乳源糖巨肽對(duì)小鼠IFN-γ和IL-4的調(diào)節(jié)作用

賈玉臣，陳慶森

（天津商業(yè)大學(xué) 生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134）

乳源糖巨肽對(duì)小鼠IFN-γ和IL-4的調(diào)節(jié)作用

賈玉臣，陳慶森

（天津商業(yè)大學(xué) 生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134）

研究了乳源糖巨肽（GMP）對(duì)健康Balb/c小鼠IFN-γ和IL-4的調(diào)節(jié)作用，從細(xì)胞因子的角度探討了GMP維系機(jī)體健康的機(jī)制。對(duì)健康小鼠用GMP灌胃后，分別檢測(cè)一次灌胃GMP后12 h內(nèi)小鼠IFN-γ，IL-4每2 h的表達(dá)量的變化和連續(xù)5 d灌胃GMP對(duì)小鼠IFN-γ、IL-4的表達(dá)量，及IFN-γ/IL-4濃度比值的變化。結(jié)果表明，一次灌胃GMP短時(shí)間（12 h）內(nèi)可促進(jìn)小鼠IL-4的表達(dá)，以灌胃后第6h的增加最為顯著，但對(duì)炎癥細(xì)胞因子IFN-γ沒有顯著性影響；連續(xù)5 d灌胃GMP可促進(jìn)小鼠IL-4的表達(dá)，其中第3天和第4天的變化呈顯著性，對(duì)IFN-γ同樣無顯著性影響，因此第3天至第5天GMP組小鼠中的IFN-γ/IL-4的比其他兩組顯著降低。本研究提示了GMP具有調(diào)節(jié)Th1/Th2失衡的功能。

乳源糖巨肽；GMP；Th細(xì)胞；細(xì)胞因子

0 引 言

1986年，Mosmann等[1]首先將CD4+T細(xì)胞分為Th1和Th2兩個(gè)亞群。Th1細(xì)胞主要分泌IL-2、IFN-γ，而Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10和IL-13等細(xì)胞因子[2]。Th1/Th2平衡因與機(jī)體的多種免疫性疾病密切相關(guān)而影響著機(jī)體健康。Delfour等[3]于1965年在乳κ-酪蛋白中發(fā)現(xiàn)了含有唾液酸的多肽。牛乳中的κ-酪蛋白在凝乳酶作用下分解為兩部分：不溶性的副酪蛋白和可溶性的酪蛋白巨肽（Caseinomacropeptide,CMP）。GMP有諸多生物活性，比如抗微生物毒素[4]、促益生菌增殖[5]以及免疫調(diào)節(jié)[6]等活性，目前已有許多研究陸續(xù)地對(duì)GMP的免疫調(diào)節(jié)作用進(jìn)行了初步探索[7]。本實(shí)驗(yàn)分別研究探討了一次灌胃GMP后短時(shí)間（12 h）內(nèi)小鼠IFN-γ、IL-4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化和連續(xù)5 d灌胃GMP對(duì)小鼠IFN-γ、IL-4的含量及IFN-γ/IL-4比值的變化，從而探討GMP維系Th1/Th2平衡的功能。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Balb/c小鼠 （SPF級(jí)，雄性，體質(zhì)量（25±2）g）、小鼠常規(guī)飼料。

1.1.2 試劑及試劑盒

GMP（純度為70%，其中唾液酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%以上），IFN-γ ELISA試劑盒，IL-4 ELISA試劑盒，其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 儀器

酶標(biāo)儀，恒溫培養(yǎng)箱，高速冷凍離心機(jī)，超低溫冰箱。

1.2 方法

1.2.1 GMP溶液的配制

準(zhǔn)確稱取0.500 g GMP溶于80 mL無菌水中，定容至100 mL，得到5 g/L的GMP溶液。每天于灌胃前新鮮配制。

1.2.2 GMP灌胃劑量的選擇

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室的前期研究，最終選擇給與小鼠的灌胃劑量為50 mg/kg。

1.2.3 一次灌胃后小鼠外周血清變化

（1）動(dòng)物分組。Balb/c小鼠54只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為3組，每組18只，（空白對(duì)照組、生理鹽水組和GMP組），空白對(duì)照組僅給與普通鼠食，生理鹽水組灌胃0.2 mL，GMP組灌胃劑量為50 mg/（kg·d）的GMP溶液。

（2）獲取血清樣本。將新鮮配制的GMP溶液按照50 mg/kg的劑量灌胃小鼠，分別于灌胃后第2，4，6，8，10和12 h進(jìn)行眼眶靜脈叢取血1 mL，每次處理3只小鼠，所得血液4℃靜置過夜后，1 000 g離心15 min，得到血清，待測(cè)。

（3）IL-4和IFN-γ質(zhì)量濃度測(cè)定。利用用酶聯(lián)免疫雙抗體夾心法測(cè)定IL-4和IFN-γ的質(zhì)量濃度，具體操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.4 對(duì)小鼠連續(xù)5 d灌胃（GMP）變化情況

1.2.4.1 動(dòng)物分組

Balb/c小鼠63只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為3組，每組21只 （空白對(duì)照組、生理鹽水組和GMP組），空白對(duì)照組僅給與普通鼠食，生理鹽水組灌胃0.2 mL，GMP組灌胃劑量為50 mg/（kg·d） 的GMP溶液。

1.2.4.2 樣本獲取

將新鮮配制的GMP溶液灌胃小鼠，記為第1 d，于灌胃后分別拉頸處死每組中的3只小鼠，將其四肢和尾部固定在解剖臺(tái)上,打開腹腔沿胃部幽門向下找出全腸，將其置于事先消毒的潔凈載玻片上，在距幽門4 cm處取小腸約3 cm縱向剖開后用無菌PBS緩沖液將殘?jiān)?，?zhǔn)確稱取0.2 g于組織勻漿器中，再加入PBS緩沖液，將組織破碎，得到20%的組織勻漿，立即在Sigma離心機(jī)中4℃，5 000 g離心10 min，取上清液于-70℃冰箱中凍存。

連續(xù)灌胃5 d，每天處理同上，得到腸段組織勻漿上清液，凍存待測(cè)。

完成5 d灌胃后，改為正常鼠食飼喂至第6和7天，每天分別處死各組3只小鼠，上述同樣方法得到腸段組織勻漿上清液，凍存于-70℃超低溫冰箱中，待測(cè)。1.2.4.3IL-4、IFN-γ質(zhì)量濃度測(cè)定

利用用酶聯(lián)免疫雙抗體夾心法測(cè)定IL-4和IFN-γ的質(zhì)量濃度，具體操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件，進(jìn)行單因素方差分析，處理結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±S）。

2 結(jié)果與分析

2.1 一次灌胃后血清中IFN-γ質(zhì)量濃度變化

細(xì)胞因子的合成與分泌是一個(gè)短促的、自我限量的過程，本研究檢測(cè)了GMP刺激后短時(shí)間（12 h）內(nèi)小鼠外周血清中IFN-γ的質(zhì)量濃度變化，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可以看出，在一次灌胃GMP的12 h內(nèi)，3組小鼠外周血中IFN-γ質(zhì)量濃度沒有明顯的變化規(guī)律，基本處于 （18.40±4.82）ng/L至 （35.23±12.47）ng/L之間，并且在每個(gè)實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)上組與組之間的差異均不顯著（P﹥0.05）。

2.2 一次灌胃GMP后血清中IL-4質(zhì)量濃度變化

同樣地，本研究對(duì)一次灌胃GMP后短時(shí)間（12 h）內(nèi)小鼠外周血清中IL-4的質(zhì)量濃度變化如圖2所示。

由圖2可以看出，在一次灌胃GMP后的12 h里，GMP組外周血中IL-4的濃度與空白對(duì)照組和生理鹽水組相比，呈整體增加的趨勢(shì)。在灌胃后最初的4 h，GMP組與空白對(duì)照組以及生理鹽水組IL-4質(zhì)量濃度之間的差異不顯著；在灌胃6 h后，IL-4的質(zhì)量濃度增高至（6.01±0.73）ng/L，與空白對(duì)照組和生理鹽水組均表現(xiàn)出顯著性差異（P﹤0.05）。8 h后，GMP組與其他兩組IL-4濃度均保持在一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的水平上，接近3.0 ng/L，但GMP組均高于空白對(duì)照組和生理鹽水組。

2.3 IFN-γ的質(zhì)量濃度變化

連續(xù)5 d灌胃GMP后，小鼠小腸組織中IFN-γ的質(zhì)量濃度變化如圖3所示。

由圖3可以看出丑，實(shí)驗(yàn)7 d內(nèi)空白對(duì)照組與生理鹽水組小鼠腸黏膜中的IFN-γ質(zhì)量濃度基本處于（404.7±72.4）ng/L至 （606.5±165.7）ng/L這一平穩(wěn)的范圍，連續(xù)灌胃GMP對(duì)GMP組小鼠腸黏膜中的IFN-γ無顯著影響（P＞0.05）。

2.4 IL-4的質(zhì)量濃度變化

連續(xù)5 d灌胃GMP后，小鼠小腸組織中IL-4的質(zhì)量濃度變化如圖4所示。

由圖4可以看出，7 d內(nèi)空白對(duì)照組與生理鹽水組小鼠腸黏膜中的IL-4質(zhì)量濃度基本處于一個(gè)相對(duì)平穩(wěn)的狀態(tài)，連續(xù)5 d給小鼠灌胃GMP期間 ，GMP組小鼠腸黏膜中IL-4的質(zhì)量濃度從灌胃第1天開始呈現(xiàn)增高趨勢(shì)，在第4天出現(xiàn)最高峰，并在第3天和第4天時(shí)與其他兩組呈顯著性差異（P＜0.05），分別高達(dá)（248.1±28.0）ng/L和（363.8±28.6）ng/L，第5天與其他兩組無顯著性差異（P＞0.05）。同時(shí)，停止灌胃GMP后的第5天和第6天，GMP組小鼠腸黏膜中的IL-4的質(zhì)量濃度與空白對(duì)照組與生理鹽水組均無顯著性差異（P＞0.05）。

2.5 IFN-γ/IL-4比值的變化

IFN-γ/IL-4的比值可在一定程度上反應(yīng)Th1/Th2平衡的變化，本研究在連續(xù)5 d灌胃GMP后，小鼠小腸組織中IFN-γ/IL-4比值的變化結(jié)果如圖5所示。

由圖5可以看出，7 d內(nèi)空白對(duì)照組與生理鹽水組小鼠腸黏膜中的IFN-γ/IL-4的比值基本處于一個(gè)相對(duì)平穩(wěn)的狀態(tài)，連續(xù)5 d給小鼠灌胃GMP期間 ，第4天至第5天GMP組小鼠腸黏膜中的IFN-γ/IL-4比值分別為（1.52±0.39）和（1.86±0.69），比其他兩組顯著降低（P＜0.05）。停止灌胃GMP后，GMP組小鼠結(jié)腸中IFN-γ/IL-4的比值其他兩組無顯著性差異（P＞0.05）。

3 討 論

乳源GMP是一種非常重要的乳源生物活性肽，本研究工作圍繞GMP的分離純化以及后續(xù)的生物學(xué)活性評(píng)價(jià)，已經(jīng)取得了一些成果[8-10]。目前人們已經(jīng)從不同的角度來探討GMP對(duì)機(jī)體健康的促進(jìn)作用[11，12]，但極少有研究對(duì)作用機(jī)制進(jìn)行有力的論證與探討。食品不僅為生命活動(dòng)提供營養(yǎng)和能量，更重要的是食品可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)來調(diào)節(jié)免疫網(wǎng)絡(luò)、信息傳遞網(wǎng)絡(luò)和代謝網(wǎng)絡(luò)，從而控制著機(jī)體的健康和生命活動(dòng)[13，14]。當(dāng)體內(nèi)處于靜息狀態(tài)時(shí)，大多數(shù)T細(xì)胞在機(jī)體中處于非激活狀態(tài)，并不會(huì)產(chǎn)生一定量的細(xì)胞因子。但是它一旦受到外界刺激，初始T細(xì)胞就會(huì)按照不同的比例分化為Th1或Th2細(xì)胞，進(jìn)而向兩大趨向分泌不同類的細(xì)胞因子，從而對(duì)免疫系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)節(jié)。Th1細(xì)胞或Th2細(xì)胞在不同條件下可能只是隨機(jī)表達(dá)幾種特定類型細(xì)胞因子中的一部分，如Th1分泌IFN-γ，而Th2就會(huì)分泌IL-4。 本文已成功地利用流式細(xì)胞術(shù)研究了GMP刺激對(duì)小鼠腸黏膜CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量的影響，證實(shí)了GMP可促進(jìn)小鼠腸黏膜CD4+T淋巴細(xì)胞的增殖[11]。大量的研究表明由于目前尚無很好的區(qū)分Th1和Th2細(xì)胞亞群的表面標(biāo)志物，因此只能根據(jù)細(xì)胞亞群分泌特征性細(xì)胞因子的不同來間接檢測(cè)Th1/Th2平衡[15]，已經(jīng)有研究利用IFN-γ/IL-4比值的變化來反應(yīng)Th1/Th2平衡的變化[16,17]。本研究結(jié)果表明，灌胃小鼠GMP 12 h內(nèi)IL-4會(huì)出現(xiàn)明顯的增高趨勢(shì)，并在灌胃后第6 h與對(duì)照組呈現(xiàn)顯著性差異，而在實(shí)驗(yàn)期間IFN-γ并未呈現(xiàn)明顯的變化趨勢(shì)；在連續(xù)5 d灌胃GMP的實(shí)驗(yàn)期間，GMP組小鼠在灌胃后第2天至第5天腸黏膜的IL-4質(zhì)量濃度明顯高于對(duì)照組和空白對(duì)照組，而IFN-γ在實(shí)驗(yàn)期間也未表現(xiàn)出明顯的變化趨勢(shì)，從而使得在連續(xù)灌胃后的第2天至第5天GMP組的IFN-γ/IL-4比值較空白對(duì)照組與生理鹽水組均低，提示GMP可能具有下調(diào)Th1/Th2的潛在功效?？傊珿MP對(duì)IFN-γ的影響是不顯著的，該結(jié)論與Requena等[18]近期的研究成果是一致的，更重要的是得到的GMP可促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子IL-4表達(dá)的結(jié)論為進(jìn)一步研究GMP在腸道內(nèi)的抗炎機(jī)制提供了佐證。細(xì)胞因子在外界刺激的作用下變化非常迅速，而Th細(xì)胞的分化則需要幾天時(shí)間[19]。由此推斷GMP可能對(duì)Th細(xì)胞的分化具有一定的調(diào)節(jié)作用。

在不同的免疫應(yīng)答和免疫性疾病中Th1和Th2的比例是不同的，而且正是這種比例的變化本身會(huì)引起相應(yīng)的疾病，因此Th1和Th2平衡概念的提出就可以為一些疾病的診治提供一定的途徑。近些年的報(bào)道已經(jīng)表明，炎癥細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子的研究將大大推動(dòng)了炎癥性腸病 （Inflammatory Bowel Disease,IBD），尤其是潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative Colitis,UC）發(fā)病機(jī)制的研究，有關(guān)IBD的發(fā)病機(jī)制現(xiàn)已從細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子、腸道菌群等方面得以闡釋。余萬桂等[20]人已證實(shí)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠外周血中的IL-4較正常組顯著降低，表明調(diào)控Th1和Th2平衡對(duì)解決相關(guān)炎癥性疾病的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)論對(duì)乳源生物活性肽與機(jī)體健康關(guān)系的研究與開發(fā)具有重要的價(jià)值，為GMP的通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)來調(diào)節(jié)免疫網(wǎng)絡(luò)、信息傳遞的機(jī)制和代謝網(wǎng)絡(luò)等的深入研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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Regulation of bovine glycomacropeptide on IFN-γ and IL-4 cytokines of mice

JIA Yu-chen,CHEN Qing-sen
（College of Biotechnology and Food Science,Tianjin University of Commerce,Tianjin 300134,China）

To explore the regulation of glycomacropeptide（GMP）on Th cytokines of mice and the mechanism of health maintenance by GMP.Methods：IFN-γ and IL-4 are important cytokines respectively secreted by Th1 and Th2 cells.Mice

GMP by oral gavage at the dose of 50 mg/kg（bw）d,then IFN-γ and IL-4 content in peripheral serum were assayed every 2 hours after the administration for 12 hours.In the following experiment,IFN-γ,IL-4 content and IFN-γ/IL-4 in gut mucosa were assayed every 1 d after continuous administration for 5 d.Results：IL-4 content in peripheral serum was up-regulated by GMP administration in 12 hours,and IL-4 content varied significantly at 6th hour,whereas IFN-γ content didn’t.Similarly,continuous administration of GMP for 5 d could up-regulate IL-4 content in gut mucosa with significant variation at 3th and 4th day,compared with IFN-γ which was not affected,therefore the ratio of IFN-γ/IL-4 were lower significantly from 3th to 5th day.It was suggested that GMP could regulate Th1/Th2 imbalance.

bovine glycomacropeptide,GMP,Th,cytokine

Q93-33

A

1001-2230（2010）11-0011-04

2010-08-30

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30771524）。

賈玉臣（1985-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)榘l(fā)酵生物技術(shù)、乳品質(zhì)量與安全。

陳慶森