙重認定，確定該菌株為巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium).

本實驗于浙江金華污泥中分離篩選出一株巨大芽孢桿菌(Bm-10菌株)，該菌的16S rRNA基因序列已登錄于Genbank，登錄號為GQ866974.該菌在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中不僅生長迅速，而且胞內(nèi)能產(chǎn)生大量的PHB聚合物顆粒，PHB的積累量占菌體干質(zhì)量的33.56%.該菌經(jīng)過培養(yǎng)基繼續(xù)優(yōu)化、上罐條件優(yōu)化，將有望進一步開發(fā)成PHB新型生產(chǎn)菌.

圖5 基于16S rDNA基因序列建立的芽孢桿菌屬系統(tǒng)發(fā)育樹

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