金屬螯合親和層析技術(shù)及其應(yīng)用

李淑娟

摘要:固定化金屬螯合親和層析是一種有效的生物分子分離純化技術(shù),它具有配基簡(jiǎn)單、吸附量大、分離條件溫和、通用強(qiáng)等特點(diǎn)。因此,其在蛋白質(zhì)純化、復(fù)性和空間定位以及酶的固定化和金屬離子清除等方面具有廣泛的應(yīng)用。

關(guān)鍵詞:固定化金屬螯合親和層析;純化;應(yīng)用

固定化金屬螯合親和層析(Immobilized Metal-Chelated Affinity Chromato-graphy,IMAC)是一種親和純化技術(shù),它是由 Porath于1975年首次提出并用于吸附牛血清蛋白[1],至今用IMAC已成功分離純化出數(shù)百種生物大分子。該法是基于蛋白質(zhì)表面的一些氨基酸殘基與固定化金屬離子的親和力不同而對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離純化。它因配基簡(jiǎn)單、吸附量大、分離條件溫和、通用強(qiáng)等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用。隨著研究的進(jìn)一步深入,IMAC的新應(yīng)用也不斷地被發(fā)現(xiàn)。

1金屬螯合親和層析作用原理

固定化金屬螯合親和層析基于蛋白質(zhì)表面氨基酸與固定化金屬離子的親和力不同對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。過(guò)渡態(tài)金屬離子能與電子供體氮、硫、氧等原子以配位鍵結(jié)合,金屬離子上剩余的空軌道是電子供體的配位點(diǎn),在溶液中被水分子或陰離子占據(jù)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)表面氨基酸殘基與金屬離子的結(jié)合力較強(qiáng)時(shí),氨基酸殘基的供電原子將取代與金屬離子結(jié)合的水分子或陰離子,與金屬離子形成復(fù)合物,從而使蛋白質(zhì)分子結(jié)合在固相介質(zhì)表面。氨基酸中的α-氨基和α-羧基,以及某些氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)含有孤對(duì)電子的活性原子都能參與螯合反應(yīng),由于蛋白質(zhì)表面這些氨基酸的種類、數(shù)量、位置和空間構(gòu)象不同,因而與金屬配基的親和力大小不同,從而可選擇性地加以分離純化[2]。

2金屬螯合親和層析技術(shù)的應(yīng)用

2.1金屬螯合親和層析用于生物分離純化

IMAC在生物分子純化方面具有很多優(yōu)點(diǎn):(1)結(jié)合力強(qiáng),蛋白結(jié)合容量大,可用于工業(yè)生產(chǎn),如采用IMAC吸附介質(zhì)的擴(kuò)張床吸附(EBA)技術(shù)可從哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)粗提物中一步分離純化溶解性目標(biāo)蛋白;(2)洗脫條件溫和,再生后配體恢復(fù)完全,一種IMAC樹(shù)脂可再生幾百次而不改變其層析特性;(3)價(jià)格便宜;(4)可通過(guò)改裝各種金屬離子,引入目標(biāo)蛋白質(zhì)最適宜的金屬離子進(jìn)行不同蛋白質(zhì)的純化。鑒于上述特點(diǎn),IMAC不僅適用于某些蛋白質(zhì)、酶、氨基酸及肽的分離純化,也適用于可逆螯合金屬離子的核苷酸、激素、抗體等物質(zhì)的分離和純化。

目前,基因工程重組蛋白純化技術(shù)已經(jīng)成熟,常通過(guò)DNA重組技術(shù)對(duì)蛋白進(jìn)行標(biāo)記,該方法在重組蛋白質(zhì)表達(dá)過(guò)程中巧妙地將標(biāo)簽(常為6×His尾巴)直接連接到蛋白質(zhì)的N-末端或C-末端,這種基因工程蛋白與裂解液中的其他蛋白質(zhì)相比,對(duì)金屬離子有更高的特異性,在分離純化后再用化學(xué)法或酶法將尾巴切掉。這種方法目前已經(jīng)成為基因工程下游技術(shù)中對(duì)融合蛋白純化最常用的方法。國(guó)外公司已推出商品化試劑盒,美國(guó)Qiagen公司提供的QIAexpress系統(tǒng)就是較為經(jīng)典的一種。該系統(tǒng)利用的pQE系列載體不僅有6個(gè)His編碼序列還含有強(qiáng)啟動(dòng)子和多克隆位點(diǎn)等組成,可將目的基因在宿主細(xì)胞中高效表達(dá)。表達(dá)后的產(chǎn)物可直接用金屬螯合親和層析進(jìn)行分離,有時(shí)可實(shí)現(xiàn)一步純化。金屬螯合親和層析過(guò)程既可以在常規(guī)的非變性條件下進(jìn)行純化,還可以用于變性條件下(6mol/L鹽酸胍或8 mol/L尿素)純化,這對(duì)以包涵體形式存在的重組蛋白尤為有利。

2.2金屬螯合親和層析用于蛋白質(zhì)的復(fù)性

在基因工程技術(shù)中,表達(dá)的重組蛋白多以包涵體形式存在,蛋白質(zhì)經(jīng)常會(huì)錯(cuò)誤折疊而損失活性,這一難題長(zhǎng)久以來(lái)都沒(méi)有得到很好的解決。高濃度的變性劑可以溶解包涵體,然后控制變性劑除去的速度,有時(shí)需要添加適當(dāng)?shù)难趸?還原試劑,蛋白質(zhì)可以逐步折疊復(fù)性。通常使用的復(fù)性方法有三種,分別是稀釋復(fù)性,透析復(fù)性和層析復(fù)性。其中稀釋復(fù)性和透析復(fù)性過(guò)程中會(huì)有大量無(wú)活性蛋白質(zhì)聚集體形成,而金屬螯合親和層析復(fù)性中,蛋白質(zhì)能可逆吸附在固相介質(zhì)上,可避免伸展的多肽分子之間形成聚集體。在高濃度變性劑存在的情況下,組氨酸尾仍舊具有吸附在金屬螯合親和層析介質(zhì)上的能力,所以可在IMAC介質(zhì)上同時(shí)實(shí)現(xiàn)復(fù)性與純化[3]。蛋白質(zhì)吸附在IMAC介質(zhì)上后,先逐步降低變性劑的濃度,使蛋白質(zhì)折疊,然后提高咪唑濃度把折疊后的蛋白質(zhì)洗脫出來(lái)。對(duì)于TNF蛋白,使用IMAC 獲得了90%的復(fù)性收率[4]。

2.3金屬螯合親和層析用于蛋白質(zhì)的分析

金屬螯合親和層析可用于蛋白質(zhì)的分析鑒定。Jiang等通過(guò)金屬螯合親和層析結(jié)合金屬離子親和毛細(xì)管電泳技術(shù)(IMACE)對(duì)糖基化導(dǎo)致α-胰凝乳蛋白酶結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行了研究,證明糖基化作用產(chǎn)生兩個(gè)截然不同的蛋白質(zhì),他們對(duì)金屬離子的親和性完全相反[5]。

IMAC還可用于磷酸化蛋白分析。蛋白質(zhì)的磷酸化和去磷酸化是生命體代謝調(diào)控的重要機(jī)制,已發(fā)現(xiàn)IMAC能鑒定磷酸化的蛋白,尤其是Fe3-IMAC已被用來(lái)選擇性純化和濃縮磷酸化的蛋白和多肽[6]。

IMAC與重組技術(shù)相結(jié)合可以使帶六聚組氨酸的蛋白質(zhì)固定在基質(zhì)上,從而為研究蛋白質(zhì)的相互作用開(kāi)辟了新的途徑。Celia等[7]用Ni2+負(fù)載的金屬螯合脂質(zhì)定向膜捕獲組氨酸標(biāo)記的MHC分子,再通過(guò)表面等離子體共振技術(shù)(Surface pasmon resonance)考察它們對(duì)T細(xì)胞受體的結(jié)合。錨定蛋白質(zhì)的NTA/組氨酸標(biāo)記體系也可被用來(lái)通過(guò)原子力顯微鏡測(cè)量受體-配體在單分子水平上的結(jié)合力[8]。

2.4金屬螯合親和層析技術(shù)在其他領(lǐng)域的應(yīng)用

過(guò)渡態(tài)金屬離子和蛋白質(zhì)結(jié)合的特性也成功應(yīng)用在蛋白質(zhì)芯片領(lǐng)域。Zhu等[9]提到了將帶有6個(gè)組氨酸的蛋白質(zhì)固定于鍍鎳的玻璃板上,得到了比常規(guī)醛處理表面更高質(zhì)量的蛋白質(zhì)芯片。在酵母蛋白質(zhì)組學(xué)研究中,通過(guò)克隆5800個(gè)開(kāi)放閱讀框,相應(yīng)的蛋白質(zhì)純化后固定于鍍鎳板上可以篩選能與磷脂相互作用的蛋白質(zhì)。使用這種技術(shù)鑒定了許多新的可與磷脂相互作用的蛋白質(zhì)。

在固定化酶研究方面,受IMAC的啟發(fā),蛋白質(zhì)的某些結(jié)構(gòu)域可以“位點(diǎn)特異”的固定在固相載體表面,比隨機(jī)位點(diǎn)固定增加了被固定蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性并較好的保持了其空間結(jié)構(gòu),比如固定化酶時(shí)可提高酶的半壽期,多次重復(fù)使用酶活力亦無(wú)明顯損失[10]。

綜上所述,金屬螯合親和層析是一種重要的生物大分子分離純化技術(shù),IMAC的應(yīng)用將不僅局限于蛋白質(zhì)的分離純化,其原理還將在蛋白質(zhì)芯片、生物分子間相互作用、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究、蛋白質(zhì)的電化學(xué)檢測(cè)等方面得到應(yīng)用,從而帶動(dòng)相關(guān)領(lǐng)域研究的不斷發(fā)展。

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