胃癌患者化療藥物體外敏感性的相關(guān)性研究*

趙法之，肖碩萌，趙 平，丁 志，周 祥，唐令超，陳小東,2△

(1.四川省腫瘤醫(yī)院胃腸外科中心，成都 610041；2.電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，成都 610054)

胃癌是我國最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤類型，據(jù)2017年發(fā)布的中國胃癌流行病學(xué)資料顯示，我國胃癌的發(fā)病率為31.28/10萬，病死率為22.04/10萬[1]。我國的胃癌患者早期診斷率低，就診時多數(shù)已屬進展期，這部分患者除手術(shù)切除外通常需要進行圍術(shù)期化療。有研究顯示，根治性手術(shù)術(shù)后開展化療較單獨手術(shù)治療，患者的總生存期及無病生存期延長，治愈率提高[2]。然而術(shù)后輔助化療對患者生存期的延長有限，晚期胃癌對化療藥物的反應(yīng)率不超過50%[3]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)胸苷酸合成酶(thymidylate synthase，TYMS)、切除修復(fù)交叉互補基因1(excision repair cross complementation group 1,ERCC1)、乳腺癌易感基因1(breast cancer susceptibility gene 1,BRCA1)及3型β微管蛋白(β-tubulin-Ⅲ,TUBB3)等與特定化療藥物反應(yīng)性有關(guān)[4-7]。因此本研究收集胃癌切除手術(shù)患者資料，探究胃癌患者臨床病理特征、化療相關(guān)基因表達水平與化療藥物敏感性的相互關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年1月至2016年2月四川省腫瘤醫(yī)院胃腸外科行根治性胃癌切除手術(shù)患者。納入標準：(1)所有患者術(shù)前均行胃鏡檢查并取鏡下病理活檢查見腫瘤；(2)無腫瘤遠處轉(zhuǎn)移。排除標準：術(shù)前或術(shù)中評估腫瘤無法切除，包括已發(fā)生腸系膜根部、腹腔干等大血管侵犯、腹主動脈旁第16組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腹膜種植或遠處轉(zhuǎn)移。共納入127例胃癌患者，其中男95例，女32例，平均年齡(58.0±10.7)歲，中位年齡60歲?；颊呷朐簳r美國東部腫瘤協(xié)作組(ECOG)評分小于或等于2分，患者提供的主觀整體營養(yǎng)狀況量表(PG-SGA)評分小于或等于3分。腫瘤病理資料：腫瘤平均徑線為(5.7±3.2)cm，中位徑線為5.0 cm，胃下部腫瘤(胃竇為主)65例(51.2 %)。大體病理Bormann分型以Ⅱ、Ⅲ型最多。按美國癌癥聯(lián)合委員會(AJCC)分期(第7版)標準進行 TNM分期，Ⅰ期患者8例，Ⅱ期患者23例，Ⅲ期患者86例，Ⅳ期患者10例。組織病理類型15例為印戒細胞癌，其余為腺癌，腺癌中67例為低分化。腫瘤組織Her-2檢測結(jié)果陽性患者占比46.9%。

1.2方法

1.2.1腫瘤相關(guān)基因mRNA檢測 采用分支DNA液相芯片技術(shù)(益善生物技術(shù)股份有限公司)定量檢測目的mRNA表達，包括TYMS、ERCC1、BRCA1、TUBB3共4項。主要操作流程為：(1)取腫瘤組織石蠟切片加入裂解液，56 ℃下裂解反應(yīng)2 h，檢測裂解液中總mRNA純度。(2)將標本裂解液轉(zhuǎn)移至孵育板上，加入支持探針-微球、支持延伸探針、緩沖液，孵育過夜，次日吸取棄去上清液并加入洗滌液，震蕩洗滌 1 min后吸取棄去上清液，該步驟重復(fù)洗3次。(3)加入擴增延伸探針和標記探針，50 ℃震蕩反應(yīng)1 h后放在磁力架上1 min，吸取棄去上清液；用洗滌液洗2次。(4)加入鏈霉親和素-藻紅蛋白，50 ℃震蕩反應(yīng)30 min。(5)洗滌孵育3次，于Luminex 閱讀儀上讀取數(shù)據(jù)，得出檢測結(jié)果。

1.2.2化療藥物敏感性檢測 采用ATP腫瘤化療敏感性檢測(ATP-TCA)試劑盒(湖州海創(chuàng)生物科技有限公司)檢測胃癌細胞對氟尿嘧啶(5-FU)、順鉑(DDP)、奧沙利鉑(OX)、紫杉醇(PTX)及多西他賽(DOC)的體外化療敏感性。主要操作流程包括：(1)新鮮的胃癌標本取材后放入一次性的培養(yǎng)皿中，浸泡液及75%乙醇順次浸泡并吹打1～2 min，取離心細胞加入含青霉素200 U/mL和鏈霉素200 U/mL的培養(yǎng)基中浸泡25 min后吸去浸泡液。(2)將前述處理后胃癌組織剪碎成糊狀，加入含混合消化酶的培養(yǎng)基，2 h后于200目篩網(wǎng)過濾獲得單細胞懸液，洗滌后臺盼藍染色進行活細胞計數(shù)。(3)將待測藥物加入96孔培養(yǎng)板。所用藥物及100%藥物測試濃度(test drug concentration，TDC)參考藥物在人體內(nèi)的血漿濃度設(shè)定為： 5-FU 25.0 μg/mL、DDP 3.8 μg/mL、OX 5.0 μg/mL、PTX 3.6 μg/mL、DOC 3.7 μg/mL，聯(lián)合用藥的每個藥物濃度與單藥濃度相同[8-9]。每個藥物設(shè)200%、100%、50%、25%、12.5% 5個TDC，每個TDC 2個平行孔，并設(shè)2排(8孔)無藥孔作對照，一排為無藥對照(M0)，一排為空白對照(M1)；僅200 μL完全培養(yǎng)基，作為檢測本底值。(4)接種腫瘤細胞，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)5 d后，每孔加入50 μL熒光素按試劑盒說明書操作測定熒光值。

1.2.3結(jié)果參數(shù)及敏感性判定標準 腫瘤相關(guān)基因mRNA表達由Luminex 閱讀儀直接給出檢測值。127例患者檢測值取中位數(shù)為界值，小于或等于中位數(shù)測值為低，大于中位數(shù)測值為高?；熋舾行訟TP-TCA法檢測結(jié)果由所測定的熒光值計算，計算指標包括腫瘤生長抑制率(tumor growth inhibition rate，TGI)、化療敏感指數(shù)(chemosensitivity index，CSI)、IC50及IC90。各指標按下式計算：TGI=(1-藥物處理孔熒光均值/無藥對照孔熒光均值)×100%。CSI=500-各TDC的抑制率之和，其值越小表示該化療藥物對腫瘤細胞的抑制率高。IC50：抑制50%腫瘤細胞生長的TDC。IC90：抑制90%腫瘤細胞生長的TDC?；熕幬锩舾行砸罁?jù)各化療藥物TDC、CSI、IC50及IC90分為：敏感，IC50≤25%TDC；輕度敏感，IC90≤100%TDC且IC50>25%TDC，或CSI≤300；耐藥，IC90>100%TDC且IC50>25%TDC且CSI>300。

2 結(jié) 果

2.1患者化療藥物相關(guān)基因檢測及化療藥物體外敏感性檢測結(jié)果 127例患者TYMS、ERCC1、BRCA1、TUBB3共4種化療相關(guān)基因mRNA表達中位測值(最值)分別為： 0.137(0.088，0.218)、0.614(0.475，0.727)、0.066(0.047，0.096)、0.068(0.038，0.126)。體外化療反應(yīng)性測定5-Fu、DDP、OX、PTX、DOX共5種化療藥物的中位CSI分別為：316(276，351)、316(284，358)、322(289，367)、197(124，257)、265(166，326)。不同化療藥物具有的化療敏感性患者例數(shù)為(按：敏感、輕度敏感、不敏感順序)：5-Fu 10、37、80例，DDP 5、40、82例，OX 4、37、86例，PTX 64、44、19例，DOC 43、39、45例。

2.2患者臨床病理特征與化療相關(guān)基因mRNA測值相關(guān)性 病理特征與化療相關(guān)基因測值相關(guān)性分析顯示胃下部腫瘤與ERCC1高表達、Bormann Ⅰ型患者與TUBB3高表達有關(guān)(P<0.05)，且腫瘤平均徑線大于5 cm與 TYMS高表達有關(guān)(P<0.01)，見表1。

表1 患者臨床病理特征與化療相關(guān)基因檢測

續(xù)表1 患者臨床病理特征與化療相關(guān)基因檢測

a:P<0.05;b:P<0.01

2.3患者臨床病理特征與CSI相關(guān)性 比較127例患者臨床病理特征與CSI相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)年齡大于或等于60歲與OX低CSI、胃上部腫瘤與OX低CSI、胃中部腫瘤與DOC低CSI及N分期2～3期與PTX低CSI有關(guān)(P<0.05)，見表2。

表2 患者臨床病理特征與CSI的相關(guān)性

續(xù)表2 患者臨床病理特征與CSI的相關(guān)性

a:P<0.05

2.4化療藥物相關(guān)基因與CSI、化療藥物敏感性的相關(guān)性 Pearson積矩相關(guān)系數(shù)檢驗化療藥物相關(guān)基因mRNA表達水平與對應(yīng)藥物CSI值的相關(guān)性，結(jié)果顯示TYMS與5-FU、ERCC1與DDP/OX、BRCA1與DDP/OX、BRCA1與PTX/DOC、TUBB3與PTX/DOC相互間均未表現(xiàn)出相關(guān)性(P=0.846、0.917/0.994、0.107/0.522、0.100/0.092、0.816/0.504)。進一步將mRNA檢測值按低表達與高表達進行二分類，采用Spearman等級相關(guān)分析行mRNA表達值與相應(yīng)藥物的CSI分析同樣顯示二者間未表現(xiàn)出相關(guān)性(P=0.989、0.800/0.876、0.180/0.633、0.425/0.306、0.810/0.792)。按前述比較分別將TYMS、ERCC1、BRCA、TUBB3基因mRNA檢測值與相應(yīng)化療藥物敏感性(敏感與輕度敏感、耐藥)行相關(guān)性分析亦顯示其之間無顯著相關(guān)性(P=0.925、0.838/0.889、0.087/0.614、0.603/0.204、0.452/0.588)。相應(yīng)地將不同基因mRNA檢測值作二分類處理與對應(yīng)化療敏感性行相關(guān)性分析顯示二者之間同樣不具有顯著相關(guān)性(P=0.620、0.975/0.904、0.260/0.810、0.372/0.588、0.645/0.465)，見表3。

表3 患者化療藥物相關(guān)基因mRNA表達與化療敏感性關(guān)系(n)

a:包含敏感及輕度敏感;-：無數(shù)據(jù)

3 討 論

對接受根治性手術(shù)切除的進展期胃癌患者，目前的觀點認為除原發(fā)腫瘤切除外應(yīng)聯(lián)合D2站淋巴結(jié)清掃并選擇性應(yīng)用術(shù)后系統(tǒng)性化療。經(jīng)術(shù)后系統(tǒng)性化療較單純手術(shù)提高了患者的整體預(yù)后[8]。

5-Fu類聯(lián)合鉑類是術(shù)后系統(tǒng)性化療推薦的一線用藥方案，文獻報道其有效率在30%～50%，而加用PTX類的3藥方案有效性可以達到50%以上[9-10]。鑒于3藥方案有更大不良反應(yīng)，指南中并未將其作為常規(guī)推薦。不同胃癌患者基因、蛋白表達、臨床病理特征等多個維度的異質(zhì)性，導(dǎo)致了其對化療藥物、靶向治療藥物的反應(yīng)差異巨大[3]。目前對化療相關(guān)基因檢測的研究已經(jīng)取得了一定進展，但研究尚未取得一致結(jié)論。TYMS作用于DNA合成過程，是5-Fu抑制腫瘤生長作用靶點之一。體外研究顯示TYMS表達水平與5-Fu類(5-Fu、卡培他濱、替吉奧等)藥物化療敏感性呈負相關(guān)[4]。本研究發(fā)現(xiàn)TYMS表達水平與5-Fu類藥物敏感性并無明顯相關(guān)性。這樣的結(jié)果體現(xiàn)了胃癌分子病理上的異質(zhì)性，TYMS表達影響5-Fu化療敏感性可能與腫瘤基因型及不同信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與有關(guān)，其有待進一步基因及分子層面的研究來闡明。ROGOZA等[11]研究顯示TYMS表達水平與患者無病生存期呈正相關(guān)，且其在Lauren腸型、男性患者、胃中部及下部腫瘤患者中高表達。既往文獻就ERCC1、BRCA1及TUBB3基因與胃癌化療藥物敏感性關(guān)系的研究結(jié)論較為一致。ERCC1是核苷酸外切修復(fù)家族的成員，參與DNA損傷修復(fù)過程。多項研究發(fā)現(xiàn)胃癌當中ERCC1表達水平與鉑類藥物化療敏感性之間呈負相關(guān)[5,12]。近年對ERCC1及ERCC2的研究多集中在單基因多態(tài)性上，并發(fā)現(xiàn)特定基因型與化療應(yīng)答率低有關(guān)，但其臨床價值尚需大樣本量研究佐證。BRCA1是鉑類藥物所致DNA損傷的修復(fù)基因。其高表達與鉑類藥物的耐藥有關(guān)。TUBB3基因編碼的TUBB3則是抗微管藥物的主要作用靶點，其陽性表達與預(yù)后呈現(xiàn)負相關(guān)。

研究中腫瘤平均徑線大于5 cm、胃下部腫瘤及Bormann Ⅰ型患者可能分別對5-Fu類、鉑類及紫衫類藥物不敏感。但鑒于本研究化療藥物相關(guān)基因與化療敏感性未表現(xiàn)出相關(guān)性，上述病理特征與化療藥物敏感性關(guān)系尚需結(jié)合生存期隨訪最終確定。韓杰等[13]研究發(fā)現(xiàn)消化道腫瘤患者年齡大于或等于65歲對5-Fu及OX不敏感，而OX、DDP、5-Fu及PTX對低分化腺癌有更好的敏感性。進一步的研究計劃納入更多患者臨床資料并對其長期生存狀況進行隨訪，以評估化療藥物的敏感性與預(yù)后的關(guān)系。