Cheddar干酪附屬發(fā)酵劑篩選及其應(yīng)用

杭志奇，韓清波，許景松

（貝蘭德乳業(yè)有限公司，河北寧晉 055550）

Cheddar干酪附屬發(fā)酵劑篩選及其應(yīng)用

杭志奇，韓清波，許景松

（貝蘭德乳業(yè)有限公司，河北寧晉 055550）

為了篩選能夠促進(jìn)Cheddar干酪成熟，從泡菜、腐乳及不同產(chǎn)地的Cheddar中篩選具有高肽酶活力和自溶度的乳桿菌作為Cheddar干酪附屬發(fā)酵劑，并應(yīng)用于Cheddar干酪的制作中。結(jié)果表明，從美國Cheddar干酪中篩選出1株Lactobacillus plantarumQD具有較高的肽酶活力和自溶度，運(yùn)用于Cheddar干酪的制作中能顯著提高其游離氨基酸濃度，改善其風(fēng)味，有利于加快干酪的成熟。

干酪；附屬發(fā)酵劑；非發(fā)酵劑乳酸菌

0 引言

近年來，農(nóng)場擠奶及干酪生產(chǎn)等技術(shù)、設(shè)備的發(fā)展使得用于生產(chǎn)干酪的原料乳微生物數(shù)量非常低[1]。這對消費(fèi)者食用乳制品的安全性是有利的，但這也導(dǎo)致了一些對產(chǎn)品風(fēng)味品質(zhì)有貢獻(xiàn)作用的次生菌群的消失和數(shù)量的降低，所以干酪生產(chǎn)者和研究者開始開發(fā)附屬發(fā)酵劑。為抑制乳酸菌繼續(xù)產(chǎn)酸，在干酪凝乳過程后期進(jìn)行的熱燙處理，致使主要為嗜溫菌的主發(fā)酵劑乳酸菌的產(chǎn)酸被抑制，而主要為嗜熱菌的非發(fā)酵劑乳酸菌則不受影響，得以生長至后期成熟中起作用。因此，非發(fā)酵劑乳酸菌是干酪附屬發(fā)酵劑的研究熱點(diǎn)之一。本文從泡菜、腐乳及不同產(chǎn)地的Cheddar中篩選具有高肽酶活力和自溶度的乳桿菌，以期篩選到具Cheddar干酪附屬發(fā)酵劑潛力的菌株，并促進(jìn)Cheddar干酪的成熟。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料及設(shè)備

生鮮牛乳，全脂和脫脂乳粉，卷心菜泡菜（市售），萬方糟方腐乳，自制成熟中期及后期Cheddar干酪，美國藍(lán)多湖Cheddar干酪，金凱利愛爾蘭風(fēng)味淡Cheddar干酪。BX60型相差顯微鏡。

凝乳酶MARZYME 150，干酪主發(fā)酵劑RA070。酪素—瓊脂培養(yǎng)基（質(zhì)量濃度）：磷酸二氫鉀0.36 g/L，七水硫酸鎂0.5 g/L，氯化鋅0.014 g/L，七水磷酸氫二鈉1.07 g/L，氯化鈉0.16 g/L，氯化鈣0.002 g/L，硫酸亞鐵0.002 g/L，酪素4 g/L、胰酶0.05 g/L、瓊脂20 g/L，pH值為6.5～7.0[2]；MRS液體及固體培養(yǎng)基，ROGOSA固體培養(yǎng)基；其他為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)分析純化學(xué)試劑。

1.2 Cheddar干酪附屬發(fā)酵劑乳桿菌的初步篩選

準(zhǔn)確稱取10.0 g樣品，轉(zhuǎn)移至裝有含有玻璃珠及90.0 mL無菌水的三角瓶中，用玻璃珠將樣品打散。吸取1 mL的樣品，用PBS緩沖液進(jìn)行梯度稀釋至合適濃度，吸取0.1 mL的樣品并涂布于調(diào)整的ROGOSA瓊脂平板（3%的NaCl濃度，pH值為5.0，近似干酪成熟環(huán)境）上，30℃倒置厭氧培養(yǎng)36～72 h[3]。挑取典型菌并于MRS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線純化，鏡檢選取目的菌株并將單菌落菌株于斜面劃線保存以備后用。

1.3 Cheddar干酪附屬發(fā)酵劑乳桿菌的復(fù)篩

附屬發(fā)酵劑一般是具備高的肽酶活力[4]、高的自溶度[5,6]并能在干酪成熟環(huán)境中生長的乳桿菌，因此，選用自溶度及肽酶活力對初篩得到的乳桿菌進(jìn)行復(fù)篩。

1.3.1 總肽酶活力的測定

（1）鉻—茚三酮法測定總游離氨基酸含量：取1 g氯化鉻溶解于1 mL去離子水中，0.8 g茚三酮溶于80 mL的90%（體積比）乙醇和10 mL的冰醋酸混合液中，兩溶液混合搖勻，即得鉻—茚三酮試劑。分別取100，200，300，400，500與600 μL濃度為2.0 mmol/L的亮氨酸溶液，用蒸餾水補(bǔ)齊至1 mL，加入2 mL鉻—茚三酮試劑，84℃水浴中保溫5 min，取出室溫下保持10 min，在λ= 507nm處測定吸光度[7]。

（2）菌體總肽酶活力測定底物的制備：以質(zhì)量濃度為10 g/L酪蛋白溶解于濃度為0.05 mol/L的檸檬酸鈉溶液中（pH值為5.4凝乳酶最適pH值，含質(zhì)量濃度2 g/L的疊氮鈉）中，85℃下加熱10 min，水浴中冷卻至30℃，以質(zhì)量濃度120 g/100L的量加入凝乳酶（凝乳酶加入前以pH值為5.4，濃度為0.05 mol/L檸檬酸鈉溶液稀釋20倍），30℃條件下酶解解24 h，再熱處理（85℃，10 min）使凝乳酶失活。用pH值為7.0、濃度為0.05 mol/L的檸檬酸鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為6.0，所得溶液通過0.2 μm的膜過濾，濾液即為總肽酶活力測定的反應(yīng)底物，-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆肹8]。

（3）菌體無細(xì)胞提取液的制備：將1.3初步篩選得到的菌株接入MRS培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)24h，連續(xù)活化2代，以體積分?jǐn)?shù)為2%的接種量接入三角燒瓶中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，待增殖至對數(shù)生長期時(shí)，將菌體培養(yǎng)液于4℃下5 000 g冷凍離心15 min收集菌體。將菌體重新懸浮于濃度0.05 mol/L pH值為7.0的磷酸緩沖液中，在冰浴中用超聲波破碎菌體。然后4℃下20000g冷凍離心10 min收集上清液，即為菌體無細(xì)胞提取液（CFE），-20℃下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

（4）菌體無細(xì)胞提取液總肽酶活力的測定：將一定量的菌體培養(yǎng)液接種于500 μL的底物中，在30℃下培養(yǎng)48 h，測定溶液中總游離氨基酸的濃度。由于鉻—茚三酮只與游離氨基酸反應(yīng)顯色，而不與肽反應(yīng)，所以通過這種方法測定溶液中總游離氨基酸的濃度，并依此評(píng)價(jià)各菌株總肽酶活力的高低[9]。

1.3.2 乳酸菌自溶度的測定

當(dāng)乳酸菌的菌體細(xì)胞發(fā)生自溶時(shí)，自溶酶裂解細(xì)胞壁從而造成原生質(zhì)體溶解，因此，導(dǎo)致菌體懸濁液在可見光范圍內(nèi)的吸光值下降[10]。根據(jù)此原理，將1.3初步篩選得到的菌株接入MRS培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)24 h，連續(xù)活化2代，以體積分?jǐn)?shù)為2%的接種量接入液體MRS中進(jìn)行增殖培養(yǎng)18 h，將菌體培養(yǎng)液于4℃下5 000 g離心15 min收集菌體，將離心所得到的菌體用濃度為0.1 mol/L（pH值為5.4）的PBS緩沖溶液（含質(zhì)量濃度15 g/L的NaCl）洗滌2次，最后懸浮于相同的PBS溶液中并調(diào)整初始A645nm為0.8～1.0。將帶菌體的緩沖液置于30℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每隔一定時(shí)間測定菌液在645 nm處吸光值的變化。自溶度的計(jì)算公式為[11]

自溶度=（1—At/A0）×100%，

式中：At為菌體不同培養(yǎng)時(shí)間時(shí)的吸光值；A0為起始菌體懸浮液吸光值。

1.4 篩選菌株的特征和鑒定

將篩選得到的菌株進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢；采用體積分?jǐn)?shù)為3%的H2O2進(jìn)行過氧化氫酶試驗(yàn)；采用API 50 CH試劑盒試劑中API 50 CHL培養(yǎng)基進(jìn)行49種碳水化合物的發(fā)酵試驗(yàn)。

1.5 篩選菌株的制作Cheddar干酪的應(yīng)用

以干酪主發(fā)酵劑RA070制作的Cheddar干酪作為空白對照，用篩選出的最佳菌株作為干酪附屬發(fā)酵劑來制作Cheddar干酪，并測定其對干酪的生產(chǎn)過程中的產(chǎn)酸速率、成熟期游離氨基酸濃度和感官的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 附屬發(fā)酵劑的初篩

泡菜汁、腐乳汁、MG公司自制的成熟中期與后期的Cheddar干酪、美國和愛爾蘭進(jìn)口的Cheddar干酪及新鮮牛乳樣品按方法1.3進(jìn)行乳桿菌的分離及純化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所有樣品中均存在能夠于ROGOSA上生長的微生物，并從中挑選出典型菌落。典型菌落共計(jì)35個(gè)，其中，泡菜汁來源的有12株，編號(hào)為PC1～PC12；腐乳汁來源的有3株，編號(hào)為FR1～FR3；由MG公司提供的成熟中期的Cheddar干酪中分離到1株，編號(hào)為QD1；由MG公司提供的成熟后期的Cheddar干酪中分離到4株，編號(hào)為QD2～QD5；從美國Cheddar干酪中分離到5株，編號(hào)為QD6～QD10；由愛爾蘭Cheddar干酪中分離到6株，編號(hào)為QD11～QD16；由生鮮牛乳中分離到4株，編號(hào)為SR1～SR4。

無菌操作，挑取單個(gè)菌落，進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢觀察菌體形態(tài)是否單一，并選取G+無芽孢桿菌為目的菌株。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，G+桿菌共27株，分別為PC1～PC12，QD1，QD3～QD10，QD12，QD14，QD15，SR1，SR2，SR4。腐乳汁中的微生物于ROGOSA平板上僅形成3個(gè)菌落，其菌落形態(tài)較其他來源亦有顯著差異，經(jīng)鏡檢確定為霉菌，因此，腐乳汁中乳桿菌不是優(yōu)勢菌種，生長受抑制，數(shù)量極少。

2.2 附屬發(fā)酵劑的復(fù)篩

2.2.1 總游離氨基酸含量的測定

采用鉻—茚三酮試劑法測定不同亮氨酸濃度溶液在507nm的吸光度，并以亮氨酸濃度為橫坐標(biāo)，507nm處的吸光度為縱坐標(biāo)作圖，數(shù)據(jù)點(diǎn)經(jīng)線性擬合得到亮氨酸濃度—A507nm的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。

由圖1可以看出，亮氨酸溶液的A507nm與其濃度呈正相關(guān)的關(guān)系，擬合得到的2者關(guān)系曲線為y= 0.6452x－0.9951，R2=0.9952。

2.2.2 總肽酶活力的測定

將MRS培養(yǎng)好的菌株，離心收集菌體并用滅菌的PBS調(diào)整其菌體濃度約為108mL-1，并按1.3.1（3）中方法制備菌體無細(xì)胞提取液，分別取500 μL的CFE接種于按1.3.1（2）制備的500 μL總肽酶活力測定的反應(yīng)底物的底物中。以蒸餾水作空白進(jìn)行調(diào)零，分別測定各溶液的A507nm，并依此評(píng)價(jià)各菌株總肽酶活力的高低，結(jié)果如表1所示。

表1 不同菌株菌體無細(xì)胞抽提液總肽酶活力（以Leu計(jì)）

由表1可以看出，接種無細(xì)胞提取液的酪蛋白水解液都有一定的A507nm，就說明了這27株菌都有一定的肽酶活力，其中的PC1～PC8，PC10，PC12，QD1，QD4，QD5，QD8，QD9，QD10，QD12，QD14及SR4顯示出了較低的肽酶活力；選擇肽酶活力較高的PC9，PC11，QD3，QD6，QD7，QD15，SR1及SR2以自溶度為指標(biāo)進(jìn)行進(jìn)一步篩選。

由圖2可以看出，各菌株在30℃條件下用濃度為0.1 mol/L（pH值為5.4）的磷酸氫鈉緩沖溶液中的自溶度進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，PC9，PC11，QD3，QD6，QD7，QD15，SR1及SR2中的QD6和QD7具有較高的自溶度，且QD7略高于QD6。而QD6的肽酶活力比QD7高，因此最終確定QD6為具Cheddar干酪附屬發(fā)酵劑潛力的理想菌株。

2.3 菌種鑒定

對菌株QD6進(jìn)行革蘭氏染色并鏡檢，確定其為典型的G+桿菌；過氧化氫酶反應(yīng)結(jié)果為陰性。

采用法國梅里埃（bioMérieux）公司的API 50 CHL試劑盒，對QD6進(jìn)行49種碳水化合物的發(fā)酵試驗(yàn)，37℃培養(yǎng)48 h。將QD6利用碳水化合物的情況（數(shù)據(jù)未給出）輸入梅里埃（bioMérieux）公司的細(xì)菌鑒定系統(tǒng)，經(jīng)數(shù)據(jù)庫查詢核對，得出鑒定結(jié)果：菌株QD6為乳酸菌屬植物乳桿菌Ⅱ型（Lactobacillus plantarumⅡ）。因此，將該菌株命名為Lactobacillus plantarumQD。

2.4 L.plantarum QD對干酪成熟的影響

將L.plantarumQD作為附屬發(fā)酵劑，RA070作為主發(fā)酵劑，接種于巴氏滅菌牛乳中，制成干酪凝塊，并以只添加RA070制作的干酪凝塊作空白對照，比較L. plantarumQD對干酪成熟的影響，2者的原料如表2所示。L.plantarumQD對干酪生產(chǎn)工藝參數(shù)的影響如表3所示。

表2 干酪生產(chǎn)原料

表3 干酪生產(chǎn)工藝參數(shù)對照

由表3可以看出，添加了L.plantarumQD的干酪與空白對照干酪相比，沒有影響干酪生產(chǎn)過程中的產(chǎn)酸速率，對干酪的生產(chǎn)工藝也沒有影響。因此，其在干酪的實(shí)際加工生產(chǎn)過程中初步應(yīng)用的效果良好。

將制成的2塊干酪置于13℃成熟間靜置成熟，分別于7，14及21 d定期取其少量樣品，用無菌水稀釋10倍后，以鉻-茚三酮試劑法測其游離氨基酸生成量，結(jié)果如表4所示。

由表4可以看出，干酪凝塊在13℃成熟了21 d后，接種了L.plantarumQD作附屬發(fā)酵劑的干酪凝塊中游離氨基酸濃度（以Leu計(jì)）對照組干酪凝塊多了4.12mmol/L，且風(fēng)味較對照組好。這表明了L.plantarumQD在干酪實(shí)際應(yīng)用中的成熟階段也顯示出了較高的肽酶活力，有利于加快干酪的成熟。

表4 L.plantarum QD對干酪氨基酸生成量的影響

3 結(jié)論

以高肽酶活力及自溶度為指標(biāo)，從泡菜、腐乳及不同產(chǎn)地的Cheddar中篩選能夠促進(jìn)其成熟的乳桿菌作附屬發(fā)酵劑。從美國Cheddar干酪中篩選出1株L. plantarumQD具有較高的肽酶活力與自溶度，將其以附屬發(fā)酵劑添加至Cheddar干酪的制作中，其對主發(fā)酵劑RA070的產(chǎn)酸凝乳過程沒有顯著影響，但在3周的成熟過程中能顯著增加干酪中的游離氨基酸濃度，并增強(qiáng)其風(fēng)味。因此，L.plantarumQD是1株具Cheddar干酪附屬發(fā)酵劑潛力的菌株，但須對其安全性作進(jìn)一步評(píng)價(jià)。

[1]杭鋒,鄭小平,趙建,等.促干酪成熟附屬發(fā)酵劑的研究進(jìn)展[J].中國乳品工業(yè),2008,36(2):45-49.

[2]常維山,張春陽,牛鐘相,等.產(chǎn)蛋白酶枯草芽胞桿菌益生菌種的篩選與應(yīng)用[J].中國畜牧雜志,2003,39(3):10-11.

[3]趙玲艷,鄧放明,楊撫林,等.自然發(fā)酵辣椒中乳酸菌的分離及其發(fā)酵性能研究[J].食品科學(xué),2005,26(10):82～86.

[4]SODA M E,MADKOR S A,TONG P S.Evaluation of Commercial Adjuncts for Use in Cheese Ripening:Comparison between Attenuated and Not Attenuated Lactobacilli[J].Milchwissenschaft,2000,55:260-263.

[5]KAWABATA S,VASSAL L,BARS D L,et al.Phage-induced Lysis of Lactococcus lactis during Saint-Paulin Cheese Ripening and Its Impact on Proteolysis[J].Lait,1997,77:229-239.

[6]LEPEUPLE A S,VASSAL L,CESSELIN B,et al.Involvement of a Prophage in the Lysis of Lactococcus lactis ssp.Cremoris AM2 during Cheese Ripening[J].International Dairy Journal,1998,8(7):667-674.

[7]FOLKERTSMA B,FOX P F.Use of the QD-ninhydrin Reagent to Assess Proteolysis in Cheese during Ripening[J].Journal of Dairy Research，1992,59:217-224.

[8]KUCHROO C N,FOX P F.Soluble Nitrogen in Cheddar Cheese: Comparison of Extraction Procedures[J].Milchwissenschaft，1982,37(6): 331-335.

[9]BOUTROU R,GRIPON J C,SEPULCHRE A,et al.Simple Tests for Predicting the Lytic Behavior and Proteo-lytic Activity of Lactococcal Strains in Cheese[J].Dairy Sci，1998,81(9):2321-2338.

[10]馮鎮(zhèn).乳酸菌自溶影響因素及機(jī)理研究[D].哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué), 2004.

[11]馮鎮(zhèn),張?zhí)m威,姚偉.培養(yǎng)時(shí)間對乳酸菌自溶影響及菌體形態(tài)學(xué)變化[J].中國乳品工業(yè)，2006,34(7):28-30.

Screening and application of adjunct culture for cheddar cheese

HANG Zhi-qi,HAN Qing-bo,XU Jing-song
(Heibei Beilande Dairy Co.,Ltd Ninjin 055550,China)

Lactobacilliwith high peptidase activities and autolysis rates were screened from pickle,fermented beancurd and different cheddar cheese as adjunct culture,in order to accelerate the ripening the cheddar cheese.The results showed that the peptidase activitiy and autolysis rate ofLactobacillus plantarumQD from American cheddar cheese were both higher than other screened Lactobacilli.The amount of free amino acid and sensor of cheddar cheese addedLactobacillus plantarumQD as adjunct culture were higher and better than the control,respectively.Therefore,Lactobacillus plantarumQD was useful for accelerating the ripening the cheddar cheese.

cheese,adjunct culture,NSLAB

TS252.53

A

1001-2230（2010）04-0013-04

2010-01-18

杭志奇（1956-），男，總工程師，研究方向?yàn)槿槠芳庸ぜ夹g(shù)。