大豆磷脂對老齡大鼠學(xué)習(xí)記憶及抗氧化能力的影響*

徐玲玲， 張均平， 邵鄰相， 張耀斌， 畢潔瓊， 鞏菊芳

(1.浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江 金華 321004;2.浙江師范大學(xué) 行知學(xué)院，浙江 金華 321004)

大豆磷脂是從大豆(Glycinemax)中提取的一種多功能天然保健品，含有豐富的磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇和磷脂酰絲氨酸等成分，其脂肪酸組成中不飽和脂肪酸占60%，是一種理想的多功能天然原料[1].有關(guān)大豆磷脂對小鼠具有改善學(xué)習(xí)記憶能力、提高清除自由基能力和增強(qiáng)細(xì)胞膜流動性的研究報道較多[2-6],但有關(guān)大豆磷脂對老齡大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及抗氧化作用影響的報道尚少見.筆者采用老齡大鼠，研究了大豆磷脂對老齡大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及抗氧化作用的影響，為進(jìn)一步開發(fā)利用大豆磷脂作為營養(yǎng)保健品提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試劑

取一定量的大豆磷脂(購于北京華清美恒天然產(chǎn)物技術(shù)開發(fā)有限公司)，加少量蒸餾水稀釋配制成乳濁液.

1.2 實(shí)驗(yàn)動物及實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?/h3>

健康雄性SD大白鼠30只，鼠齡24個月，體質(zhì)量(754±24) g，清潔級，購于浙江省金華市實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)中心(SCXK(浙)2003-0008).用標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)5 d后，按體質(zhì)量隨機(jī)分成3組，每組10只.對照組大鼠按5 mL/kg蒸餾水灌胃；低劑量組大鼠按0.5 g/kg大豆磷脂灌胃；高劑量組大鼠按1.0 g/kg大豆磷脂灌胃.每天定時灌胃1次，連續(xù)灌胃45 d.灌胃第30天進(jìn)行開場行為和學(xué)習(xí)記憶能力的測試，第45天將大鼠脫頸處死，取所用組織，-70 ℃保存?zhèn)溆?

1.3 開場行為及學(xué)習(xí)記憶能力的測定

參照文獻(xiàn)[7]的方法測定開場行為.在安靜、干擾小的夜環(huán)境下，將老齡大鼠放入矩形開場環(huán)境中，矩形底面劃分12格，記錄老齡大鼠在3 min內(nèi)由中央格開始跑動(ambulation)穿越的格數(shù)、后腿站立(rearing)次數(shù)(包括扶壁直立次數(shù))、理毛(grooming)次數(shù),以及糞便粒數(shù)(defecation)、小便次數(shù).比較不同處理的老齡大鼠在新異環(huán)境中的自發(fā)活動、恐懼緊張度,以及在新異環(huán)境中的安逸程度.第30天用“Y”型電迷宮法[7]測大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力.固定訓(xùn)練50次，記錄正確反應(yīng)次數(shù)，作為學(xué)習(xí)能力.訓(xùn)練達(dá)標(biāo)24和48 h后進(jìn)行記憶測試,記錄20次電擊中的正確反應(yīng)次數(shù)，作為記憶能力.

1.4 抗氧化能力相關(guān)生化指標(biāo)的測定

老齡大鼠灌胃大豆磷脂45 d后，頸椎脫臼處死，迅速取出心、肝、脾、腎、海馬、骨骼肌、睪丸等，生理鹽水洗凈后取部分稱重，各取1 g組織加入5 mL蒸餾水，在冰浴環(huán)境下用勻漿器研磨至勻漿.一部分勻漿液供丙二醛(MDA)含量測定;另一部分勻漿液10 000 r/mim離心10 min，上清液用于超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)活性的測定.MDA-TBA比色法[8]測定MDA含量；鄰苯三酚自氧化法[9]測定SOD活性；過氧化氫酶活性的比色測定法[10]測定CAT活性.

1.5 統(tǒng)計方法

運(yùn)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)分析,以P<0.05為統(tǒng)計學(xué)顯著性差異，P<0.01為統(tǒng)計學(xué)極顯著性差異.

2 結(jié) 果

2.1 大豆磷脂對老齡大鼠開場行為的影響

開場行為中動物爬格子數(shù)反映其興奮性，理毛次數(shù)反映其對新環(huán)境的滿意程度，站立次數(shù)、大小便次數(shù)反映其緊張程度.表1顯示:大豆磷脂組老齡大鼠與對照組相比，自由跑動格數(shù)、理毛次數(shù)和大小便次數(shù)均無明顯差異(P>0.05)，而站立次數(shù)明顯地減少(P<0.05)，表明大豆磷脂與老齡大鼠在新環(huán)境中的興奮性及對新異環(huán)境的滿意度沒有必然的聯(lián)系，但能緩解老齡大鼠在新環(huán)境中的緊張性，增加老齡大鼠在新異環(huán)境中的安逸程度.表1數(shù)據(jù)還表明:高劑量組老齡大鼠3 min站立次數(shù)比低劑量組老齡大鼠有明顯的增加(P<0.05),說明高劑量的大豆磷脂會增加老齡大鼠在新異環(huán)境中的緊張度.

表1 大豆磷脂對老齡大鼠開場行為的影響

2.2 大豆磷脂對老齡大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

表2顯示:經(jīng)Y-迷宮分辨學(xué)習(xí)和記憶保持力檢測，大豆磷脂組老齡大鼠達(dá)到學(xué)習(xí)標(biāo)準(zhǔn)所需訓(xùn)練的次數(shù)與對照組比較均有顯著性差異(P<0.05);且24 h和48 h記憶保持率均明顯高于對照組(P<0.05).說明大豆磷脂能顯著提高老齡大鼠的學(xué)習(xí)能力和記憶能力.而低劑量組與高劑量組之間各項(xiàng)指標(biāo)比較無顯著性差異(P>0.05).

表2 大豆磷脂對老齡大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

2.3 大豆磷脂對老齡大鼠各器官中MDA含量的影響

表3顯示:與對照組相比，大豆磷脂組老齡大鼠肝、脾、腎、海馬組織中的MDA含量顯著降低(P<0.05)，心、骨骼肌和睪丸組織中的MDA含量極顯著降低(P<0.01)；高劑量組老齡大鼠肝、脾、腎、海馬、骨骼肌以及睪丸組織中的MDA含量比低劑量組有減少的趨勢.

表3 大豆磷脂對老齡大鼠各器官中MDA含量的影響

2.4 大豆磷脂對老齡大鼠各器官中SOD活性的影響

表4顯示:與對照組相比，大豆磷脂組老齡大鼠肝、脾、腎、海馬及骨骼肌組織中的SOD活性顯著提高(P<0.05)，并以睪丸組織最為明顯(P<0.01)；與低劑量組相比，高劑量組老齡大鼠肝、腎、骨骼肌及睪丸組織中的SOD活性也顯著升高(P<0.05)，且以心臟組織最為明顯(P<0.01).

2.5 大豆磷脂對老齡大鼠各器官中CAT活性的影響

表5顯示:與對照組比較，大豆磷脂組老齡大鼠心、脾、腎、海馬、骨骼肌及睪丸組織中的CAT活性顯著提高(P<0.05)；與低劑量組相比，高劑量組老齡大鼠脾、海馬組織中的CAT活性顯著性提高(P<0.05)，心、肝及睪丸組織中的CAT活性也有升高趨勢.

表4 大豆磷脂對老齡大鼠各器官中SOD活性的影響

表5 大豆磷脂對老齡大鼠各器官中CAT活性的影響

3 討 論

學(xué)習(xí)和記憶屬于腦的高級功能，是動物改變自身行為或產(chǎn)生新行為以便適應(yīng)生活環(huán)境的必要過程.學(xué)習(xí)和記憶兩者之間既相互聯(lián)系，又受到諸多因素的影響.開場行為觀察結(jié)果(見表1)表明大豆磷脂使老齡大鼠的站立次數(shù)明顯減少，說明大豆磷脂對在新環(huán)境中的老齡大鼠具有鎮(zhèn)靜作用.與對照相比，大豆磷脂還能明顯地提高老齡大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力，說明大豆磷脂具有益智作用.卵磷脂(磷脂酰膽堿)是大豆磷脂的主要成分，含有神經(jīng)傳遞物質(zhì)乙酰膽堿的前體物膽堿，膽堿在體內(nèi)生物酶的作用下與乙酰輔酶A反應(yīng)生成乙酰膽堿，乙酰膽堿是眾所周知的與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)[11-12]，這可能是大豆磷脂提高老齡大鼠學(xué)習(xí)記憶水平的原因之一.

記憶力下降及抗氧化能力下降與大腦的衰老有密切的聯(lián)系，而機(jī)體內(nèi)氧自由基是衰老和疾病發(fā)生的關(guān)鍵物質(zhì)[13].細(xì)胞氧化代謝產(chǎn)生的超氧陰離子自由基是一類高度活性的物質(zhì)，可直接或間接發(fā)揮氧化劑的作用，損傷生物膜成分或生物大分子，從而影響膜的結(jié)構(gòu)和功能.正常機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的抗氧化酶類有SOD和CAT等.SOD能通過歧化反應(yīng)清除生物細(xì)胞中的超氧自由基，生成H2O2和O2;H2O2由CAT催化生成H2O和O2，從而減少自由基蓄積導(dǎo)致的細(xì)胞毒性反應(yīng)，減少對機(jī)體的毒害，延緩機(jī)體衰老過程[14].機(jī)體老化的另一重要標(biāo)志是細(xì)胞膜老化.體內(nèi)大量的活性氧自由基若不能及時清除，還可促發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，使細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸形成過氧化脂質(zhì)，過氧化脂質(zhì)經(jīng)過氧化分解生成MDA，MDA與蛋白質(zhì)、肽類或脂類聚合、交聯(lián)形成脂褐素堆積在溶酶體中，引起細(xì)胞衰老和死亡.MDA作為脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，能間接反映體內(nèi)自由基的損害情況，在衰老人群大腦中檢測到其濃度明顯增高，說明氧化應(yīng)激與衰老具有相關(guān)性.現(xiàn)已明確許多疾病或癥狀，如腫瘤、炎癥、心腦缺血、動脈粥樣硬化等，都與自由基有關(guān)[15].

本研究小組前期的研究發(fā)現(xiàn)，大豆磷脂可以顯著增強(qiáng)小鼠的學(xué)習(xí)能力，顯著提高小鼠腦中SOD活性，極顯著降低小鼠腦內(nèi)MDA的含量[16].本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明大豆磷脂同樣能明顯降低老齡大鼠組織內(nèi)MDA含量，提高老齡大鼠組織中SOD和CAT活性，并有效提高老齡大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力.說明大豆磷脂能促進(jìn)機(jī)體內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)的產(chǎn)生，提高抗氧化酶活性，抑制MDA生成，具有明顯的抗氧化作用.提示大豆磷脂可以有效延緩機(jī)體的衰老.

[1]邵鄰相，何新霞，徐根娣，等．復(fù)合磷脂對延長壽命和改善免疫功能作用的研究[J]．營養(yǎng)學(xué)報，1996，18(4)：471-473．

[2]Hiratsuka S，Koizumi K，Ooba T，et al．Effects of dietary docosahexaenoic acid connecting phospholipids on the learning ability and fatty acid composition of the brain[J]．J Nutr Sci Vitaminol，2009，55(4)：374-380．

[3]鞏菊芳，吳小華，邵鄰相，等．大豆磷脂對小鼠學(xué)習(xí)記憶及海馬脂肪酸含量的影響[J]．營養(yǎng)學(xué)報，2007，29(6)：540-543．

[4]邵鄰相．大豆磷脂對小鼠血液成分的影響[J]．營養(yǎng)學(xué)報,2003，25(4):389-391.

[5]鞏菊芳，邵鄰相，鄭孝華，等．大豆磷脂對紅細(xì)胞膜脂類成分的影響[J]．營養(yǎng)學(xué)報，2004，27(1):72-75．

[6]Zhang Nanyan，Kitagawa K，Hattori N，et al．Soybean-derived phosphatidylinositol inhibits in vivo low concentrations of amyloid beta protein-induced degeneration of hippocampal neurons in V337M human tau-expressing mice[J]．Life Sci,2007，80(21)：1971-1976．

[7]徐曉虹，趙鐵橋．葛根素D-半乳糖誘導(dǎo)的小鼠記憶障礙的影響[J]．中國藥理學(xué)報，2002，23(7)：587-590．

[8]李儀奎．中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法[M]．上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1991:175-176．

[9]李永利，張焱．鄰苯三酚自氧化法測定SOD活性[J]．中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2000，10(6)：673．

[10]雷柏平，周伯通，蔡宏偉，等．過氧化氫酶活性的比色測定法[J]．臨床檢驗(yàn)雜志，1993，11(2)：73-74．

[11]Lim S Y，Suzuki H．Effect of dietary docosahexaenoic acid and phosphatidylcholine on maze behavior and fatty acid composition of plasma and brain lipids in mice[J]．Int J Vitam Nutr Res，2000，70(5)：251-259．

[12]St John P A.Cellular trafficking of nicotinic acetylcholine receptors[J]．Acta Pharmacol Sin，2009，30(6)：656-662．

[13]姜招峰，周翔，楊翰儀．海馬及皮層的氧自由基損傷與大鼠學(xué)習(xí)能力和記憶能力的關(guān)系[J]．中國行為醫(yī)學(xué)科學(xué)，2001，10(6)：286-288．

[14]Slemmer J E，Shacka J J，Sweeney M I，et al．Antioxidants and free radical scavengers for the treatment of stroke,traumatic brain injury and aging[J]．Curr Med Chem，2008，15(4)：404-414．

[15]Gawel S，Wardas M，Niedworok E，et al．Malondialdehyde (MDA) as a lipid peroxidation marker[J]．Wiad Lek，2004，57(9/10)：453-455．

[16]邵鄰相.大豆磷脂對小鼠學(xué)習(xí)記憶及腦內(nèi)SOD和脂褐素含量的影響[J].浙江師范大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2003,26(3):275-277;288.