豬偽狂犬病病毒的分離鑒定

韓　偉　丁伯良　王英珍　張　莉

摘要:從天津市郊縣某豬場(chǎng)發(fā)病仔豬腦中分離到一株病毒。該病毒接種雞胚絨毛尿囊膜有白色的痘斑出現(xiàn),接種PK-15和BHK-21細(xì)胞出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變,毒價(jià)(TCID50)為10-6/mL,且能被PRV陽(yáng)性血清中和;將病毒給家兔注射后出現(xiàn)典型的偽狂犬病癥狀并導(dǎo)致死亡。通過(guò)上述試驗(yàn)結(jié)果證明,該分離毒株為偽狂犬病毒。

關(guān)鍵詞:豬;偽狂犬病毒;分離;鑒定

中圖分類號(hào):S858.28文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:ADOI編碼:10.3969/j.issn.1006-6500.2009.03.002

Isolation and Identification of Swine Pseudorabies Virus

HAN Wei,DING Bo-liang,WANG Ying-zhen,ZHANG Li

(Tianjin Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science,Tianjin 300112,China)

Abstract:One virus was isolated from brain organ of diseased pig which came from a pig farm in Tianjin. After inoculating the virus,the white spots could be seen in chick embryo chorioallantoic membrane, and typical cytopathogenic effect(CPE)appeared in PK-15 and BHK-21 cells. TCID50 of the virus was 10-6/mL.The virus could be neutralized by standard positive serum of pseudorabies virus. After injecting the virus, rabbits showed typical pseudorabies clinical symptom and died. By the above experiment results, the isolated virus was identified as PRV.

Key words: pig;pseudorabies virus;isolation;identification

偽狂犬病(Pseudorabies,PR)是由偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV) 引起的一種高度接觸性、急性傳染病。該病毒可引起多種家畜和野生動(dòng)物發(fā)病,豬是該病原的傳播者和自然宿主。臨床表現(xiàn)為新生仔豬發(fā)熱、腹瀉和神經(jīng)癥狀;母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、木乃伊胎、弱仔等繁殖障礙癥[1,2]。本病流行已給養(yǎng)豬生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,嚴(yán)重影響了養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。近年來(lái),天津地區(qū)豬場(chǎng)也時(shí)有該病的發(fā)生,筆者從天津某發(fā)病豬群分離到一株病毒,經(jīng)試驗(yàn)鑒定為豬偽狂犬病病毒。

1材料和方法

1.1材 料

病料:腦組織采自天津郊縣某豬場(chǎng)發(fā)病仔豬。

細(xì)胞與培養(yǎng)基:PK-15、BHK-21細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存并提供;MEM培養(yǎng)基購(gòu)自GIBCO公司;新生牛血清購(gòu)自北京民海生物公司。

雞胚及試驗(yàn)動(dòng)物:種蛋購(gòu)自天津市某種雞場(chǎng),在本室孵化至10日齡后使用,試驗(yàn)用兔購(gòu)自天津西青某養(yǎng)殖場(chǎng)。

PRV標(biāo)準(zhǔn)毒株及陽(yáng)性血清:PRV閩A株由本實(shí)驗(yàn)室保存,PRV陽(yáng)性血清由本實(shí)驗(yàn)室制備。

PCR引物:按文獻(xiàn)[3]的引物設(shè)計(jì)合成,預(yù)期產(chǎn)物178 bp。

PRV( gE)U3:4655'ATGGGCATCGCCGACTACCT3'

PRV( gE)L3:6425'CCACCGCCACAAAGAACACG 3'

1.2方 法

1.2.1病毒分離[4,5]取病仔豬腦加入5倍量Hanks液(pH7.0,內(nèi)含青、鏈霉素各1 000 U/mL),研磨成勻槳,4 ℃過(guò)夜處理后4 000 r/min離心30 min,取上清液接種PK-15和BHK-21細(xì)胞,37 ℃作用1 h,期間每隔20 min搖晃一次,作用完畢棄去接種物,加入含有2%新生牛血清的MEM維持液,并設(shè)空白對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照(PRV閩A株)。每日觀察2次,觀察5 d,當(dāng)接種細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變(CPE),并達(dá)到80%以上病變時(shí)收獲傳代,分離病毒株并連續(xù)傳至F7代,以適應(yīng)細(xì)胞生長(zhǎng)。

1.2.2毒價(jià)測(cè)定[6]取分離病毒株的F7代毒株作10倍系列稀釋(10-1～10-10),接種于已長(zhǎng)成單層的PK-15細(xì)胞96孔細(xì)胞板,每個(gè)稀釋度接種8孔,每孔接種0.1 mL,第11、12 列為2%新生牛血清的MEM維持液做空白對(duì)照。連續(xù)觀察7 d,記錄各個(gè)梯度的病變數(shù),按Reed-Muench 法計(jì)算分離毒株的病毒半數(shù)細(xì)胞感染量(TCID50)。

1.2.3中和試驗(yàn)[6]用固定病毒稀釋血清法。將PRV陽(yáng)性血清分別進(jìn)行2倍、3倍、5倍稀釋,再加入等量體積并稀釋至200個(gè)TCID50分離毒株,37 ℃作用1 h,每個(gè)稀釋度做4次重復(fù),分別接種于已長(zhǎng)成單層的PK-15細(xì)胞板,設(shè)維持液空白對(duì)照和PRV閩A株陽(yáng)性對(duì)照,連續(xù)觀察5 d,記錄各個(gè)稀釋度的細(xì)胞病變數(shù)。

1.2.4雞胚絨毛尿囊膜接種[6]將上述的分離毒株培養(yǎng)物接種于3枚10日齡雞胚絨毛尿囊膜,每枚接種0.2 mL,并同時(shí)設(shè)同劑量的2%新生牛血清的MEM維持液接種雞胚作為對(duì)照,37 ℃孵化144 h,每日照蛋2次。棄去24 h死亡的雞胚,觀察24 ~144 h死亡和未死亡的雞胚絨毛尿囊膜是否有痘斑形成。

1.2.5PCR鑒定按文獻(xiàn)[3] 應(yīng)用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,最后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,觀察PCR擴(kuò)增結(jié)果。

1.2.6動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[7]取分離病毒株的F7代毒株接種3只家兔頸部皮下,每只注射1 mL,空白對(duì)照家兔接種同劑量的MEM維持液,兩個(gè)試驗(yàn)組分開(kāi)飼養(yǎng)14 d,每天觀察家兔的采食、體溫、精神狀態(tài)等情況。

2結(jié)果與分析

2.1病毒分離

病料接種PK-15細(xì)胞后,F2代觀察到CPE。接種細(xì)胞后48 h鏡檢,可見(jiàn)細(xì)胞拉長(zhǎng)、變圓,為特征性病變,至72 h可見(jiàn)細(xì)胞脫落,參見(jiàn)圖1,2。其分離毒株在BHK-21細(xì)胞傳代,病變?yōu)榧?xì)胞拉長(zhǎng)、變圓、形成巨細(xì)胞,參見(jiàn)圖3,4。其細(xì)胞病變同PRV閩A株的病變一致。

2.2病毒毒價(jià)測(cè)定

分離毒株的TCID50為10-6/mL。

2.3中和試驗(yàn)

PRV陽(yáng)性血清與分離毒株中和的結(jié)果見(jiàn)表1。表1表明,陽(yáng)性血清稀釋2倍、3倍時(shí)沒(méi)有出現(xiàn)細(xì)胞病變,陽(yáng)性血清5倍稀釋時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞病變。PRV閩A陽(yáng)性對(duì)照株均未出現(xiàn)細(xì)胞病變,結(jié)果表明,已知PRV陽(yáng)性血清能中和分離毒株與PRV閩A株在細(xì)胞上的病變,但存在一些差異。

2.4雞胚絨毛尿囊膜接種

分離株接種后144 h,雞胚均未死亡,4 ℃凍胚4 h后觀察病變,可見(jiàn)雞胚絨毛尿囊膜水腫、增厚并有白色的痘斑,對(duì)照雞胚絨毛尿囊膜無(wú)異常病變(圖5)。

2.5PCR鑒定

分離毒擴(kuò)增出預(yù)期的PCR產(chǎn)物,PCR檢測(cè)陽(yáng)性(圖6)。

2.6動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果

接種分離的病毒懸液的家兔,注射后3 d表現(xiàn)為奇癢,用嘴啃咬注射部位,使注射部位被毛脫落,皮膚受損,繼而死亡。而注射MEM維持液的對(duì)照家兔無(wú)異常變化。

3討 論

(1)本試驗(yàn)通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)分離病毒、雞胚絨毛尿囊膜接種、動(dòng)物接種試驗(yàn)、中和試驗(yàn)和PCR鑒定,證明該病毒為豬偽狂犬病毒,將新分離的病毒命名為TJ-1株。

(2)PRV為皰疹病毒屬病毒,能夠在雞胚絨毛尿囊膜上形成明顯的痘斑,家兔攻毒后出現(xiàn)典型的瘙癢癥狀,這兩種方法操作簡(jiǎn)便,結(jié)果容易分辨,對(duì)于沒(méi)有細(xì)胞培養(yǎng)條件的實(shí)驗(yàn)室可以作為一種有效的初步鑒定方法。

(3)偽狂犬病只有在仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀,而母豬繁殖障礙的臨床表現(xiàn)又與豬瘟、細(xì)小病毒、乙腦和豬呼吸與繁殖障礙綜合征癥狀類似時(shí)發(fā)生,鑒別診斷比較困難,通過(guò)實(shí)驗(yàn)室的病原分離可以做出正確的診斷。在國(guó)內(nèi)應(yīng)推行PRV基因缺失疫苗免疫預(yù)防,再進(jìn)行相應(yīng)的鑒別診斷淘汰陽(yáng)性豬,凈化豬群,進(jìn)而根除偽狂犬病,提高我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的水平。

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